一種基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相及其制備方法，將細(xì)胞培養(yǎng)于微載體表面，經(jīng)多聚甲醛固定后，以微載體培養(yǎng)的細(xì)胞連同支撐其生長(zhǎng)的微載體作為固定相，濕法裝柱制備細(xì)胞色譜柱。應(yīng)用該方法制備固定相，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，且易于放大，該固定相具有細(xì)胞的特性，且保持了細(xì)胞原有的基本特性，藥物的受體也保持基本的空間結(jié)構(gòu)，應(yīng)用此法制備的細(xì)胞固定相可應(yīng)用于藥物篩選，提高藥物篩選的特異性。
【專利說(shuō)明】一種基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞膜色譜【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于微載體的細(xì)胞固定相及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞膜色譜法（CMC)是賀浪沖教授及其課題組于1996提出的一種生物親和色譜法，適用于中藥復(fù)雜體系中活性成分的篩選和分離，該方法是以硅膠為載體，將細(xì)胞膜與硅膠混合以后填充色譜柱，制備細(xì)胞膜色譜柱，結(jié)合高效液相色譜法篩選中藥材中的活性成分，藥物篩選的靶點(diǎn)為細(xì)胞膜上的受體，細(xì)胞膜色譜可以直接從中藥提取的復(fù)雜成分中識(shí)別出可以與藥物靶點(diǎn)作用的活性成分，是一種快速高效的篩選方法。然而，細(xì)胞膜色譜也存在一些缺陷，CMC法用的是自然生物膜（組織細(xì)胞），膜受體的密度較小，柱效較低，色譜柱壽命通常比較短，其分離的重現(xiàn)性和精密度得不到保證，自然生物膜存在有多種活性蛋白， 藥物可能與多種受體或通道蛋白結(jié)合，尚不能完全模擬體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境以及機(jī)體內(nèi)其他系統(tǒng)對(duì)藥物發(fā)揮藥效作用的影響。
[0003]微載體是指直徑是60-250 u m,能夠適用于貼壁型細(xì)胞生長(zhǎng)的微球，細(xì)胞培養(yǎng)最早使用離子交換凝膠作為載體，開(kāi)始于19世紀(jì)60年代末期，輕微攪動(dòng)即可懸浮在培養(yǎng)基中， 這種微載體帶有電荷，利于細(xì)胞貼附于載體上進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。載體處于懸浮狀態(tài)時(shí)，這樣既可大大增加細(xì)胞附著面積，又使細(xì)胞能與培養(yǎng)基充分接觸，進(jìn)而有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此能達(dá)到大量培養(yǎng)細(xì)胞的目的。微載體選擇應(yīng)以利于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，又無(wú)毒性為原則，然而離子交換凝膠作為載體存在許多缺點(diǎn)，如在一定程度上對(duì)細(xì)胞有毒性，對(duì)培養(yǎng)基的PH也有一定影響，因而近年來(lái)對(duì)載體進(jìn)行了改良，目前使用的載體主要有三種類型，它們都是帶有不同基團(tuán)的葡聚糖交聯(lián)而成的大分子，分別為I、II、111型Cytopore (Cytodexl、2、3)。由于微載體所帶有的基團(tuán)不同，就決定了它們之間的差異，I型載體是整個(gè)載體帶正電荷，II型僅表面帶有正電荷，III型不帶有電荷，其外表面被膠原層包裹，同樣適于細(xì)胞附著和生長(zhǎng)。 Cytopore微載體的大孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞向微球內(nèi)生長(zhǎng),小孔提供盡可能多的營(yíng)養(yǎng)成分。這種特點(diǎn)可幫助需要高循環(huán)率和高營(yíng)養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)。微載體比離子交換凝膠有明顯的優(yōu)點(diǎn)：① 大小和表面性質(zhì)更適宜細(xì)胞生長(zhǎng)；②具有一定的透明度，便于顯微鏡觀察無(wú)毒性，適于各類細(xì)胞附著生長(zhǎng)。
