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      一種針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法

      文檔序號:518271閱讀:1286來源:國知局
      一種針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法,包括以下步驟:微量樣本總RNA提取;針對真核生物樣本取樣;微量RNA的擴增富集:采用SMART技術(shù)對微量RNA進(jìn)行的相關(guān)富集對提取的微量總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及相應(yīng)的擴增富集;構(gòu)建cDNA?Illumina-solexa測序文庫;在富集生成的cDNA層面上進(jìn)行片段化后使用Illumina?HiSeq?TM2000進(jìn)行高通量測序。本發(fā)明方法所需最低起始的樣本核酸量可低至10ng,避免了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組高通量測序所需大量樣本核酸起始量的要求,能有效應(yīng)用于微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序,尤其對無法獲得大樣本量的稀有樣本及特殊樣本具有很高的應(yīng)用前景。
      【專利說明】一種針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和分子生物學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法及其應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002]轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)指特定組織或細(xì)胞在某一環(huán)境或生理條件下所轉(zhuǎn)錄表達(dá)的所有RNA的總和,既包括編碼蛋白的mRNA,也包括了各種非編碼RNA,是連接基因組遺傳信息與蛋白質(zhì)組生物功能的紐帶。轉(zhuǎn)錄組研究作為后基因組時代的重要組學(xué)研究,其不僅為研究基因表達(dá)及調(diào)控提供了重要的手段和方法,同時也為發(fā)掘功能基因提供了重要路徑,是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點。
      [0003]大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展已有20多年,從最初的差別雜交(differentialhybridization)、mRNA 差異顯不(mRNA differential display)、抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization)等技術(shù)到當(dāng)前DNA芯片、基因表達(dá)系列分析(Serial Analysis of Ge ne Expression)等技術(shù)的廣泛應(yīng)用,轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)得到了長足進(jìn)步。而近年來,隨著新一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展,在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq, RNA sequencing)技術(shù)已漸成為大規(guī)模研究轉(zhuǎn)錄組的一種新的且更為有效的方法,并顛覆了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的思維方式。
      [0004]目前,轉(zhuǎn)錄組高通量測序(RNA-Seq)對樣本的起始RNA量要求較高,一般都至少需要微克級(μ g)的RNA,對無法達(dá)到最小要求量的樣本是不能進(jìn)行進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建和測序。但是,在許多情況下,如在生殖發(fā)育生物學(xué),干細(xì)胞,癌癥,考古學(xué),臨床診斷等多種研究中,都無法獲得這樣數(shù)量的總RNA。因為上述研究均涉及微量且稀有的樣本,無法滿足目前轉(zhuǎn)錄組高通量測序的基本RNA量的要求。由于對起始RNA量要求較高,這無形中阻礙了轉(zhuǎn)錄組高通量測序這項新技術(shù)在不同研究領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。
      [0005]因此,本領(lǐng)域迫切需要在傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組高通量測序的基礎(chǔ)上建立一種針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有微量樣本難以滿足轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)的要求的問題,提供一種針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法,旨在解決微量樣本及稀有樣本無法應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)的困難。
      [0007]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
