一種雞常見食源性細(xì)菌四重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞常見食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及使用方法，試劑盒包含了熒光PCR反應(yīng)液以及產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和空腸彎曲桿菌的標(biāo)準(zhǔn)品，其中熒光PCR反應(yīng)液含有TaqDNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTPs、四對細(xì)菌的特異性引物和相應(yīng)的四種熒光探針。本發(fā)明運(yùn)用四重?zé)晒釶CR，能快速、準(zhǔn)確地檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7和空腸彎曲桿菌4種雞攜帶的主要食源性病原菌，可用于細(xì)菌的鑒定、疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【專利說明】—種雞常見食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雞常見食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，還涉及一種雞常見食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒的使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌0157:H7和空腸彎曲桿菌是雞攜帶的4種最常見的食源性致病細(xì)菌，它們不僅嚴(yán)重危害我國養(yǎng)禽業(yè)，而且通過食品污染感染人類，給人類健康造成威脅。
[0003]產(chǎn)氣莢膜梭菌為人畜共患病病原，也是食源性病原菌。雞群為產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要宿主之一，產(chǎn)氣莢膜梭菌在雞體內(nèi)為條件性致病菌，可引起雞壞死性腸炎，也有很多帶菌不發(fā)病的情況。人類誤食該菌污染的雞肉制品等，可引起食物中毒。產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起人食物中毒和氣腫疽的主要病原體。
[0004]沙門氏菌是一種常見的人畜共患病病原，該菌不僅能引起雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒等禽類疾病，危害養(yǎng)禽業(yè)，還能夠感染人類，引起胃腸炎、傷寒、敗血癥及腸外灶性感染等多種疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，沙門氏菌引起的食物中毒常列世界各國細(xì)菌性食物中毒榜首，我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。其中沙門氏菌感染禽是經(jīng)食物鏈傳染給人類的一個重要中介。
[0005]大腸桿菌0157:H7感染是一種食源性疾病，該菌可從雞肉、牛肉、奶牛或奶制品、蔬菜、飲料及水中分離到，其中雞群也是該菌的宿主之一。該菌為一種腸道出血性大腸桿菌，是食物中毒的原因之一。感染者通常發(fā)生出血性腹瀉，尤其在年輕兒童和年長者中，有時導(dǎo)致腎衰竭。世界各地多次爆發(fā) 大腸桿菌0157:H7感染，嚴(yán)重危害了公共衛(wèi)生安全。
[0006]空腸彎曲菌是一種食源性人畜共患病病原菌，其中家禽特別是雞群為空腸彎曲桿菌的主要宿主之一,通常成年雞感染空腸彎曲桿菌無明顯癥狀,然而食入空腸彎曲桿菌污染的雞肉制品等，極易引起人類感染，導(dǎo)致急性腸胃炎，隨后還可以引起自身免疫性并發(fā)癥，如格巴氏綜合征和關(guān)節(jié)炎。空腸彎曲菌也是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要原因之
O
[0007]雞群是以上4種細(xì)菌的主要宿主之一，然而這些細(xì)菌通常被雞攜帶卻未表現(xiàn)出對雞的致病性，或無明顯的病變，容易被被養(yǎng)殖者忽視，但是這些病原菌一旦污染雞肉等食品，則會引起食品安全問題。世界各國已對食品安全高度重視，對雞肉制品等食品中微生物攜帶提出了明確的要求，從養(yǎng)殖開始控制與清除這些食源性細(xì)菌是避免食品污染的關(guān)鍵。因此迫切需要一種可同時快速、準(zhǔn)確地檢測雞群或雞肉制品中多種食源性致病菌的檢測方法。目前實(shí)驗(yàn)室的診斷方法主要是依靠細(xì)菌的分離鑒定，但是該方法檢測時間長、操作繁瑣，也難以大批量進(jìn)行。目前也有針對單個病原建立的PCR等檢測方法，但是尚未有能系統(tǒng)檢測雞或雞肉制品中多種食源性致病菌的方法與標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)時熒光PCR快速、高效、敏感性好、特異性強(qiáng)，而且可以同時進(jìn)行多種病原菌的檢測，已成為病原菌檢測的一種重要的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是在于提供了一種雞常見食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，該試劑盒由熒光PCR反應(yīng)液、陽性對照(產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)品、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品、大腸桿菌0157:H7標(biāo)準(zhǔn)品和空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)品)以及陰性對照品組成。以往在家禽中檢測病原菌多通過細(xì)菌的分離鑒定或運(yùn)用針對單個菌的PCR檢測，本檢測試劑盒針對雞源最常見的4種食源性細(xì)菌，設(shè)計(jì)并篩選出互不干擾的4對檢測引物與4條探針，4種雞主要食源性細(xì)菌檢測在一個反應(yīng)中完成，更為高效，且敏感性好，特異性強(qiáng)，檢測下限達(dá)到lOcfu。
[0009]本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種雞常見食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒的使用方法，方法簡單，快速，所有檢測步驟可在2個小時內(nèi)完成。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0011]一種雞常見食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，含有以下成分:
[0012]熒光PCR反應(yīng)液:Taq DNA聚合酶、不含Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTPs、產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌0157:H7和空腸彎曲桿菌這4種細(xì)菌的特異性引物和相應(yīng)的4種熒光探針。試劑盒中包含4對引物和4條探針序列如下:
[0013]表I特異性引物序列表
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種雞常見食源性細(xì)菌四重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，該試劑盒包括:熒光PCR反應(yīng)液、陽性對照，四對細(xì)菌的特異性引物:CPO1、CP02、SEO1、SE02、ECO 1、EC02、CJO1、CJ02和四種熒光探針:CPP、SEP、ECP、CJP ； 所述的熒光PCR反應(yīng)液為:rTaq DNA聚合酶、不含Mg2+的10XPCR反應(yīng)緩沖液、25mMMg2+ 和 IOmM dNTPs ； 所述的陽性對照為:產(chǎn)氣莢膜梭菌；沙門氏菌；大腸桿菌0157:H7和空腸彎曲桿菌的標(biāo)準(zhǔn)品或產(chǎn)氣莢膜梭菌基因陽性質(zhì)粒；沙門氏菌基因陽性質(zhì)粒；大腸桿菌0157:H7rfbB基因陽性質(zhì)粒和空腸彎曲噶桿菌ccoN基因陽性質(zhì)粒； 所述的特異性引物為:
2.權(quán)利要求1所述試劑盒的使用方法，具體如下: 1)樣品的處理與DNA模板的提取: 使用試劑盒提取DNA模板，取5 μ I作為待測樣品，每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照； 2)反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù): 反應(yīng)體系如下:
【文檔編號】C12Q1/68GK103436626SQ201310417980
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】張騰飛, 王紅琳, 羅玲, 張蓉蓉, 羅青平, 溫國元, 邵華斌 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所