[0004]微載體培養(yǎng)技術(shù)是一種新興的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具有比表面積大，兼有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，放大容易，在微球表面培養(yǎng)細(xì)胞可以在較短時(shí)間內(nèi)得到大量的細(xì)胞，且細(xì)胞傳代只需要添加新的微載體，基本上可避免細(xì)胞在胰酶消化過(guò)程中受到的損傷， 因此微載體培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)是非常方便和有意義的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相及其制備方法，該固定相具有單一細(xì)胞的特性，且保持了細(xì)胞原有的基本特性，藥物的受體也保持基本的空間結(jié)構(gòu)。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0007]—種基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相，其特征在于，包括色譜柱，色譜柱中填充有作為色譜固定相的微載體細(xì)胞；所述的微載體細(xì)胞是將貼壁生長(zhǎng)于微載體表面的細(xì)胞，通過(guò)交聯(lián)鏈固定于微載體表面而得到的。
[0008]所述的微載體為葡聚糖凝膠制備的微載體Cytodex，所述的細(xì)胞為細(xì)胞膜上表達(dá)有能夠與藥物結(jié)合的受體的細(xì)胞，所述的交聯(lián)鏈?zhǔn)抢枚嗑奂兹┡c細(xì)胞中的蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)鏈，而固定于微載體表面。
[0009]所述微載體細(xì)胞通過(guò)濕法裝入色譜柱中。
[0010]一種基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相的制備方法，包括以下操作：
[0011]I)將微載體置于娃化的培養(yǎng)容器中，活化后滅菌,然后加入DMEM培養(yǎng)基過(guò)夜,臨用前吸棄原培養(yǎng)基，換37°C溫?zé)岬腄MEM培養(yǎng)基，制成微載體懸液；
[0012]2)將微載體懸液置入培養(yǎng)容器中，接種細(xì)胞懸液,然后加入DMEM培養(yǎng)液；將培養(yǎng)容器直立于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3h,去除旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)I~2min ;之后每I~2小時(shí)搖一次, 每12~24h更換一次培養(yǎng)基；
[0013]3)待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于微載體后，取處于對(duì)數(shù)期貼壁生長(zhǎng)于微載體上的細(xì)胞懸液， 加入質(zhì)量濃度4%的多聚甲醛溶液，室溫固定15~30min后，將細(xì)胞通過(guò)交聯(lián)鏈固定于微載體表明，得到微載體細(xì)胞；
[0014]4)將微載體細(xì)胞作為色譜固定相，濕法裝入色譜柱中，得到用于藥物篩選的細(xì)胞色譜柱。
[0015]所述的微載體為葡聚糖凝膠制備的微載體Cytodex,直徑為100~250 ii m,其活化為：將微載體置于硅化的容器中，用PH=7. 4的PBS沖液洗滌后，更換新鮮的PBS浸泡過(guò)夜；
[0016]活化后的滅菌為高壓滅菌，滅菌后換新鮮的培養(yǎng)基浸泡過(guò)夜，臨用前吸棄原培養(yǎng)基，換37°C溫?zé)岬腄MEM培養(yǎng)基，并調(diào)整微載體的含量為10~20mg/ml。
[0017]所述的DMEM培養(yǎng)基中還添加有0. 3mg/l的G418，以及體積濃度10%的FBS。
[0018]所述的容器的硅化為：將容器洗凈烘干，浸泡于質(zhì)量濃度5%的二甲基硅油-乙酸乙酯溶液中均勻硅化4h后，撈起空干，以超純水洗3次并浸泡過(guò)夜，烘干備用。
[0019]所述的細(xì)胞接種是將細(xì)胞密度為I X IO5~I X IO7個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，吸取2~ 5ml接種到已加入微載體懸液的培養(yǎng)瓶中，再加入10~15ml的DMEM培養(yǎng)基，終體積為15~ 20ml o
[0020]所述的多聚甲醛溶液是用PBS配制的，加入多聚甲醛溶液后，多聚甲醛與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)鏈，將貼壁生長(zhǎng)于微載體上的細(xì)胞固定于微載體表面。
[0021]所述的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相在篩選載體細(xì)胞能夠保留藥物中的應(yīng)用。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0023]本發(fā)明提供的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相及其制備方法，以貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞代替CMC法中的細(xì)胞膜，以微載體培養(yǎng)的細(xì)胞連同支撐其生長(zhǎng)的微載體作為固定相，免去了原來(lái)制備細(xì)胞膜和硅膠結(jié)合的過(guò)程，該固定相具有單一細(xì)胞的特性，且保持了細(xì)胞原有的基本特性，藥物的受體也保持基本的空間結(jié)構(gòu)。所制備的細(xì)胞固定相可以提高藥物篩選的特異性，對(duì)闡明藥物作用機(jī)理具有重要的意義；可應(yīng)用于篩選載體細(xì)胞能夠保留的藥物。
