一種固定化好氧反硝化細(xì)菌的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化好氧反硝化細(xì)菌的制備方法，其步驟：1、絲瓜絡(luò)的預(yù)處理：取老熟的絲瓜剝?nèi)ネ馄?，除去?nèi)瓤，剪成一定體積的小長方體，放在沸水中煮沸，然后在水龍頭下洗滌，放在去離子水中浸泡，在烘箱中烘至恒重，于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?、好氧反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)及菌懸液的制備：挑選斜面保存的好氧反硝化細(xì)菌，加入到經(jīng)過高溫高壓滅菌的富集培養(yǎng)基中，得到菌液；3、以聚乙烯醇為載體，以絲瓜絡(luò)為支持物制備固定化好氧反硝化細(xì)菌。聚乙烯醇和絲瓜絡(luò)均來源廣泛，價(jià)格低廉，機(jī)械強(qiáng)度高，穩(wěn)定性好，提高固定化細(xì)菌的濃度，該方法工藝操作簡單，生產(chǎn)成本低，易于在工業(yè)上應(yīng)用。
【專利說明】一種固定化好氧反硝化細(xì)菌的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)和水處理領(lǐng)域，更具體涉及一種固定化好氧反硝化細(xì)菌的制備方法，適用于脫氮除磷等細(xì)菌的固定化。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，工業(yè)“三廢”排放量的增加，生活污水、醫(yī)藥污水、生活垃圾以及農(nóng)業(yè)大量施用化肥、農(nóng)藥導(dǎo)致水資源受到不同程度污染，其中硝酸鹽污染是水資源的主要污染類型之一。
[0003]生物反硝化是解決水體中硝態(tài)氮污染問題的主要方法之一，傳統(tǒng)的生物脫氮理論認(rèn)為細(xì)菌的反硝化作用是在缺氧或厭氧條件下進(jìn)行的，但好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)打破了此規(guī)律，其利用好氧反硝化酶使反硝化作用可以在有氧條件下進(jìn)行。隨著生物脫氮技術(shù)的不斷改進(jìn)、更新，固定化微生物脫氮技術(shù)日益受到廣泛關(guān)注。固定化好氧反硝化菌脫氮技術(shù)在一定程度上解決了好氧反硝化菌直接投放于工藝研究中存在的脫氮效率低，菌種易流失`，脫氮穩(wěn)定性差等問題。
[0004]目前主要使用的細(xì)菌固定化方法為包埋法，即將菌體包埋在各種多孔載體中，使菌體固定化。而最常用的包埋材料是海藻酸鈉和聚乙烯醇，海藻酸鈉這種天然高分子凝膠載體對微生物無毒性，傳質(zhì)性能好，但強(qiáng)度較低，聚乙烯醇作為有機(jī)合成高分子載體強(qiáng)度較高，化學(xué)穩(wěn)定性好，價(jià)格低廉，但傳質(zhì)性能較差，包埋后對細(xì)胞的活性有影響。因此，開發(fā)研制性能優(yōu)良的包埋載體材料仍是生物固定化技術(shù)的重要課題之一。
