非人哺乳動物神經(jīng)精神疾病動物模型及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種非人哺乳動物的神經(jīng)精神疾病動物模型及其制備方法和用途。本發(fā)明的小鼠模型與人類的神經(jīng)精神疾病高度相似。基于該模型動物的神經(jīng)精神疾病藥物篩選平臺，可用于篩選新藥以及開發(fā)其他治療方法。
【專利說明】非人晡乳動物神經(jīng)精神疾病動物模型及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地說，本發(fā)明涉及一種非人哺乳動物的神經(jīng)精 神疾病動物模型及其制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 精神分裂癥（Schizophrenia)是一類最常見精神疾病，影響全世界人口的 0. 5%_1%，以基本個性改變，思維、情感和行為的分裂，精神活動與環(huán)境不協(xié)調(diào)為主要特征。 該病在男性中多發(fā)生于青春期晚期至25歲，在女性中25-35歲是高發(fā)期，自然病程多遷延， 多數(shù)呈復(fù)發(fā)和加重，慢性化和衰退的過程，且與其他精神疾病遺傳關(guān)聯(lián)性強，重疊率高，最 終結(jié)局約一半左右患者出現(xiàn)精神殘疾并伴隨1?自殺率。
[0003] 精神分裂癥是一種人類復(fù)雜疾病，盡管目前對其病因的認識尚不很明確，但個體 的易感素質(zhì)和外部環(huán)境的不良因素對疾病的發(fā)生發(fā)展的作用已被大家所共識。多項研 究表明，精神分裂癥是在基因與環(huán)境相互作用的基礎(chǔ)上發(fā)生的，但遺傳因素在精神分裂 癥的發(fā)生中具有重要作用，其遺傳度高達〇? 70?0.85(Picchioni，M.M.，andMurray，R. M. (2007). Schizophrenia. Bmj335, 91-95.)。但其遺傳方式不符合經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī) 律，具有多基因高異質(zhì)性遺傳特征（McGuffin，P.，and Owen, M. (1991).The molecular genetics of schizophrenia:an overview and forward view. European archives of psychiatry and clinical neuroscience240, 169-173.)。精神分裂癥的發(fā)生還與環(huán)境因 素有關(guān)，通常認為在個體具有遺傳易感性背景的基礎(chǔ)上，環(huán)境有害因素作用于機體可導(dǎo)致 疾病的發(fā)生。
[0004] 精神分裂癥的發(fā)病機制沒有統(tǒng)一定論，各種假說一直處于爭論與變化之中。目 前有4種學(xué)說：神經(jīng)遞質(zhì)紊亂學(xué)說、神經(jīng)發(fā)育障礙學(xué)說、神經(jīng)細胞膜學(xué)說和免疫系統(tǒng)障礙 學(xué)說，但是，迄今為止并無任何一種假說能夠十分恰當(dāng)?shù)仃U明精神分裂癥的發(fā)病機制并 被精神醫(yī)學(xué)界廣泛接受（Keshavan, M. S.，Tandon, R.，Boutros, N. N.，and Nasral lah, H. A. (2008) ? Schizophrenia, 〃just the facts〃：what we know in2008Part3:neurobiology. Schizophrenia researchl06, 89-107. )〇
[0005] 人類行為的基因控制和小鼠或其他動物模型的行為基因控制有相似性。比如，大 多數(shù)嚙齒類動物焦慮的形式和人類的突發(fā)焦慮癥類似；人類抑郁癥與嚙齒類動物行為表現(xiàn) 是壓力誘導(dǎo)的逃避減弱；模擬精神分裂癥嚙齒類動物模型可以表現(xiàn)為運動活動性增加、精 神興奮、緊張性刺激、社交退縮、及對多巴胺拮抗劑的應(yīng)答的抑制和驚反射中弱刺激的抑制 作用減弱。所以人類疾病的動物模型為人類深入了解和認識疾病提供了有力的工具。
[0006] 目前建立精神分裂癥的動物模型主要有四種方式，第一種發(fā)育造模，包括營養(yǎng)缺 乏、隔離飼養(yǎng)和免疫刺激等；第二種藥物誘導(dǎo)，包括各種類型的受體激動劑和拮抗劑，常用 的有苯環(huán)己哌啶（PCP)、MK801和可他命；第三種是基因修飾，包括基因敲除、基因敲入、轉(zhuǎn) 基因和突變；第四種是損毀造模，主要是損毀腹側(cè)海馬和前額葉（Jones，C. A.，Watson，D. J. , and Fone, K.C. (2011). Animal models of schizophrenia. British journal of pharmacology164, 1162-1194.) 〇