      [0008]一種針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法,其特征在于,包括以下步驟:
      [0009]a.微量樣本總RNA提取;針對真核生物樣本取樣;
      [0010]b.微量RNA的擴增 富集:采用SMART技術(shù)對微量RNA進(jìn)行的相關(guān)富集對提取的微量總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及相應(yīng)的擴增富集;
      [0011]C.構(gòu)建cDNA Illumina-solexa測序文庫:在富集生成的cDNA層面上進(jìn)行片段化后使用Illumina HiSeq ?2000進(jìn)行高通量測序。
      [0012]本發(fā)明針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法,在實際檢測中,可細(xì)化為以下步驟:
      [0013]a.微量樣本總RNA提取:利用市售的RNeasy Micro Kit (Qiagen, Germany)試劑盒對微量樣本的總RNA進(jìn)行提取。微量樣本其RNA總含量不得低于IOpg.[0014]本發(fā)明只針對真核生物樣本,不針對原核生物樣本。本發(fā)明提取總RNA的試劑盒專門選用了針對微量樣本提取的試劑盒,以保證最大限度的提取效果。經(jīng)比較市售的相關(guān)試劑盒,RNeasy Micro Kit (Qiagen, Germany)試劑盒效果較好。
      [0015]b.微量 RNA 的擴增富集:利用市售的 SMARTer PCR cDNA synthesis kit(Clontech, Japan)試劑盒對提取的微量總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及相應(yīng)的擴增富集。采用了SMART技術(shù)對提取的微量RNA進(jìn)行了相關(guān)的擴增富集,以達(dá)到進(jìn)一步測序建庫的要求。實施步驟參照SMARTer PCR cDNA synthesis kit (Clontech, Japan)試劑盒說明書并稍加該進(jìn),具體如下:
      [0016](I)第一鏈cDNA的合成:提取的總RNA (不低于IOpg)與1.5μ I SMARTII寡核苷酸(12μΜ)和1.5μ I cDNA Synthesis引物(12 μ Μ)混合,并用ddH20補足體系至10 μ I。在熱循環(huán)儀上70°C孵育2min,然后在室溫下加入5Χ第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mMTris-HCl, Ph8.3 ;375mmol/L KCl ;30mmol/LMgCl2) 4 μ 1,dNTP (IOmM) I μ 1,RNaseInhibiter (40U/ μ I) 0.5 μ I, Prime Script 反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μ I) I μ I,并用 ddH20 補足總體系至20 μ I。42°C孵育60min,然后加2μ 10.5mol/L EDTA終止反應(yīng)。
      [0017](2)長距離PCR (LD-PCR)優(yōu)化擴增合成第二鏈cDNA:取2 μ I第一鏈反應(yīng)混合物,加入 50 X advantage PCR buffer 10 μ 1、dNTP (IOmM) 2 μ 1、SMART PCR 弓丨物(12 μ Μ) 2 μ 1、50Xadvantage polymerase mix聚合酶2 μ I,并用ddH20補足體系至100 μ I。以此反應(yīng)體系配置二管反應(yīng)液,分別標(biāo)記為Α、Β兩管。然后按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng):95°C預(yù)變性Imin后,95°C 15sec、65°C 30sec、68°C 6min,共進(jìn)行28個循環(huán)。當(dāng)反應(yīng)至第15個循環(huán)時,取出A管反應(yīng)液至4°C保存,同時也在B管中取出15 μ I反應(yīng)產(chǎn)物至4°C保存,接著讓B管繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)。然后分別在第17、21、2`4個循環(huán)時,從B管中轉(zhuǎn)移15μ I反應(yīng)產(chǎn)物至4°C保存。當(dāng)反應(yīng)完畢后,用電泳分析B管分別在第15、17、21、24、28個循環(huán)時的反應(yīng)產(chǎn)物,以確定擴增合成的最優(yōu)循環(huán)數(shù)。最后取進(jìn)行15個循環(huán)后4°C保存的A管反應(yīng)液,繼續(xù)反應(yīng)至確定的最優(yōu)循環(huán)數(shù)。
      [0018]c.構(gòu)建 cDNA Illumina-solexa 測序文庫,使用 Illumina HiSeq ?2000 進(jìn)行高通
      量測序。