4[0024]本發(fā)明提供的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相及其制備方法，將細(xì)胞培養(yǎng)于微載體表面，利用微載體培養(yǎng)細(xì)胞，容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定化，比表面積較大，為細(xì)胞提供了適宜的生長(zhǎng)空間，放大容易；而且微載體適宜貼壁細(xì)胞在其表面的生長(zhǎng)，且透明便于在顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)。
[0025]本發(fā)明提供的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相及其制備方法，經(jīng)多聚甲醛固定后， 以微載體培養(yǎng)的細(xì)胞連同支撐其生長(zhǎng)的微載體作為固定相，濕法裝柱制備細(xì)胞色譜柱。固定后的細(xì)胞保持了正常細(xì)胞的基本特性和蛋白結(jié)構(gòu)，更能有效模擬體內(nèi)的環(huán)境。將固定后的細(xì)胞作為固定相填裝制備色譜柱可以更為深入的研究藥物與受體的相互作用。而且其操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，且易于放大。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖I顯微鏡下觀察細(xì)胞在Cytodex上的生長(zhǎng)狀態(tài)；其中A為空載體Cytodex，B為 FGFR4細(xì)胞；
[0027]圖2電鏡下觀察的細(xì)胞固定相；A為空載體Cytodex，B為FGFR4細(xì)胞；
[0028]圖3大黃素在固定化ECV304細(xì)胞色譜固定相上保留色譜圖；a為大黃素（空白微載體)，b為大黃素(長(zhǎng)有細(xì)胞的微載體)，c為甲醇(作為對(duì)照）；峰I為大黃素峰。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明提供的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相，包括色譜柱，色譜柱中填充有作為色譜固定相的微載體細(xì)胞；所述的微載體細(xì)胞是將貼壁生長(zhǎng)于微載體表面的細(xì)胞，通過(guò)交聯(lián)鏈固定于微載體表面而得到的。這樣以貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞代替CMC法中的細(xì)胞膜，以微載體培養(yǎng)的細(xì)胞連同支撐其生長(zhǎng)的微載體作為固定相，免去了原來(lái)制備細(xì)胞膜和硅膠結(jié)合的過(guò)程，該固定相具有單一細(xì)胞的特性，且保持了細(xì)胞原有的基本特性，藥物的受體也保持基本的空間結(jié)構(gòu)。應(yīng)用此法制備的細(xì)胞固定相可以提高藥物篩選的特異性，對(duì)闡明藥物作用機(jī)理具有重要的意義。
[0030]所提供的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相的制備方法，包括以下操作：
[0031]I)將微載體置于娃化的培養(yǎng)容器中，活化后滅菌,然后加入DMEM培養(yǎng)基過(guò)夜，臨用前吸棄原培養(yǎng)基，換37°C溫?zé)岬腄MEM培養(yǎng)基，制成微載體懸液；
[0032]2)將微載體懸液置入培養(yǎng)容器中，接種細(xì)胞懸液,然后加入DMEM培養(yǎng)液；將培養(yǎng)容器于直立于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3h,去除旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)I~2min ;之后每I~2小時(shí)搖一次，每12~24h更換一次培養(yǎng)基；
[0033]3)待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于微載體后，取處于對(duì)數(shù)期貼壁生長(zhǎng)于微載體上的細(xì)胞懸液， 加入質(zhì)量濃度4%的多聚甲醛溶液，室溫固定15~30min后，將細(xì)胞通過(guò)交聯(lián)鏈固定于微載體表明，得到微載體細(xì)胞；
[0034]4)將微載體細(xì)胞作為色譜固定相，濕法裝入色譜柱中，得到用于藥物篩選的細(xì)胞色譜柱。
[0035]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0036]實(shí)施例I[0037]基于微載體細(xì)胞的FGFR4細(xì)胞色譜柱的制備，包括以下操作：
[0038]1)微載體的處理
[0039]玻璃器皿的前處理：將所有用于微載體前處理使用的玻璃器皿洗凈烘干，浸泡于 5%的二甲基硅油-乙酸乙酯溶液中均勻硅化4h后，撈起空干，以超純水洗3次并浸泡過(guò)夜， 烘干備用。
