一種高效表達植酸酶的工程菌株構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種高效表達植酸酶的工程菌株構(gòu)建，涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效表達適應(yīng)范圍更廣的大腸桿菌植酸酶誘變工程菌株。將重組表達質(zhì)粒pET30a（+）-appA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達宿主中，獲得重組表達工程菌株W，再通過乳糖誘變獲得新的大腸桿菌植酸酶重組表達工程菌株M6。M6工程菌株與W工程菌株相比，未發(fā)生基因突變，但其植酸酶酶活更高，搖瓶培養(yǎng)酶活達到807.35U/mL。且與W工程菌株相比，M6工程菌株表達的植酸酶對胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐性分別提高了17.44%和34.77%。本發(fā)明的M6工程菌株能高效表達適應(yīng)范圍更廣的植酸酶，這種誘變植酸酶可作為一種飼料添加劑，能在動物消化道內(nèi)更好的消化利用植酸鹽，減少有機磷的排放，促進畜禽業(yè)的生態(tài)養(yǎng)殖。
【專利說明】一種高效表達植酸酶的工程菌株構(gòu)建
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效表達適應(yīng)范圍更廣的大腸桿菌植酸酶誘變工程菌株，本發(fā)明還涉及該誘變工程菌株的生產(chǎn)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磷是動物生長必要的元素，存在于動物體所有細胞中，幾乎參與所有生理上的化學反應(yīng)。其含量超過動物機體礦物質(zhì)總量的1/4,在動物體內(nèi)以磷酸鹽形式存在,其中80% 以羥磷存在于骨骼和牙齒中，另外20%則存在于肌肉、血液及軟骨中。長期磷缺乏會導致動物生長組織受到抑制，骨骼變軟變脆，誘發(fā)生長動物的佝僂病和成年動物的骨質(zhì)疏松癥，從而影響動物的生長性能。為滿足動物對磷的需求，目前大多在動物飼料中添加無機磷，如磷酸氫鈣。而以植物性飼料為主的動物日糧中本身就含有豐富的磷源，但它們主要以動物不能直接吸收的植酸或植酸鹽形式存在。
[0003]植酸及植酸鹽是植物性飼料(如谷物、豆類和油料等作物籽實)中的磷和肌醇基本貯存形式，其含量達到1飛％，占植物中總磷的6(T80%。但是，由于單胃動物(如豬、雞等)的消化道和魚類的小腸缺乏有效消化植酸磷的酶類(MaenzDD, Classen HL.Phytase activity in the small intestinal brush border membrane of the chicken[J].Poult Sci，1998，77 (4):557_563)，植酸磷沒有經(jīng)過充分消化吸收就直接排出體外，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來許多問題:第一、造成磷源浪費，一方面飼料中的磷源不能得到有效利用，研究表明: Ig的植酸完全分解可釋放281.6mg的無機磷，是非常豐富的無機磷源；另一方面為了滿足動物對磷的需求，又必須在飼料中額外添加無機磷，伴隨國際磷價格的攀升，飼料成本不斷提高；同時，由于生產(chǎn)工藝問題，添加的無機磷中氟、重金屬等元素含量超標，易造成動物中毒。第二、形成高磷糞便而污染環(huán)境，植物性飼料中85%的植酸磷未被消化就隨糞便排出， 使大量的磷進入水和土壤中造成環(huán)境富營養(yǎng)化，嚴重破壞了養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境。第三、植酸還是一種抗營養(yǎng)因子，具有與EDTA相似的強螯合能力，在動物腸胃道的消化吸收過程中會與多種金屬離子(Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、CU2+、Mn2+等)以及帶正電的蛋白質(zhì)和維生素螯合成相應(yīng)的不溶性復合物，從而降低了動物對這些營養(yǎng)元素的有效利用。
[0004]植酸酶(phyt ase)是一種能催化植酸及其鹽水解為磷酸(或磷酸鹽)和肌醇的酶類統(tǒng)稱(黃遵錫.植酸酶基礎(chǔ)及應(yīng)用研究狀況.食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25 (2):54-58)， 它實際包含了植酸酶和酸性磷酸酶兩種酶。根據(jù)植酸酶對底物的作用方式可以分成三類:3_植酸酶(EC.3.1.3.8)、6_植酸酶(EC.3.1.3.26)和非特征的正磷酸單酯磷酸水解酶 (EC.3.1.3.2)。真菌(酵母、曲霉等)和大多數(shù)細菌(包括枯草芽孢桿菌、假單孢桿菌、乳酸桿菌等)來源的植酸酶屬于3-植酸酶，這類酶發(fā)揮作用需要Mg2+的輔助，而植物和大腸桿菌來源的植酸酶屬于6-植酸酶。研究發(fā)現(xiàn)，來源于大腸桿菌的植酸酶(植酸酶APPA)是迄今所知的分解植酸能力最強的植酸酶，具有一下幾個特點:第一、同時具有植酸酶和磷酸酶功能，最適pH分別為4.5和2.5~3.0 ;第二、最適反應(yīng)溫度為55飛(TC，在37°C時，也可以發(fā)揮 50%左右的酶活性；第三、具有良好的蛋白酶抗性，在pH為2.5的胃蛋白酶中處理2小時，保存80%的酶活，在pH為7.0的胰蛋白酶中處理2小時，保存38%的酶活。