      [0019]本發(fā)明中cDNA Illumina-solexa測序文庫的構(gòu)建在傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組cDNAIllumina-solexa測序文庫構(gòu)建的流程基礎(chǔ)上有所改進(jìn),與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組cDNAIllumina-solexa測序文庫的構(gòu)建有所不同的是,傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組cDNA Illumina-solexa測序文庫先在RNA層面把純化的RNA進(jìn)行片段化,然后再進(jìn)行后續(xù)操作,而在本方法是在富集生成的cDNA層面上進(jìn)行片段化后,再進(jìn)行后續(xù)操作,這樣的改進(jìn)是適應(yīng)于步驟b中采用SMART技術(shù)對微量RNA進(jìn)行的相關(guān)富集,有利于微量RNA的轉(zhuǎn)錄組測序建庫。本方法步驟c的具體流程如下:
      [0020](l)cDNA 片段化:利用 Covaris E210 儀器(Covaris,USA)對經(jīng) SMART 技術(shù)擴增富集的cDNA進(jìn)行片段化,片段長度設(shè)置為200bp。然后瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證。(2) cDNA雙鏈末端修復(fù):利用 T4DNA poIymerase>Klenow DNA polymerase 和 T4PNK,將合成的 cDNA的末端補平并進(jìn)行磷酸化修飾(3) cDNA3’末端腺苷酸化:利用Klenow exo-polymerase對經(jīng)過cDNA進(jìn)行3'末端腺苷酸化,使其3'末端帶有一個突出的腺苷酸“A”,以便于隨后的接頭連接。(4)測序接頭連接:利用T4DNA Ligase將Illumina PE adapter接頭連接到經(jīng)腺苷酸化的cDNA片段的3 '末端。(5)瓊脂糖電泳分離及片段回收:通過2%的瓊脂糖凝膠電泳分離加有接頭的cDNA片段,回收凝膠中大小為200bp±25bp的cDNA片段。(6)cDNA片段擴增構(gòu)建測序文庫:利用引物PCR Primer PEL O和PCR Primer ΡΕ2.0,以上述回收的cDNA片段(大小為200bp±25bp)為模板,進(jìn)行15個循環(huán)的PCR擴增以富集加有接頭的大小為 200bp±25bp 的 cDNA 片段。利用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Germany)對擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化。經(jīng) Agilent Techno1gies2IOOBioanalyzer (Agilent, USA)檢測合格后,作為測序的cDNA文庫;(7)使用Illumina HiSeq?2000進(jìn)行高通量測序。
      [0021 ] 本發(fā)明的有益效果是:利用SMART技術(shù)對微量樣本中的RNA進(jìn)行有效擴增富集,克服了現(xiàn)有微量樣本難以滿足轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)要求的起始上樣量的問題,所需最低起始的樣本核酸量可低至10ng。同時在傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組cDNA Illumina-solexa測序文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)上有所改進(jìn),更加有利于微量樣本RNA的轉(zhuǎn)錄組測序建庫。該方法能廣泛有效應(yīng)用于微量樣本中的轉(zhuǎn)錄組高通量測序。
      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0022]圖1為本發(fā)明實施例的基本流程圖
      [0023]圖2SMART合成cDNA電泳檢測圖
      [0024]圖3a測序原始數(shù)據(jù)的堿基組成情況。X軸上,l-90bp代表readl的堿基位置,91-180bp代表read2的堿基位置。堿基組成平衡的情況下,A、T曲線基本重合,G、C曲線基本重合;圖3b測序原始數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量分布。橫坐標(biāo)是分布在read上堿基的位置,縱坐標(biāo)代表堿基的質(zhì)量。圖中的每個點表示某條read中相應(yīng)位置的堿基質(zhì)量值。從整體上看,如果低質(zhì)量(〈20)的堿基比例較低,說`明測序質(zhì)量比較好。
      [0025]圖4測序結(jié)果隨機性評估。X軸表示基因的相對位置,Y軸是比對上的reads數(shù),正常情況下reads應(yīng)該是均勻分布于基因上,否則說明此樣品的測序隨機性不好,會影響到后續(xù)的分析。
      【具體實施方式】
      [0026]以下通過具體實施例,并結(jié)合附圖,對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。但不限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段,所用原料均為市售商品。
      [0027]實施例:以牦牛卵母細(xì)胞作為微量樣本的代表進(jìn)行本發(fā)明的微量轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法
      [0028]牦牛卵母細(xì)胞微量總RNA提取
      [0029]使用市售的RNeasy Micro Kit (Qiagen, Germany)試劑盒對微量樣本的總RNA進(jìn)行提取,參照試劑盒說明稍作調(diào)整,具體步驟如下:[0030](I)選取20個成熟的牦牛MII期卵母細(xì)胞放入1.5ml離心管中,加入350 μ I裂解液RLT (使用前加入β-巰基乙醇,終濃度為1%),渦旋振蕩或用移液器混勻。