[0040]微載體Cytodex的處理：稱取0. 2g微載體Cytodex置于娃化的燒杯中，用20mL無(wú)鈣鎂的PBS(PH=7. 4)洗滌2次，換新鮮的PBS浸泡過(guò)夜，高壓滅菌，吸棄PBS，換新鮮的DMEM 培養(yǎng)基(含0. 3mg/l的G418，10%的FBS)浸泡過(guò)夜，臨用前吸棄原培養(yǎng)基，換37°C溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基適量，并調(diào)整瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的含量為20mg/ml。
[0041]培養(yǎng)瓶表面的處理：將硅化好的培養(yǎng)瓶高壓滅菌后備用，臨用前用培養(yǎng)基潤(rùn)洗。
[0042]2)細(xì)胞接種
[0043]①將處理好的微載體懸液5mL加到處理好的培養(yǎng)瓶中。
[0044]②取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成纖維生長(zhǎng)因子受體（FGFR4)細(xì)胞，用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為I X IO5個(gè)/ml，吸取5ml接種到已加入微載體的培養(yǎng)瓶中，再加入15ml的培養(yǎng)基。
[0045]③將培養(yǎng)瓶直立于CO2培養(yǎng)箱中2h后,取出旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)Imin,之后每2小時(shí)搖一次， 每24h更換一次培養(yǎng)基。
[0046]3)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程觀察
[0047]在細(xì)胞微載體培養(yǎng)的過(guò)程中，進(jìn)行持續(xù)的、動(dòng)態(tài)的觀察，并且記錄細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的變化包括細(xì)胞形態(tài)，數(shù)量以及細(xì)胞移動(dòng)情況的變化。
[0048]顯微鏡下觀察細(xì)胞在Cytodex上的生長(zhǎng)狀態(tài)如圖I所示，可見(jiàn)看到細(xì)胞在Cytodex 上生長(zhǎng)良好。
[0049]4)微載體表面細(xì)胞的固定
[0050]取處于對(duì)數(shù)期貼壁生長(zhǎng)于微載體表面的FGFR4細(xì)胞，室溫固定15min，即得細(xì)胞固定相。
[0051]電鏡下觀察的細(xì)胞固定相如圖2所示，可以看到細(xì)胞均被固定在微載體的表面上。
[0052]5)色譜柱的制備
[0053]取固定好的微載體細(xì)胞作為色譜固定相，濕法裝入預(yù)先制備好的色譜柱中，即得 FGFR4細(xì)胞色譜柱。
[0054]實(shí)施例2
[0055]與實(shí)施例I不同之處在于，用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304)代替成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)受體（FGFR4)細(xì)胞，ECV304細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他操作按照實(shí)施例I制備ECV304 細(xì)胞色譜柱。
[0056]進(jìn)一步，用所制備的ECV304色譜柱分析大黃素在ECV304細(xì)胞色譜上的保留，具體如下：
[0057]大黃素對(duì)照品溶液的配制：取大黃素適量，加甲醇溶解并定容至10ml，得濃度為
0.5mg/ml o
[0058]流動(dòng)相：0.8%NaH2P04-0 . 9 74%Na2HP04 (20 : 80)，其中每 100ml 加 NaClO. 432g ；
6[0059]色譜柱：10mmX1mm ;
[0060]流速：0.2ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。
[0061]檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，其中a為大黃素（空白微載體)，b為大黃素(長(zhǎng)有細(xì)胞的微載體)，c為甲醇(作為對(duì)照）；峰I為大黃素峰?？梢钥吹剿苽涞腅CV304色譜柱能夠?qū)Υ簏S素具有一定的保留，從而在其洗脫后出現(xiàn)波峰。
[0062]上述檢測(cè)表明本發(fā)明所制備的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相，具有單一細(xì)胞的特性，且保持了細(xì)胞原有的基本特性，藥物的受體也保持基本的空間結(jié)構(gòu)?？梢詰?yīng)用于篩選載體細(xì)胞能夠保留的藥物。
【權(quán)利要求】
1.一種基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相，其特征在于，包括色譜柱，色譜柱中填充有作為色譜固定相的微載體細(xì)胞；所述的微載體細(xì)胞是將貼壁生長(zhǎng)于微載體表面的細(xì)胞，通過(guò)交聯(lián)鏈固定于微載體表面而得到的。
