枯草芽孢桿菌菌株及利用該菌株生產γ-PGA的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于利用微生物生產γ-PGA【技術領域】，具體涉及一種生產γ-PGA的生產菌株及利用該菌株生產γ-PGA的生產方法。枯草芽孢桿菌HNCL1266菌株已保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，編號為CGMCC?No.7949。利用該菌株發(fā)酵生產γ-PGA的生產方法，包括先將該菌株接入種子培養(yǎng)基發(fā)酵，然后按比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，最好提取制備γ-PGA等步驟。利用本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌菌株生產γ-PGA，24小時積累γ-PGA量最高可達50g/L，與現(xiàn)有技術所采用的生產菌株相比，僅需在初始培養(yǎng)基中加入少量的泡敵，即可有效抑制泡沫的生成，避免發(fā)酵過程出現(xiàn)逃液，利于工業(yè)化生產的實現(xiàn)。
【專利說明】枯草芽孢桿菌菌株及利用該菌株生產Y-PGA的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于利用微生物生產Y-PGA【技術領域】,具體涉及一種生產Y-PGA的菌株及利用該菌株生產Y-PGA的方法。
【背景技術】
[0002]y -PGA, Y-聚谷氨酸是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通過Y-酰胺鍵結合形成的一種水溶性的高分子氨基酸聚合物，具有增稠、乳化、凝膠、成膜、保濕、無毒、可生物降解等性能，可廣泛應用于醫(yī)藥、農業(yè)、食品等領域，具有極大的開發(fā)價值和應用前景。
[0003]現(xiàn)有技術中，Y-PGA主要是利用芽孢桿菌屬類微生物如ifeciIicheniformisATCC9945a, Bacillus licheniformis P_104，Bacillus subtilis IF03335，Bacillussubtilis TAM-4, Bacillus subtilis F02-1等，以液體發(fā)酵方法來生產。但是現(xiàn)有菌株發(fā)酵生產Y-PGA存在周期長、效率低、成本高的缺陷，此外還有報道利用現(xiàn)有菌株生產Y-PGA過程中，在液體發(fā)酵階段會產生脂肽類生物表面活性劑的副產物(Qijim Wangjet a_L ，しo—producing lipopeptides and poly-Y-glutamic acid by solid-statefermentation of Bacillus subtilis using soybean and sweet potato residues andits biocontrol and fertilizer synergistic effects.Bioresource Technology,2008,99:3318 - 3323)，造成液體發(fā)酵過程中產生大量難以控制的泡沫，從而出現(xiàn)嚴重逃液和染菌的問題。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一株在液體發(fā)酵生產Y -PGA過程中不產生脂肽類生物表面活性劑副產物的生產菌株以及提供ー種利用該菌株生產Y-PGA的方法。
`[0005]本發(fā)明所采用的技術方案如下。
[0006]一種用于液體發(fā)酵生產Y-PGA的枯草芽孢桿菌，其命名為feci#心subtilisHNCL 1266，該菌株已于2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7949。
[0007]ー種利用上述菌株發(fā)酵生產Y -PGA的生產方法，包括如下步驟:
(1)將菌株feci#心subtilisHNCL 1266接入無菌種子培養(yǎng)基，好氧條件下30~40°C發(fā)酵培養(yǎng)5~20 h ;所述種子培養(yǎng)基組成為:葡萄糖10~50g/L,氮源I~10g/L,谷氨酸鈉I~20g/L,硫酸鎂0.1~10g/L,磷酸氫二鉀I~20g/L,用水配制,培養(yǎng)基pH 4~9 ；
(2)按I~10%的接種量將步驟(1)制備的菌種接入無菌發(fā)酵培養(yǎng)基，好氧條件下30~40°C發(fā)酵培養(yǎng)20~40 h ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖50~200g/L，氮源5~20g/L，谷氨酸鈉5~100g/L，氯化鈉0~50g/L，硫酸鎂I~20g/L，磷酸氫二鉀I~20g/L，用水配制，培養(yǎng)基pH 4~9 ;
(3)將步驟(2)發(fā)酵完成的菌液用于提取制備y-PGA。[0008]步驟(2)中按0.r0.5g/L的比例在滅菌前的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入泡敵。
[0009]步驟(1)和(2)中所述氮源選自酵母粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、尿素或無機銨鹽等。
[0010]步驟(1)和(2)中pH值調節(jié)通過本領域的常規(guī)方法來實現(xiàn)，如添加鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、氨水等無機酸或無機堿。