[0007] 目前已提出的精神分裂癥的重要候選基因包括G蛋白信號調(diào)節(jié)子4(RGS4)， dysbindin(DTNBPl)，神經(jīng)調(diào)節(jié)素 l(neuregulin_l，NRG1), G72,兒茶酌?-〇-甲基轉(zhuǎn)移酶 (C0MT)，精神分裂癥斷裂基因l(DISCl)和代謝型谷氨酸受體3(GRM3,也被稱為mGluR3)等。 然而，由于精神分裂癥等疾病的成因復(fù)雜，因此迄今為止，對所謂的"精神分裂癥的重要候 選基因"進行導(dǎo)入或敲除等操作，尚未獲得令人滿意的神經(jīng)精神疾病動物模型。
[0008] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)非人哺乳動物神經(jīng)精神疾病動物模型。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的就是提供一種非人哺乳動物的神經(jīng)精神疾病動物模型，及其制備方 法和用途。
[0010] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種非人哺乳動物的神經(jīng)精神疾病動物模型的制備方 法，該方法包括以下步驟：
[0011] ⑴提供非人哺乳動物的細胞，將所述細胞中的CRMP2基因失活，得到CRMP2基因 失活的細胞；
[0012] (2)利用步驟⑴中得到的CRMP2基因失活的細胞，制備得到CRMP2基因失活的神 經(jīng)精神疾病動物模型。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述將CRMP2基因失活包括基因剔除、基因中斷或基因插入。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述基因失活包括CRMP2基因不表達，或表達沒有活性的CRMP2 蛋白。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動物為嚙齒動物或靈長目動物，較佳地包括小鼠、 大鼠、兔、猴。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括：
[0017] (1)利用DNA同源重組技術(shù)，將所述CRMP2基因中的外顯子1至外顯子14中一個 或多個外顯子剔除或中斷，并任選地用篩選標(biāo)記替換，得到CRMP2基因失活的非人哺乳動 物細胞；
[0018] (2)利用步驟（1)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳動物細胞制備得到嵌合非 人哺乳動物；
[0019] (3)將步驟（2)中得到的嵌合非人哺乳動物和正常野生型非人哺乳動物交配繁 育，在后代中篩選獲得CRMP2基因失活的雜合子非人哺乳動物；
[0020] (4)通過將步驟（3)中得到的雜合子非人哺乳動物相互交配獲得CRMP2基因失活 的純合子非人哺乳動物，從而得到CRMP2基因失活的非人哺乳動物模型。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述CRMP2基因失活是通過缺失或敲除CRMP2的外顯子3而失 活。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的CRMP2基因失活是大腦特異性的CRMP2基因失活或全身 的CRMP2基因失活。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟（5):將CRMP2基因失活的純合子非人哺 乳動物與同一物種的神經(jīng)特異性敲除工具非人哺乳動物進行雜交，從而獲得大腦特異性的 CRMP2基因失活的非人哺乳動物動物模型。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動物是小鼠，并且在步驟（5)中把CRMP2flox/ flox小鼠與工具鼠Nestin-Cre交配，得到CRMP2flox/+ ;Nestin_Cre小鼠。再把 CRMP2flox/+ ;Nestin-Cre小鼠與CRMP2flox/flox小鼠交配，即得到在神經(jīng)前體細胞特異 性CRMP2基因的敲除小鼠簡稱cKO小鼠（即大腦特異性CRMP2失活小鼠）。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述篩選標(biāo)記為neo基因。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳動物模型中， 與野生型對照動物相比，具有以下一個或或多個特征：