2.如權(quán)利要求1所述的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相，其特征在于，所述的微載體為葡聚糖凝膠制備的微載體Cytodex，所述的細(xì)胞為細(xì)胞膜上表達(dá)有能夠與藥物結(jié)合的受體的細(xì)胞，所述的交聯(lián)鏈?zhǔn)抢枚嗑奂兹┡c細(xì)胞中的蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)鏈，而固定于微載體表面。
3.如權(quán)利要求1所述的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相，其特征在于，所述微載體細(xì)胞通過(guò)濕法裝入色譜柱中。
4.一種基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相的制備方法，其特征在于，包括以下操作：1)將微載體置于硅化的培養(yǎng)容器中，活化后滅菌，然后加入DMEM培養(yǎng)基過(guò)夜，臨用前吸棄原培養(yǎng)基，換37°C溫?zé)岬腄MEM培養(yǎng)基，制成微載體懸液；2)將微載體懸液置入培養(yǎng)容器中，接種細(xì)胞懸液，然后加入DMEM培養(yǎng)液；將培養(yǎng)容器直立于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3h,去除旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)I~2min ;之后每I~2小時(shí)搖一次,每 12~24h更換一次培養(yǎng)基；3)待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于微載體后，取處于對(duì)數(shù)期貼壁生長(zhǎng)于微載體上的細(xì)胞懸液，加入質(zhì)量濃度4%的多聚甲醛溶液，室溫固定15~30min后，將細(xì)胞通過(guò)交聯(lián)鏈固定于微載體表明，得到微載體細(xì)胞；4)將微載體細(xì)胞作為色譜固定相，濕法裝入色譜柱中，得到用于藥物篩選的細(xì)胞色譜柱。
5.如權(quán)利要求4所述的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相的制備方法，其特征在于，所述的微載體為葡聚糖凝膠制備的微載體Cytodex，直徑為100~250 u m，其活化為：將微載體置于硅化的容器中，用PH=7. 4的PBS沖液洗滌后，更換新鮮的PBS浸泡過(guò)夜；活化后的滅菌為高壓滅菌，滅菌后換新鮮的培養(yǎng)基浸泡過(guò)夜，臨用前吸棄原培養(yǎng)基，換 37°C溫?zé)岬腄MEM培養(yǎng)基，并調(diào)整微載體的含量為10~20mg/ml。
6.如權(quán)利要求4或5所述的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相的制備方法，其特征在于，所述的DMEM培養(yǎng)基中還添加有0. 3mg/l的G418，以及體積濃度10%的FBS。
7.如權(quán)利要求4或5所述的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相的制備方法，其特征在于，所述的容器的硅化為：將容器洗凈烘干，浸泡于質(zhì)量濃度5%的二甲基硅油-乙酸乙酯溶液中均勻硅化4h后，撈起空干，以超純水洗3次并浸泡過(guò)夜，烘干備用。
8.如權(quán)利要求4所述的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相的制備方法，其特征在于，所述的細(xì)胞接種是將細(xì)胞密度為I X IO5~I X IO7個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，吸取2~5ml接種到已加入微載體懸液的培養(yǎng)瓶中，再加入10~15ml的DMEM培養(yǎng)基，終體積為15~20ml。
9.如權(quán)利要求4所述的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相的制備方法，其特征在于，所述的多聚甲醛溶液是用PBS配制的，加入多聚甲醛溶液后，多聚甲醛與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)鏈，將貼壁生長(zhǎng)于微載體上的細(xì)胞固定于微載體表面。
10.權(quán)利要求1所述的基于微載體細(xì)胞的細(xì)胞固定相在篩選載體細(xì)胞能夠保留藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK103525801SQ201310419338
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】王嗣岑, 賀浪沖, 黃靜, 張濤, 張 杰, 李西玲, 魏芬 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)