[0005]絲瓜絡(luò)，為葫蘆科一年生草本植物絲瓜的成熟果實(shí)中的維管束或者說絲瓜的枯老果實(shí)，其來源廣泛，作為一種生物親和性載體，它具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，可回收利用性，可再生性以及機(jī)械強(qiáng)度，表面粗糙多孔，比表面積大，適合作為固定化細(xì)菌的載體。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)用聚乙烯醇和絲瓜絡(luò)固定好氧反硝化細(xì)菌的專利發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對游離好氧反硝化細(xì)菌在實(shí)際污水處理工藝中菌體易被流水沖走，濃度易被稀釋，導(dǎo)致脫氮效率低，脫氮穩(wěn)定性差等問題，是在于提供了一種固定化好氧反硝化細(xì)菌的制備方法，采用聚乙烯醇和絲瓜絡(luò)，以聚乙烯醇和絲瓜絡(luò)為載體，制備固定化好氧反硝化細(xì)菌，聚乙烯醇和絲瓜絡(luò)均來源廣泛，價(jià)格低廉，機(jī)械強(qiáng)度高，穩(wěn)定性好，絲瓜絡(luò)表面多孔粗糙，可以改善聚乙烯醇的傳質(zhì)性能，聚乙烯醇則進(jìn)一步防止細(xì)菌的流失，提高固定化細(xì)菌的濃度；該方法工藝操作簡單，生產(chǎn)成本低，易于在工業(yè)上應(yīng)用。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]一種固定化好氧反硝化細(xì)菌的制備方法，其步驟是:
[0009]I)絲瓜絡(luò)的預(yù)處理:取老熟的絲瓜剝?nèi)ネ馄?，除去?nèi)瓤，剪成體積為
1.2cmX 1.2cmX0.7cm的小長方體，放在沸水中煮沸20~30min，然后在水龍頭下洗滌，放在去離子水中浸泡12~24h，在68 — 72°C烘箱中烘5~6h至恒重，于干燥器中貯存?zhèn)溆?。[0010]2)好氧反硝化細(xì)菌菌懸液的制備:
[0011]挑選I~2環(huán)斜面保存的好氧反硝化細(xì)菌(來源于實(shí)驗(yàn)室已篩選出的細(xì)菌，該菌已發(fā)表文章《人工濕地高效好氧反硝化菌的分離鑒定及反硝化特性研究》農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)2010，29(6): 1193-1198)，加入到經(jīng)過高溫高壓:121°C，105_110kPa滅菌的富集培養(yǎng)基中，在29 — 31°C下曝氣培養(yǎng)47 - 50h，得到菌液；將得到的菌液離心，棄去上清液，用
0.9%生理鹽水離心洗漆3~4次(6000r/min, IOmin),再用0.9%生理鹽水稀釋至體積為1500mL-1600mL (菌體:生理鹽水=1:40v/v)，混合均勻，4°C貯藏備用，最后得到細(xì)菌濃度為9X IO5~9X 107Cfu/mL的好氧反硝化細(xì)菌菌懸液。
[0012]所述的富集培養(yǎng)基組成如下:去離子水lOOOmL，KN032g, K2HPO4Ig, KH2PO4Ig,MgSO40.4g，檸檬酸鈉5g，微量鹽溶液2mL。
[0013]3)以聚乙烯醇為載體，以絲瓜絡(luò)為支持物制備固定化好氧反硝化細(xì)菌:
[0014]將30g聚乙烯醇加熱溶解于260mL溫度為60_80°C的去離子水中，冷卻至30_40°C后放置于室溫(20 - 25°C)下23 - 25h,同40mL細(xì)菌濃度為9X IO5~9X 107cfu/mL的好氧反硝細(xì)菌的菌懸液混合均勻，然后放入40粒已滅菌的絲瓜絡(luò)塊，待混合液充分浸入到絲瓜絡(luò)的縫隙中，用無菌鑷子將浸滿混合液的絲瓜絡(luò)轉(zhuǎn)移到飽和硼酸溶液中，于4°C冰箱中交聯(lián)固化12~24h，用無菌水洗滌2~3次后轉(zhuǎn)移至0.9%的生理鹽水中，于4°C冰箱中貯存?zhèn)溆?