[0027] 自發(fā)活動水平增加；
[0028] 抑郁樣的行為增加；
[0029] 空間學(xué)習(xí)和記憶能力受損；
[0030] 表現(xiàn)出孤獨癥樣和精神分裂癥樣行為；
[0031] 海馬區(qū)突觸后致密組分中部分受體亞基的含量減少；
[0032] 長時程增強受損；和/或
[0033] 成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少。
[0034] 在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型 的用途，將該模型用作研究神經(jīng)精神疾病的動物模型。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述神經(jīng)精神疾病包括：精神分裂癥、躁郁癥、重度抑郁癥、孤獨 癥、和/或老年癡呆癥。
[0036] 在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型 的用途，其中，將該模型用于篩選或鑒定可減輕或治療神經(jīng)精神疾病的物質(zhì)（治療劑）。
[0037] 在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模型 的用途，所述的神經(jīng)精神疾病是成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少相關(guān)疾病。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少相關(guān)疾病是精神分裂癥、躁郁 癥、抑郁癥、孤獨癥、和/或老年癡呆癥。
[0039] 在本發(fā)明的第五方面，提供了用本發(fā)明第一方面所述方法制備的非人哺乳動物模 型。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，對于CRMP2基因失活而言，所述的非人哺乳動物模型是雜合的 或純合的。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的CRMP2基因失活是大腦特異性的CRMP2基因失活或全身 的CRMP2基因失活。
[0042] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選或鑒定治療或緩解神經(jīng)精神疾病的潛在治 療劑的方法，包括以下步驟：
[0043] a.將候選物質(zhì)施用于本發(fā)明第五方面所述的非人哺乳動物模型；和
[0044] b.對所述動物模型的行為進行行為學(xué)分析，并與對照組進行比較；
[0045] 其中，與對照相比，如果施用了候選物質(zhì)的動物模型中表征神經(jīng)精神疾病行為得 到改善，則表明該候選物質(zhì)是神經(jīng)精神疾病的潛在治療劑。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的行為學(xué)分析包括：開放場實驗、高架十字迷宮實驗、強迫 游泳實驗、懸尾實驗、蔗糖偏好實驗、水迷宮實驗、關(guān)聯(lián)/暗示條件恐懼實驗、驚反射前脈沖 抑制實驗、筑巢實驗、或其組合。
[0047] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 圖1顯示了本發(fā)明一個實施例中的CRMP2基因打靶載體構(gòu)建策略。
[0049] 圖2顯示了 Pop Out載體的示意圖
[0050] 圖3顯示了 CRMP2基因打靶載體及多酶切鑒定。
[0051] 圖4顯示了 ES細胞篩選loxP位點、3'端和5'端PCR鑒定結(jié)果示意圖。
[0052] 圖5顯示了 . CRMP2嵌合體小鼠。
[0053] 圖6顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠繁殖策略。
[0054] 圖7顯示了大腦特異性CRMP2敲除效率驗證結(jié)果。其中，（A)CRMP2基因敲除小鼠 基因型鑒定圖示；(B)CRMP2基因敲除小鼠海馬中CRMP2的mRNA的表達水平有顯著下調(diào)， CRMPs家族的其他成員mRNA表達水平?jīng)]有明顯變化；（C)免疫印跡法檢測顯示CRMP2cK0小 鼠各個腦區(qū)的CRMP2及P-CRMP2蛋白表達水平明顯降低；(D)免疫熒光染色檢測CRMP2在 cKO小鼠腦片上明顯降低。注 ：0B，嗅球；Cor，皮層；Cere，小腦；Hip，海馬；Med，髓質(zhì)；標(biāo) 尺：200 u m。