      [0031](2)將加入裂解液的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至過濾柱QIA shredder spin column上(過濾柱QIA shredder spin column 放在收集管中),12,OOOrpm(~13,400 X g)離心 2min,收集濾液。
      [0032](3)加入I倍體積(通常為350 μ I) 70%乙醇,用移液器混勻。
      [0033](4)將所有溶液及沉淀全部轉(zhuǎn)移至吸附柱RNeasy MinElute spin column上(吸附柱放在2m I RNase-Free的收集管中),輕柔地蓋上管蓋,12,OOOrpm(~13,400Xg)離心30-60sec,棄廢液,將吸附柱放回收集管中。
      [0034](5)向吸附柱中加入350 μ I去蛋白液RWl,12,OOOrpm (~13,400 Xg)離心30_60sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。
      [0035](6)向吸附柱中央加入80 μ I的DNase I工作液(取10 μ I DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管中,加入70 μ I試劑盒自帶RDD溶液,輕柔混勻配制成工作液),室溫方文置15min。
      [0036](7)向吸附柱中加入350 μ I去蛋白液RWl,12,OOOrpm (~13,400 Xg)離心30_60sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。
      [0037](8)向吸附柱中加入500μ I漂洗液鼎,室溫靜置2min,12,000rpm(~13,400Xg)離心30_60sec,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。并重復(fù)漂洗一次。
      [0038](9) 12,OOOrpm(~13,400Xg)離心2min,倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
      [0039](10)將吸附柱放入一個新的RN`ase-Free離心管(本試劑盒中已經(jīng)備有)中,向膜中央加入10μ1 RNase-Free dd H2O,輕柔地蓋上管蓋,室溫放置2min。12,OOOrpm(~
      13,400 Xg)離心lmin,所得溶液即為RNA溶液。
      [0040]RNA的質(zhì)量和含量通過使用Nanodrop ND-1000 (LabTech, USA)檢測吸光度260nm/280nm(A260/A280)比值進(jìn)行測定,RNA的完整性通過1.5%(w/v)凝膠電泳進(jìn)行檢測。
      [0041]微量RNA的擴增富集:利用市售的SMARTer PCR cDNA synthesiskit (Clontech, Japan)試劑盒對提取的微量總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及相應(yīng)的擴增富集。采用了SMART技術(shù)對提取的微量RNA進(jìn)行了相關(guān)的擴增富集,以達(dá)到進(jìn)一步測序建庫的要求。實施步驟參照SMARTer PCR cDNA synthesis kit (Clontech, Japan)試劑盒說明稍作調(diào)整,具體如下:
      [0042](I)第一鏈cDNA的合成:取提取的總RNA (IOpg)與1.5 μ I SMART 11寡核苷酸(12μΜ)和1.5μ I cDNA Synthesis引物(12 μ Μ)混合,并用ddH20補足體系至10 μ I。在熱循環(huán)儀上70°C孵育2min,然后在室溫下加入5Χ第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mMTris-HCl, Ph8.3 ;375mmol/L KCl ;30mmol/LMgCl2) 4 μ 1,dNTP (IOmM) I μ 1,RNaseInhibiter (40U/ μ I) 0.5 μ I, Prime Script 反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μ I) I μ I,并用 ddH20 補足總體系至20 μ I。42°C孵育60min,然后加2μ 10.5mol/L EDTA終止反應(yīng)。
      [0043](2)長距離PCR (LD-PCR)優(yōu)化擴增合成第二鏈cDNA:取2 μ I第一鏈反應(yīng)混合物,加入 50 X advantage PCR buffer 10 μ 1、dNTP (IOmM) 2 μ 1、SMART PCR 弓丨物(12 μ Μ) 2 μ 1、50Xadvantage polymerase mix聚合酶2 μ I,并用ddH20補足體系至100 μ I。以此反應(yīng)體系配置二管反應(yīng)液,分別標(biāo)記為A、B兩管。然后按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng):95°C預(yù)變性Imin后,95°C 15sec、65°C 30sec、68°C 6min,共進(jìn)行28個循環(huán)。當(dāng)反應(yīng)至第15個循環(huán)時,取出A管反應(yīng)液至4°C保存,同時也在B管中取出15 μ I反應(yīng)產(chǎn)物至4°C保存,接著讓B管繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)。然后分別在第17、21、24個循環(huán)時,從B管中轉(zhuǎn)移15μ I反應(yīng)產(chǎn)物至4°C保存。當(dāng)反應(yīng)完畢后,用電泳分析B管分別在第15、17、21、24、28個循環(huán)時的反應(yīng)產(chǎn)物,以確定擴增合成的最優(yōu)循環(huán)數(shù)。最后取進(jìn)行15個循環(huán)后4°C保存的A管反應(yīng)液,繼續(xù)反應(yīng)至確定的最優(yōu)循環(huán)數(shù)。