[0005]研究表明，植酸酶的添加可使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷排泄量減少40%，還可解除植酸磷的抗營養(yǎng)作用。而單胃動物的胃腸溫度一般在37°C左右，胃內(nèi)pH為2.5，小腸pH為4.(T4.5，與大腸桿菌植酸酶的作用范圍與之相近，因而適合作為添加劑加入飼料中，對提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對環(huán)境的污染有重要意義。
[0006]然而，天然大腸桿菌中植酸酶的酶活太低，難以大量獲得植酸酶產(chǎn)品，使得植酸酶產(chǎn)品價格居高不下，嚴重限制了它在飼料工業(yè)中的發(fā)展。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，通過生物反應(yīng)器來高效表達植酸酶基因，實現(xiàn)了植酸酶產(chǎn)量的提高，同時顯著降低了生產(chǎn)成本。但酵母表達對培養(yǎng)條件有一定要求,培養(yǎng)基組成復雜增加了生產(chǎn)成本,且一般誘導100小時才能獲得穩(wěn)定的蛋白表達量；昆蟲細胞表達既需要嚴格的無菌環(huán)境，又需要昂貴的培養(yǎng)基， 侵染發(fā)生后100小時左右才能獲得低表達量的重組蛋白，不利于工業(yè)生產(chǎn)。這些問題已經(jīng)成為現(xiàn)在植酸酶進一步發(fā)展的一大難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種大腸桿菌植酸酶基因的重組表達載體及重組表達工程菌株。
[0008]本發(fā)明一方面提供了來源于大腸桿菌BL21 (DE3)的基因(AM946981.2)的核苷酸序列(SEQ ID N0.1)，核苷酸序列全長1299bp，其中ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子，4~66bp為編碼信號肽序列。該植酸酶基因的核酸序列可用于構(gòu)建重組載體。
[0009]所述SEQ ID N0.1的核苷酸序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種植酸酶，其特征在于:其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植酸酶，其特征在于:所述的SEQID N0.1的編碼信號肽序列為4~66bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植酸酶，其特征在于:用于編碼該植酸酶的氨基酸，其序列為 SEQ N0.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植酸酶，其特征在于:所述的SEQN0.2的氨基酸序列酶活性中心為RHGVRAP，含有3個糖基化位點。
5.一種植酸酶重組表達工程菌株W，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列進行構(gòu)建。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植酸酶重組表達工程菌株W，其特征在于:表達載體為 pET30a ( + ) -appk, pET30a是表達載體，appA為表達基因片段。
7.一種高效表達植酸酶的工程菌株M6，其特征在于:將權(quán)利要求5或6所述的植酸酶工程菌株W進行乳糖誘變，后進行目的蛋白表達篩選獲得。
8.權(quán)利要求1所述植酸酶的構(gòu)建方法，包括以下步驟:(1)大腸桿菌coliBL21 (DE3)基因的獲得及重組載體構(gòu)建；1)制備LB培養(yǎng)基，收集菌體接種到LB培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)，收集菌體；2)提取目的基因；3)測序載體構(gòu)建；4)表達載體構(gòu)建；5)通過檢測，獲得含有陽性重組pET30aC + )-appA質(zhì)粒的菌株，提取質(zhì)粒，進行酶切分析，并測序；(2)大腸桿菌植酸酶重組表達工程菌株的獲得將測序正確的pET30a ( + )-部/^重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入疋coli BL21 (DE3)表達宿主中，通過菌落PCR的方法檢測，含有pET30a i + )_appA重組質(zhì)粒的陽性重組表達工程菌株 W ；將W菌株接種到LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，進行目的誘導表達；以包含pET30a ( + )空載體的 BL21菌株對照，進行同樣的處理，測定植酸酶appA-W粗酶活；(3)以乳糖為誘導物進行誘變篩選；誘變菌株的誘導表達，獲得誘變植酸酶，并測定各菌株酶活，通過與W菌株的酶活相 t匕，獲得酶活更高的誘變工程菌株M6 ；(4)植酸酶活性測定(5)植酸酶酶學特性分析對植酸酶進行最適溫度的測定、最適PH的測定、酶耐熱性實驗和蛋白酶耐性實驗。
9.權(quán)利要求1所述的植酸酶作為飼料添加劑的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/01GK103555688SQ201310425694
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】蔣和生, 韋佩君, 潘能慶, 楊秀榮 申請人:蔣和生, 南寧培元基因科技有限公司