[0055] 圖8顯示了敲除CRMP2可使小鼠體重下降，但皮層分層基本正常。其中，（A)P56 小鼠體重的定量分析（雌鼠：對照組n=13，cK0 n=8雄鼠：對照組n=13，cK0 n=8) ;(B)出生 56天的對照小鼠和CRMP2cK0小鼠（nestin-cre)的大腦形態(tài)（比例尺2mm) ;(C)尼氏染色 示出生56天的對照小鼠和CRMP2cK0小鼠大腦結(jié)構(gòu)沒有明顯異常；(D) NeuN染色顯示CRMP2 特異敲除小鼠出生56天后皮層各層分布未見明顯異常。注：所有數(shù)據(jù)均為平均值土平均 值的標(biāo)準(zhǔn)差（土 SEM) ;t 檢驗，#p〈0. 01，*p〈0. 05
[0056] 圖9顯示了 CRMP2敲除小鼠神經(jīng)元遷移正常。其中，圖A_D : TBR1，SATB2, FoxPl，CTIP2染色顯示E18. 5的CRMP2,表明cKO鼠腦中皮層各層并未出現(xiàn)明 顯的缺陷及異常。
[0057] 圖10顯示了 CRMP2神經(jīng)特異敲除小鼠自發(fā)活動增加但是焦慮樣行為正常。其中， (A)曠場實驗中小鼠在30分鐘內(nèi)的活動總距離；(B)曠場實驗中小鼠在30分鐘內(nèi)停留在中 央?yún)^(qū)域的時間比例；(C)高架十字迷宮實驗中小鼠在5分鐘的測試時間內(nèi)停留在開臂區(qū)域 的時間占總時間的比例。
[0058] 圖11顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠抑郁樣行為增加。其中，（A)強迫游泳實 驗，每6分鐘為一測試時段，累計小鼠不活動的時間；(B)懸尾實驗，每6分鐘為一測試時 段，累計小鼠不活動時間；(C)蔗糖偏好實驗。比較小鼠對蔗糖溶液和水的偏好程度。
[0059] 圖12顯示了與孤獨癥非常類似的CRMP2敲除小鼠。
[0060] 圖13顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠學(xué)習(xí)和空間記憶能力受損。其中，㈧場 景恐懼實驗中小鼠在5分鐘的測試時段內(nèi)小鼠因恐懼而僵直的時間比例；(B)M 〇rriS水迷 宮實驗，計算5天的訓(xùn)練周期中小鼠到達隱藏平臺所需的平均時間；(C)空間探索實驗第六 天小鼠停留在目標(biāo)象限內(nèi)的時間比例。
[0061] 圖14顯示了 CRMP2基因敲除小鼠表現(xiàn)出類精神分裂癥行為。其中，（A)不同脈沖 強度下對照小鼠和CRMP2基因敲除小鼠的驚嚇反應(yīng)幅度；(B) CRMP2基因敲除小鼠前脈沖抑 制效應(yīng)明顯減弱；(C)對照組和CRMP2敲除小鼠做窩的圖示；(D)CRMP2敲除小鼠在做窩評 分明顯低于對照小鼠。
[0062] 圖15顯示了 CRMP2神經(jīng)細胞特異敲除小鼠海馬區(qū)突觸后致密區(qū)受體量選擇性下 降。其中，（A)免疫印跡顯示分離的突觸后致密區(qū)組分純，同時表明突觸后致密區(qū)組分中存在 CRMP2 ; (B)免疫印跡顯示敲除小鼠突觸后致密區(qū)組分中NMDA受體NR1和NR2B的量減少。
[0063] 圖16顯示了 CRMP2神經(jīng)細胞特異敲除小鼠海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)觀察。其中， (A)電子顯微例圖顯示對照小鼠和敲除典型的突觸結(jié)構(gòu)突觸前囊泡（箭狀標(biāo)記）、突觸后致 密組分（箭頭）及樹突棘（星號）；(B)CRMP2敲除小鼠的突觸間隙與對照組沒有差異；(C) CRMP2敲除小鼠在突觸致密組分長度與對照組沒有差異；(D)CRMP2敲除小鼠突觸致密組分 面積較對照組??；(E)CRMP2敲除小鼠突觸致密組分厚度比明顯變??；(F)通過累積頻率圖 及直方圖分布和高斯曲線擬合的方式測繪突觸后膜致密組分厚度。注：圖B-E均為平均值 土 SEM。雙尾T檢驗。
[0064] 圖17顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠LTP受損。其中，（A)輸入-輸出曲線顯 示CRMP2cK0小鼠的基礎(chǔ)突觸傳導(dǎo)正常；(B)當(dāng)間隔為60ms和500ms，對照和cKO小鼠雙脈 沖易化比例相似；(C)CRMP2神經(jīng)特異敲除小鼠TBS誘導(dǎo)的LTP明顯減弱。