[0011]步驟(1)或(2)中所述無菌種子培養(yǎng)基或無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌條件為115~121°C, 15 ~30min。
[0012]利用本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌菌株生產Y -PGA，生產效率得到較高提升，經統(tǒng)計，該菌株在好氧條件下能高效地積累Y-PGA，最高達到50 g/L，周期24小吋。與現(xiàn)有技術所采用的菌株相比，主要的優(yōu)點還在于，僅需在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中加入少量的泡敵(0.1-0.5g/L)，即可有效抑制泡沫的生成，避免發(fā)酵過程出現(xiàn)逃液，利于エ業(yè)化生產的實現(xiàn)。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發(fā)明做進ー步的解釋說明。
[0014]實施例1
本發(fā)明提供了一種用于Y-PGA發(fā)酵生產的枯草芽孢桿菌，其命名為subtilis HNCL 1266，該菌株已于2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7949。
`[0015]為便于本領域技術人員更加方便的獲得本發(fā)明所提供的菌株，下面發(fā)明人對獲得本發(fā)明菌株的過程做一簡要說明`。
[0016]本發(fā)明所獲得的枯草芽孢桿菌A/s subtilis HNCL 1266由已篩選得到的Y-PGA生產菌株subtilis HDll (朱麗娟等，Y _聚谷氨酸高產菌株的鑒定及誘變選育，安徽農學通報，2012，18 (4): 8-10)，通過常壓室溫等離子體(ARTP)(參見中國專利2008200793821)誘變選育獲得。其主要誘變原理為:等離子體產生的活性粒子能夠破壞細胞結構也能夠穿過細胞壁到達細胞內，破壞基因和蛋白質的結構，從而導致大部分微生物死亡。但少數(shù)經過ARTP照射過的微生物會通過本身的自動修復系統(tǒng)修復存活，并在這一過程中產生基因突變，從而獲得突變菌株。
[0017]具體誘變選育過程中根據(jù)培養(yǎng)微生物目的所采用的培養(yǎng)基配方有:
保藏斜面培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂20g/L，pH7.0 ；
種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、谷氨酸鈉10g/L、磷酸氫二鉀2g/L、硫酸鎂
0.25g/L、pH7.0，裝液量 20ml/250ml ；
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L、酵母膏8g/L、谷氨酸鈉30g/L、磷酸氫二鉀2g/L、硫酸鎂 0.25g/L, pH7.0，裝液量 40ml/250ml。
[0018]誘變選育過程中根據(jù)培養(yǎng)目的所采用的微生物培養(yǎng)方法有:
菌種活化:取菌種ー環(huán)，接人新鮮斜面培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18h ；
種子培養(yǎng):取活化菌種ー環(huán)，接種種子培養(yǎng)基，37°C，200r/min，振蕩培養(yǎng)IOh ；
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):取Iml種子培養(yǎng)液接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，200r/min，振蕩培養(yǎng)
48h。[0019]誘變選育過程中采用常壓室溫等離子體(ARTP)具體誘變條件為:
參數(shù)_操作條件
【權利要求】
1.枯草芽孢桿菌HNCL1266,2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7949。
2.ー種利用權利要求1所述枯草芽孢桿菌HNCL 1266生產Y -PGA的方法，包括如下步驟: (1)將菌株feci#心subtilisHNCL 1266接入無菌種子培養(yǎng)基，好氧條件下30~40°C發(fā)酵培養(yǎng)5~20 h ;所述種子培養(yǎng)基組成為:葡萄糖10~50g/L,氮源I~10g/L,谷氨酸鈉I~20g/L,硫酸鎂0.1~10g/L,磷酸氫二鉀I~20g/L,用水配制,培養(yǎng)基pH 4~9 ； (2)按I~10%的接種量將步驟(1)制備的菌種接入無菌發(fā)酵培養(yǎng)基，好氧條件下30~40°C發(fā)酵培養(yǎng)20~40 h ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖50~200g/L，氮源5~20g/L，谷氨酸鈉5~100g/L，氯化鈉0~50g/L，硫酸鎂I~20g/L，磷酸氫二鉀I~20g/L，用水配制，培養(yǎng)基pH 4~9 ; (3)將步驟(2)發(fā)酵完成的菌液用于提取制備y-PGA。
3.如權利要求2所述生產Y-PGA的方法，其特征在于:步驟(2)中按0.l~0.5g/L的比例在滅菌前的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入泡敵。
【文檔編號】C12P13/02GK103497914SQ201310423779
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權日:2013年9月17日
【發(fā)明者】陳雙喜, 雷雪梅, 張樂樂, 杜沛, 朱麗娟, 張二超 申請人:河南大學