      [0044](3)對擴增富集的 cDNA 米用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Germany)進(jìn)行產(chǎn)物純化。然后通過1.2%(w/v)凝膠電泳對富集的cDNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(圖2)。一般來說,從真核生物總RNA合成的cDNA,在1.2%凝膠電泳檢測下應(yīng)該出現(xiàn)一個0.5kb_5kb之間中等大小的抹帶。
      [0045]cDNA片段化:利用Covaris E210儀器(Covaris, USA),按照儀器說明書將富集的全長cDNA剪切成200bp范圍的cDNA片段。然后瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證。
      [0046]cDNA雙鏈末端修復(fù):在RNase-free管中配制如下反應(yīng)體系(總體積100 μ I):Eluted cDNA50 μ l、10XEnd Repair Buffer 10 μ 1、25mM dNTP Mixl.6 μ 1、T4DNAPolymerase5 μ 1、Klenow DNA Polymerasel μ 1、T4PNK5 μ 1,加 ddH20 補足體系至 100 μ I。然后 20°C 反應(yīng) 30min。利用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Germany)進(jìn)行產(chǎn)物純化。
      [0047]cDNA3’末端腺苷酸化:在RNase-free管中配制如下反應(yīng)體系(總體積50μ I):Eluted cDNA32 μ 1、A- Tailing Buffer5 μ 1、ImM dATPIO μ I 及 Klenow exo(3,to5’ exominus) 3 μ I。將上述混合液置于37°C下孵育30min。然后利用QIAquick PCR PurificationKit (QIAGEN, Germany)進(jìn)行產(chǎn)物純化。
      [0048]測序接頭連接:在RNase-free管中配制如下反應(yīng)體系(總體積50 μ I):ElutedcDNA23μ I>2XRapid T4DNA Ligase Buffer25 μ 1> PE Adapter Oligo Mixl μ I 及 T4DNALigasel μ I。將上述混合液置于室溫下孵育15min。然后利用QIAquick PCR PurificationKit (QIAGEN, Germany)進(jìn)行產(chǎn)物純化。
      [0049]瓊脂糖電泳分離及片段回收:通過2%的瓊脂糖凝膠電泳分離加有接頭的cDNA片段,切割凝膠中大小為200bp±25bp的cDNA片段。然后利用QIAquick Gel ExtractionKit (QIAGEN, Germany)進(jìn)行膠回收。
      [0050]cDNA片段擴增構(gòu)建測序文庫:在200 μ I的PCR反應(yīng)管中配制如下混合液(總體積 50 μ I):5XPhusion BufferlO μ 1> PCR Primer PEL 01 μ 1、PCR Primer PE2.01 μ 1>25mM dNTP Mix0.5 μ 1、Phusion DNA Polymerase0.5 μ 1、ddH207 μ 1,再加入 30 μ I cDNA回收片段補足體系至50μ I。然后按如下條件進(jìn)行PCR擴增:a.30seconds at98°C變性30sec 后,98°C 10sec、65°C 30sec、72°C 30sec,共進(jìn)行 15 個循環(huán),最后 72°C再次延伸 5min。利用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Germany)對產(chǎn)物進(jìn)行純化。經(jīng) AgilentTechno1gies2IOOBioanalyzer (Agilent, USA)檢測合格后,作為 RNA-Seq 測序的 cDNA 文庫。
      [0051]使用Illumina HiSeq ?2000進(jìn)行高通量測序,對測序基本數(shù)據(jù)分析,結(jié)果如表1所示:[0052]表1.測序基本數(shù)據(jù)分析
      【權(quán)利要求】
      1.一種針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法,其特征在于,包括以下步驟: a.微量樣本總RNA提?。会槍φ婧松飿颖救?; b.微量RNA的擴增富集:采用SMART技術(shù)對微量RNA進(jìn)行的相關(guān)富集對提取的微量總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及相應(yīng)的擴增富集; c.構(gòu)建cDNAIllumina-solexa測序文庫:在富集生成的cDNA層面上進(jìn)行片段化后使用Illumina HiSeq ?2000進(jìn)行高通量測序。