[0065] 圖18顯示了大腦特異性CRMP2敲除小鼠成年神經(jīng)前體細胞增殖減少。其中，（A) Brdu免疫染色腦切片的共聚焦圖示，比例尺：50 y m ; (B)齒狀回區(qū)BrdU陽性細胞的體式學(xué) 定量分析；(C)活化的半胱天冬酶-3免疫染色腦切片的共聚焦圖示，比例尺：50 y m ; (D)齒 狀回顆粒下層及顆粒細胞層內(nèi)活化的半胱天冬酶-3細胞密度的定量分析。

【具體實施方式】
[0066] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，建立了一種遺傳穩(wěn)定、表型穩(wěn)定的神經(jīng)精神疾 病模型，它是CRMP2基因被剔除或失活的小鼠或其他非人哺乳動物。本發(fā)明的動物模型是 一種有效的神經(jīng)精神疾病動物模型，可用于研究精神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥和老 年癡呆癥等神經(jīng)精神疾病，并可以用于特定藥物的篩選和測試試驗。在此基礎(chǔ)上完成了本 發(fā)明。
[0067] 具體地，在本發(fā)明中，對大腦特異性CRMP2和全身敲除的小鼠模型的行為學(xué)檢測 證實，該神經(jīng)精神疾病模型動物的自發(fā)活動水平增加,抑郁樣行為增加和精神分裂癥樣的 行為學(xué)表型，部分小鼠表現(xiàn)出典型的孤獨癥表型。對海馬組織突觸后膜致密組分中AMPA受 體亞基和NMDA受體亞基的免疫印跡分析表明敲除小鼠中海馬PSD組分中NR1和NR2B的量 顯著降低；通過透射電鏡對海馬CA1區(qū)放射層非對稱突觸的超微結(jié)構(gòu)進行觀察，發(fā)現(xiàn)敲除 小鼠在該區(qū)的PSD面積明顯變小，厚度變??；通過電生理技術(shù)發(fā)現(xiàn)敲除小鼠海馬謝弗側(cè)支 CA1區(qū)突觸的基礎(chǔ)傳遞和突觸前膜的遞質(zhì)釋放正常，但是TBS誘導(dǎo)產(chǎn)生的長時程增強卻明 顯受損。同時該基因敲除小鼠齒狀回中成年神經(jīng)干細胞增殖明顯減少。
[0068] CRMP 家族和 CRMP2
[0069] CRMPs家族（CRMP1-5)的各個成員在不同的物種被獨立發(fā)現(xiàn)，其中日本科學(xué)家 最早發(fā)現(xiàn)CRMP2在雞胚的背根神經(jīng)節(jié)中介導(dǎo)胞外信號Sema3A轉(zhuǎn)導(dǎo)過程具有重要作用 (Goshima et al.，1995;Minturn et al.，1995)。在結(jié)構(gòu)上，CRMP1-4 相互之間大約 75% 氨 基酸序列同源，但是CRMP5與其他成員只有50%-51%的氨基酸序列同源。CRMP1-4也與肝臟 中的二氫尿嘧啶脫氫酶序列高度同源而且結(jié)構(gòu)與金屬依賴的氨基水解酶高度相似，都能形 成穩(wěn)定的四聚體（Hamajima et al.，1996)。但是CRMPs家族中沒有一個成員具有酶活性，可 能是由于缺少氨基水解酶活化位點結(jié)合金屬原子所必需關(guān)鍵氨基酸殘基組氨酸（Wang and Strittmatter, 1996)〇
[0070] CRMP2(collapsin response mediator protein-2,也被稱為 DPYSL2/ DRP2，Unc-33，Ulip或TUC2)是CRMPs家族的一員。CRMP2在神經(jīng)元的極性建立上具有重要 作用，研究表明體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中過表達CRMP2促進多軸突形成，過表達功能缺失 突變體導(dǎo)致軸突變短（Inagaki et al.，2001)。CRMP2通過促進與微管蛋白異源二聚體結(jié) 合從而促進軸突的外向生長，而在神經(jīng)突起的生長錐是通過調(diào)節(jié)極性蛋白Numb介導(dǎo)的內(nèi) 吞作用來調(diào)控的神經(jīng)元極性（Yoshimura et al.，2005)。CRMP2參與極性建立是通過磷酸 化與去磷酸化的方式調(diào)節(jié)與微管蛋白和Numb的親和力來實現(xiàn)的。
[0071] CRMP2基因位于人類基因組8p22-p21上，全長150985bp (Genebank登錄號： NG_030020. 1)。CRMP2的基因組序列包括13個內(nèi)含子和14個外顯子，有8個不同的轉(zhuǎn)錄 本，其中有三個轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白。這些序列信息可參見文獻或Genebank等公共數(shù)據(jù)庫。