[0015]本發(fā)明選擇以聚乙烯醇為載體，以絲瓜絡(luò)為支持物制備的固定化好氧反硝化細(xì)菌同顆粒狀的載體相比，更容易保存，分離，具有脫氮效率高，亞硝態(tài)氮累積量低，機(jī)械強(qiáng)度好，性質(zhì)穩(wěn)定，使用壽命長，重復(fù)利用性好，方法簡單，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。相關(guān)試驗(yàn)研究結(jié)果表明所制備的固定化好氧反硝 化細(xì)菌對硝態(tài)氮的去除率最高可達(dá)97.2%，并且無亞硝態(tài)氮的累積，在重復(fù)利用7批之后，仍具有良好的脫氮效果，對硝態(tài)氮的去除率為96.9%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為一種固定化好氧反硝化細(xì)菌去除硝態(tài)氮效果圖。
[0017]將固定化好氧反硝化細(xì)菌，菌量相同的游離好氧反硝化細(xì)菌以及未包埋好氧反硝化細(xì)菌的聚乙烯醇和絲瓜載體(即空白固定化載體)投入到等體積的液體培養(yǎng)基中，每隔12h米樣一次,測定硝態(tài)氮含量。
[0018]所述培養(yǎng)基組成如下去離子水lOOOmL, KN032g, K2HPO4Ig, KH2PO4Ig, MgSO40.4g，檸檬酸鈉5g，微量鹽溶液2mL。
[0019]圖2為一種固定化好氧反硝化細(xì)菌掃描電鏡觀察圖。
[0020]將固定化好氧反硝化細(xì)菌進(jìn)行預(yù)處理后送至測試部門進(jìn)行SEM電子掃描電鏡觀
察
[0021]圖3為一種固定化好氧反硝化細(xì)菌重復(fù)利用性效果圖。
[0022]將固定化好氧反硝化細(xì)菌進(jìn)行第一次反硝化性能測試后，再重復(fù)試驗(yàn)6次，每次反硝化試驗(yàn)結(jié)束后，測定硝態(tài)氮的含量。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1:[0024]一種固定化好氧反硝化細(xì)菌的制備方法，其步驟是:
[0025]I)絲瓜絡(luò)的預(yù)處理:取老熟的絲瓜剝?nèi)ネ馄?，除去?nèi)瓤，剪成體積為
1.2cmX 1.2cmX0.7cm的小長方體，放在沸水中煮沸20或23或26或28或30min，然后在水龍頭下洗滌，放在去離子水中浸泡12或14或17或19或22或24h，在68或69或70或71或72°C烘箱中烘5或6h至恒重，于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?br> [0026]2)好氧反硝化細(xì)菌的菌懸液的制備:
[0027]挑選I~2環(huán)斜面保存的好氧反硝化細(xì)菌，加入到經(jīng)過高溫高壓:121 °C，105-1 IOkPa滅菌的富集培養(yǎng)基中，在29或30或31 °C下曝氣培養(yǎng)47或48或49或50或51h，得到菌液；將得到的菌液離心，棄去上清液，用0.9%生理鹽水離心洗滌3或4次(6000r/min, IOmin),再用0.9%生理鹽水稀釋到一定體積，混合均勻，4°C貯藏備用；
[0028]所述的富集培養(yǎng)基組成如下:去離子水lOOOmL，KN032g, K2HPO4Ig, KH2PO4Ig,MgSO40.4g，檸檬酸鈉5g，微量鹽溶液2mL。
[0029]3)以聚乙烯醇為載體，以絲瓜絡(luò)為支持物制備固定化好氧反硝化細(xì)菌:
[0030]將30g聚乙烯醇加熱溶解于260mL溫度為60或65或70或75或80°C的去離子水中，冷卻至30或32或34或36或38或40°C后放置于室溫下23或24或25h，同40mL細(xì)菌濃度為9 X IO5~9X 107cfu/mL的好氧反硝細(xì)菌的菌懸液混合均勻，然后放入40粒已滅菌的絲瓜絡(luò)塊，待混合液充分浸入到絲瓜絡(luò)的縫隙中，用無菌鑷子將浸滿混合液的絲瓜絡(luò)轉(zhuǎn)移到飽和飽和硼酸溶液中，于4°C冰箱中交聯(lián)固化12或14或15或18或20或22或24h，用無菌水洗滌2或3次后轉(zhuǎn)移至0.9%的生理鹽水中，于4°C冰箱中貯存?zhèn)溆茫?br> [0031]4)將步驟3中的固定化好氧反硝化細(xì)菌，菌量相同的游離好氧反硝化細(xì)菌以及未包埋好氧反硝化細(xì)菌的聚乙烯醇和絲瓜絡(luò)載體(即空白固定化載體)分別放入步驟2所述的液體培養(yǎng)基中，每隔12h采樣一次，測定硝態(tài)氮含量?？瞻坠潭ɑd體，游離細(xì)菌、聚乙烯醇和絲瓜絡(luò)對硝態(tài)氮的最高去除率分別為8.7%，
[0032]61.3% 和 97.2% (圖1)。
[0033]實(shí)施例2:
[0034]一種固定化好氧反硝化細(xì)菌的制備方法，其步驟是:
[0035]將實(shí)施例1中步驟3制得的等量固定化好氧反硝化細(xì)菌分別置于0.0lmol.L'
0.1mol.L'Imol.L-1 的 HCl 和 NaOHUmol.L-1 的 NaCl、CaCl2、KH2PO4 等溶液中浸泡 24h,觀察固定化好氧反硝化細(xì)菌完好性及強(qiáng)度等的變化。并同公知的分別以海藻酸鈉(SA)，聚乙烯醇(PVA)，海藻酸鈉+聚乙烯醇(SA+PVA)為包埋材料的固定化小球的穩(wěn)定性能進(jìn)行對t匕，結(jié)果如表1所示，固定化好氧反硝化細(xì)菌在酸堿鹽溶液中具有更好的穩(wěn)定性。
[0036]表1固定化好氧反硝化細(xì)菌在酸、堿、鹽溶液中的穩(wěn)定性(溶液單位:mol.L-1)
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種固定化好氧反硝化細(xì)菌的制備方法，其步驟是: I)絲瓜絡(luò)的預(yù)處理:取老熟的絲瓜剝?nèi)ネ馄?，除去?nèi)瓤，剪成體積為1.2cmXl.2cmX0.7cm的小長方體，放在沸水中煮沸2(T30min，然后在水龍頭下洗滌，放在去離子水中浸泡12~24h，在68 — 72°C烘箱中烘5飛h至恒重，于干燥器中貯存?zhèn)溆茫? 好氧反硝化細(xì)菌菌懸液的制備: 挑選廣2環(huán)斜面保存的好氧反硝化細(xì)菌，加入到經(jīng)過高溫高壓:121°C，105-110kPa滅菌的富集培養(yǎng)基中，在29 - 31°C下曝氣培養(yǎng)47 - 50h，得到菌液；將得到的菌液離心，棄去上清液，用0.9%生理鹽水離心洗滌3~4次，再用0.9%生理鹽水稀釋至體積為1500mL-1600mL,混合均勻，4°C貯藏備用，最后得到細(xì)菌濃度為9 X IO5~9 X 107cfu/mL的好氧反硝化細(xì)菌菌懸液； 3)以聚乙烯醇為載體:以絲瓜絡(luò)為支持物制備固定化好氧反硝化細(xì)菌，將聚乙烯醇加熱溶解于260mL溫度為60-80°C的去離子水中，冷卻至30_40°C后放置于室溫下23 — 25h,同40mL細(xì)菌濃度為9X IO5~9X 107cfu/mL的好氧反硝細(xì)菌的菌懸液混合均勻，然后放入已滅菌的絲瓜絡(luò)塊，混合液浸入到絲瓜絡(luò)的縫隙中，用無菌鑷子將浸滿混合液的絲瓜絡(luò)轉(zhuǎn)移到飽和硼酸溶液中，于4°C冰箱中交聯(lián)固化12~24h，用無菌水洗滌2~3次后轉(zhuǎn)移至0.9%的生理鹽水中，于4°C冰箱中貯存?zhèn)溆茫? 所述的富集培養(yǎng)基組成如下:去離子水lOOOmL，KNO3 2 g，K2HPO4 I g，KH2PO4 I g，MgSO4 0.4 g，檸檬酸鈉5 g，微量鹽溶液2mL。
【文檔編號】C12N11/08GK103468667SQ201310423208
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】吳振斌, 張雪琪, 周巧紅, 賀鋒, 徐棟 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所