      2.如權(quán)利要求1所述之針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法,其特征在于,步驟c采用如下的步驟:(I )cDNA片段化:利用Covaris E210儀器對經(jīng)SMART技術(shù)擴增富集的cDNA進(jìn)行片段化,片段長度設(shè)置為200bp,然后瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證;(2) cDNA雙鏈末端修復(fù):利用 T4DNA poIymerase>Klenow DNA polymerase 和 T4PNK,將合成的 cDNA 的末端補平并進(jìn)行磷酸化修飾;(3) cDNA3’末端腺苷酸化:利用Klenow exo-polymerase對經(jīng)過cDNA進(jìn)行3'末端腺苷酸化,使其3 '末端帶有一個突出的腺苷酸“A”,以便于隨后的接頭連接;(4)測序接頭連接:利用T4DNA Ligase將Illumina PE adapter接頭連接到經(jīng)腺苷酸化的cDNA片段的3 ’末端; (5)瓊脂糖電泳分離及片段回收:通過2%的瓊脂糖凝膠電泳分離加有接頭的cDNA片段,回收凝膠中大小為200bp±25bp的cDNA片段;(6) cDNA片段擴增構(gòu)建測序文庫:利用引物PCR Primer PEL O和PCR Primer ΡΕ2.0,以上述回收的大小為200bp±25bp的cDNA片段為模板,進(jìn)行15個循環(huán)的PCR擴增以富集加有接頭的大小為200bp±25bp的cDNA片段;利用QIAquick PCR Purification Kit對擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化,經(jīng)AgilentTechno1gies2IOOBioanalyzer 檢測合格后,作為測序的 cDNA 文庫;(7)使用 IlluminaHiSeq ?2000進(jìn)行高通量測序。
      3.如權(quán)利要求1所述之針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法,其特征在于,步驟a中提取總RNA的試劑盒選用市售RNeasy Micro Kit試劑盒。
      4.如權(quán)利要求1所述之針對微量樣本的轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法,其特征在于,步驟b中采用SMART技術(shù)對提取的微量RNA進(jìn)行了相關(guān)的擴增富集,以達(dá)到進(jìn)一步測序建庫的要求,具體實施步驟如下: Cl)第一鏈cDNA的合成:提取不低于IOpg的總RNA與1.5μ I SMART 11寡核苷酸(12μΜ)和1.5μ I cDNA Synthesis引物(12 μ Μ)混合,并用ddH20補足體系至10μ I;在熱循環(huán)儀上70°C孵育2min,然后在室溫下加入5Χ第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mMTris-HCl, Ph8.3 ;375mmol/L KCl ;30mmol/LMgCl2) 4 μ 1,dNTP (IOmM) I μ 1,RNaseInhibiter (40U/ μ I) 0.5 μ I, Prime Script 反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μ I) I μ I,并用 ddH20 補足總體系至20 μ I。42°C孵育60min,然后加2μ 10.5mol/L EDTA終止反應(yīng); (2)長距離PCR (LD-PCR)優(yōu)化擴增合成第二鏈cDNA:取2 μ I第一鏈反應(yīng)混合物,加Λ 50Xadvantage PCR buffer 10 μ 1、dNTP (IOmM) 2 μ I, SMART PCR 引物(12 μ Μ) 2 μ 1、50Xadvantage polymerase mix聚合酶2 μ I,并用ddH20補足體系至100 μ I。以此反應(yīng)體系配置二管反應(yīng)液,分別標(biāo)記為Α、Β兩管;然后按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng):95°C預(yù)變性Imin后,95°C 15sec、65°C 30sec、68°C 6min,共進(jìn)行28個循環(huán)。當(dāng)反應(yīng)至第15個循環(huán)時,取出A管反應(yīng)液至4°C保存,同時也在B管中取出15 μ I反應(yīng)產(chǎn)物至4°C保存,接著讓B管繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)。然后分別在第17、21、24個循環(huán)時,從B管中轉(zhuǎn)移15μ I反應(yīng)產(chǎn)物至4°C保存。當(dāng)反應(yīng)完畢后,用電泳分析B管分別在第15、17、21、24、28個循環(huán)時的反應(yīng)產(chǎn)物,以確定擴增合成的最優(yōu)循 環(huán)數(shù);最后取進(jìn)行15個循環(huán)后4°C保存的A管反應(yīng)液,繼續(xù)反應(yīng)至確定的最優(yōu)循環(huán)數(shù)。
      【文檔編號】C12Q1/68GK103667442SQ201310419151
      【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
      【發(fā)明者】蘭道亮, 李鍵, 熊顯榮, 陳亞冰, 胡敏, 蘇小珊, 鐘珍, 龔蔚華 申請人:西南民族大學(xué)
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