[0072] 小鼠等其他物種的CRMP2基因也可參見文獻或Genebank等公共數(shù)據(jù)庫。
[0073] 應(yīng)理解，術(shù)語"CRMP2"還包括各種天然存在的CRMP2基因的變異形式。代表性的 例子包括：因密碼子的簡并性而編碼與野生型相同的CRMP2蛋白的核苷酸序列，編碼野生 型CRMP2蛋白的保守性變異多肽的核苷酸序列。此外，對于小鼠之外的其他哺乳動物時，該 術(shù)語指CRMP2基因在該哺乳動物中的同系物。例如對于人而言，該術(shù)語指人的CRMP2 (已知 小鼠CRMP2基因與人類CRMP2的cDNA同源度為86%，氨基酸序列的同源度為99%)。
[0074] 神經(jīng)精神疾病及成年新生神經(jīng)元發(fā)生（adult neurogenesis)減少相關(guān)疾病
[0075] 神經(jīng)精神疾病是以表現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)病變、行為、心理活動紊亂的一組疾病，主要分 為神經(jīng)疾病與精神疾病。近年的研究表明，海馬是與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，從功能 上看，海馬齒狀回成年新生神經(jīng)元發(fā)生對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的可塑性和維持上具有重要的作用，也 是老年癡呆病早期階段最容易受損的腦區(qū)，在精神分裂癥與抑郁癥等精神疾病病人中也 常伴有海馬功能的異常。越來越多的證據(jù)提示海馬齒狀回區(qū)成年新生神經(jīng)元發(fā)生（adult neurogenesis)的減少可能是精神分裂癥與抑郁癥等精神疾病及老年癡呆發(fā)病發(fā)病的重要 原因之一（Ming and Song, 2011 ;Winner et al.，2011 ;Mu and Gage, 2011)。
[0076] 在本發(fā)明中，成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少相關(guān)疾病包括但不限于情緒類疾病如精神 分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥，神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆、帕金森病等，優(yōu)選地，包括精 神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥、和/或老年癡呆癥。
[0077] 基因失活
[0078] 對于功能未知基因的研究可采用許多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所 得的遺傳修飾的表型變化，進而獲得該基因的功能信息。這一研究方法的另一優(yōu)點是可以 將基因功能和疾病進行關(guān)聯(lián)，從而在獲得基因功能的同時也能獲得該基因作為潛在藥物或 者藥物靶點所能治療的疾病信息和疾病動物模型。基因失活的方法可通過基因剔除、基因 中斷或基因插入的方式來完成。其中，基因剔除技術(shù)是研究人類基因在整體中的功能的非 常強有力的手段。
[0079] 動物模型
[0080] 在本發(fā)明中，提供了一種非常有效的神經(jīng)精神疾病的非人哺乳動物模型。
[0081] 在本發(fā)明中，非人哺乳動物的例子包括（但并不限于）：小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳 地是大鼠和小鼠。
[0082] 如本文所用，術(shù)語"CRMP2基因失活"包括一個或兩個CRMP2基因被失活的情況，即 包括CRMP2基因雜合地和純合地失活。例如，CRMP2基因失活的小鼠可以是雜合或純合的 小鼠。
[0083] 在本發(fā)明中，可基因剔除或轉(zhuǎn)入外源基因（或片段）而使CRMP2基因失活等方法 制備CRMP2基因失活的非人哺乳動物（如小鼠）。在本領(lǐng)域中，通過基因剔除或轉(zhuǎn)入外源基 因而使靶基因失活的技術(shù)是已知的，這些常規(guī)技術(shù)都可用于本發(fā)明。
[0084] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，CRMP2基因的失活是通過基因剔除實現(xiàn)的。
[0085] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，CRMP2基因的失活是通過CRMP2基因中插入外源基因 (或片段）而實現(xiàn)的。
[0086] 在本發(fā)明的一具體實例中，可構(gòu)建一含有外源插入片段的構(gòu)建物，該構(gòu)建物含有 與靶基因（CRMP2)的插入位點的兩側(cè)的側(cè)翼序列同源的同源臂，從而可以通過同源重組高 頻地將外源插入片段（或基因）插入至CRMP2基因組序列（尤其是外顯子區(qū)域），造成小鼠 CRMP2基因的移碼、提前終止、或敲除，從而導(dǎo)致CRMP2缺失或失活。
[0087] 用本發(fā)明方法獲得的純合或雜合的小鼠可育，發(fā)育正常。失活的CRMP2基因可以 孟德爾規(guī)律遺傳給后代小鼠。
[0088] 在一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種缺失CRMP2基因的純合小鼠模型動物。
[0089] 候選藥物或治療劑
[0090] 在本發(fā)明中，還提供了一種利用本發(fā)明的動物模型，篩選治療神經(jīng)精神疾病的候 選藥物或治療劑的方法。
[0091] 在本發(fā)明中，候選藥物或治療劑是指已知具有某種藥理學(xué)活性或正在被檢測的可 能具有某種藥理學(xué)活性的物質(zhì)，包括但不限于核酸、蛋白、化學(xué)合成的小分子或大分子化合 物、細胞等。候選藥物或治療劑的給藥方式可以是口服、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、椎 管給藥或直接腦內(nèi)注射。
[0092] 本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：
[0093] (a)本發(fā)明神經(jīng)精神疾病模型的遺傳穩(wěn)定、表型穩(wěn)定。
[0094] (b)用本發(fā)明方法獲得的純合或雜合的動物模型可育，發(fā)育正常。轉(zhuǎn)基因雜合雄性 小鼠具有生殖能力，失活的CRMP2基因可以孟德爾規(guī)律遺傳給后代小鼠。
[0095] (c)所述神經(jīng)精神疾病動物模型表現(xiàn)出多種神經(jīng)和精神疾病樣的癥狀，因此可以 廣泛用于神經(jīng)精神類疾病的藥物篩選和測試，包括精神分裂癥、躁郁癥、抑郁癥、孤獨癥和 老年癡呆等。
[0096] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0097] 材料
[0098] 1實驗材料、主要試劑與實驗儀器
[0099] 1. 1小鼠、細胞株、菌株和質(zhì)粒
[0100] C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；ICR小鼠為中 國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所動物中心繁殖；工具鼠Nestin-Cre(品系名： B6.Cg(SJL)-TgN(Ne S-Cre)lKln)/J)購自南京大學(xué)模式動物研究所；Thyl-GFP-M由清華大 學(xué)左毅教授贈送。
[0101] ES細胞株（MPI-2,衍生自129SvJ品系）購自北京百奧賽圖生物技術(shù)有限公司。
[0102] G418 抗性小鼠原代成纖維細胞（MEF)購自 National Cancer Institute at Frederic。
[0103] 大腸桿菌T0P10菌株（購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司）和工程菌EL350(購 自 National Cancer Institute at Frederic)〇
[0104] 質(zhì)粒pBluescript II KS+購自Stratagen公司；打祀載體構(gòu)建過程中使用的質(zhì)粒 PL253，PL451，PL452 購自 National Cancer Institute at Frederic。含 CRMP2 基因全長 的 BAC 克?。≧PCI23-414A17)購自 Invitrogen 公司。
[0105] 1.2酶、培養(yǎng)基、試劑盒和生化藥品
[0106] 所用的各種內(nèi)切酶、Taq DNA Polymerase、T4DNA ligase、DNA Marker 購自 New England Biolab或Takara公司；基因型鑒定用的PCR mixture購自北京康為世紀(jì)生物科 技有限公司；DMEM，Trypsin，Pen-Str印為Hyclone產(chǎn)品；胰蛋白胨（LP0042)，酵母抽提粉 (LP0021)為0X0ID產(chǎn)品；DMS0購自Sigma公司；DNA回收純化試劑盒購自索萊寶公司；質(zhì)粒 小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒中提，大提試劑盒購自Qiagen公司；寡核苷酸引物由上 海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
[0107] 1. 3實驗中使用的引物序列
[0108] 1. 3. 1擴增同源臂所用引物序列：
[0109]

【權(quán)利要求】
1. 一種非人哺乳動物的神經(jīng)精神疾病動物模型的制備方法，其特征在于，該方法包括 以下步驟： ⑴提供非人哺乳動物的細胞，將所述細胞中的CRMP2基因失活，得到CRMP2基因失活 的細胞； (2)利用步驟（1)中得到的CRMP2基因失活的細胞，制備得到CRMP2基因失活的神經(jīng)精 神疾病動物模型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將CRMP2基因失活包括基因剔除、基 因中斷或基因插入。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳動物為嚙齒動物或靈長目 動物，較佳地包括小鼠、大鼠、兔、猴。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 利用DNA同源重組技術(shù)，將所述CRMP2基因中的外顯子1至外顯子14中一個或多 個外顯子剔除或中斷，并任選地用篩選標(biāo)記替換，得到CRMP2基因失活的非人哺乳動物細 胞； (2) 利用步驟（1)中得到的CRMP2基因失活的非人哺乳動物細胞制備得到嵌合非人哺 乳動物； (3) 將步驟（2)中得到的嵌合非人哺乳動物和正常野生型非人哺乳動物交配繁育，在 后代中篩選獲得CRMP2基因失活的雜合子非人哺乳動物； (4) 通過將步驟（3)中得到的雜合子非人哺乳動物相互交配獲得CRMP2基因失活的純 合子非人哺乳動物，從而得到CRMP2基因失活的非人哺乳動物模型。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述篩選標(biāo)記為neo基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵中得到的CRMP2基因失活的 非人哺乳動物模型中，與野生型對照動物相比，具有以下一個或或多個特征： 自發(fā)活動水平增加； 抑郁樣的行為增加； 空間學(xué)習(xí)和記憶能力受損； 表現(xiàn)出孤獨癥樣和精神分裂癥樣行為； 海馬區(qū)突觸后致密組分中部分受體亞基的含量減少； 長時程增強受損；和/或 成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一項所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，其特征在 于，將該模型用作研究神經(jīng)精神疾病的動物模型。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一項所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，其特征在 于，將該模型用于篩選或鑒定可減輕或治療神經(jīng)精神疾病的物質(zhì)（治療劑）。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一項所述方法制備的非人哺乳動物模型的用途，其特征在 于，所述的神經(jīng)精神疾病是成年新生神經(jīng)元發(fā)生減少相關(guān)疾病。
10. -種篩選或鑒定治療或緩解神經(jīng)精神疾病的潛在治療劑的方法，其特征在于，包括 以下步驟： a.將候選物質(zhì)施用于權(quán)利要求1所述方法制備的非人哺乳動物模型；和 b.對所述動物模型的行為進行行為學(xué)分析，并與對照組進行比較； 其中，與對照相比，如果施用了候選物質(zhì)的動物模型中表征神經(jīng)精神疾病行為得到改 善，則表明該候選物質(zhì)是神經(jīng)精神疾病的潛在治療劑； 更佳地，所述的行為學(xué)分析包括：開放場實驗、高架十字迷宮實驗、強迫游泳實驗、懸尾 實驗、蔗糖偏好實驗、水迷宮實驗、關(guān)聯(lián)/暗示條件恐懼實驗、驚反射前脈沖抑制實驗、筑巢 實驗、或其組合。
【文檔編號】C12N15/09GK104450602SQ201310425687
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】許執(zhí)恒 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所