一種五氯酚降解菌及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)，具體為一種五氯酚降解菌及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用，利用微生物降解五氯酚污染物，適用于五氯酚污染或氯酚類化合物復(fù)合污染水體的生物修復(fù)。該降解菌為檸檬酸桿菌(Citrobacter)，于2013年6月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC保藏，保藏編號：CGMCC?No.7817，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。當(dāng)五氯酚為唯一碳源時，該菌能很好的對五氯酚進(jìn)行降解，72h對100mg/L的五氯酚的降解率可達(dá)90%。與其它菌株相比，該菌株具有高效的PCP降解能力、很好的環(huán)境適應(yīng)能力及多種氯酚的耐受性能。該菌在五氯酚污染或氯酚類化合物復(fù)合污染水體的生物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種五氯酚降解菌及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)，具體為一種五氯酚降解菌及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用，利用微生物降解五氯酚污染物，適用于五氯酚污染或氯酚類化合物復(fù)合污染水體的生物修復(fù)。
【背景技術(shù)】
[0002]五氯酚(PCP)是典型的致畸、致癌、致突變的“三致”污染物，是世界上公認(rèn)的優(yōu)先污染物質(zhì)。它屬于持久性有機(jī)污染物，是當(dāng)今環(huán)境治理的主要研究對象之一。五氯酚在環(huán)境中存在的濃度超過一定程度后，對人類和動植物都將產(chǎn)生嚴(yán)重的、具有潛伏性的危害。
[0003]在工作場所，空氣、食物、土壤與飲用水可能暴露在低濃度的五氯酚中，人們可能因?yàn)檫@些而接觸到五氯酚；此外，可能由于接觸到五氯酚防腐的木材而接觸到五氯酚。在有害廢棄物棄置場附近，意外地泄漏會污染附近的土壤、水和空氣，這種情況下，五氯酚的濃度一般會比較高。當(dāng)人們吸入、食入或通過皮膚接觸五氯酚時，五氯酚很容易的能進(jìn)入到人的體內(nèi)，最常見的方式是通過呼吸吸入和皮膚接觸。經(jīng)過短時間暴露后，五氯酚很快就排出體外。研究顯示:五氯酚在人體內(nèi)的半衰期約為33小時。在體內(nèi)的五氯酚似乎不會積蓄很多，雖然大部分不會分解，但會通過泌尿系統(tǒng)排出體外，很少的一部分由糞便和呼吸系統(tǒng)排出。五氯酚對人體健康的危害，大部分與不純的混合物有關(guān)，因工作或誤用而在短時間暴露在高濃度五氯酚的環(huán)境中，會引起肝、腎、血液、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及腸胃系統(tǒng)的損害。接觸五氯酚(尤其是熱蒸汽狀態(tài))會刺激皮膚、眼睛和嘴。若是人體攝入量太多，產(chǎn)生的熱會使體溫升高，甚至高到很危險的程度，引起不同組織器官的傷害，甚至引起死亡。因?yàn)闆]有足夠可靠的有關(guān)影響人類健康的暴露濃度，所以在這方面，須通過對動物的實(shí)驗(yàn)獲得，由動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，短時間暴露在高濃度五氯酚的環(huán)境中，會危害肝、腎、血液、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及腸胃系統(tǒng)；長期低濃度暴露，主要危害的器官或系統(tǒng)是肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等，暴露濃度越高，其危害越大。美國聯(lián)邦政府已經(jīng)制定了取締標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)要領(lǐng)，以保護(hù)人們免受空 氣中的五氯酚污染而影響健康?？諝庵形迓确拥谋┞稘舛?，平均一天暴露8小時，一周暴露40小時的容許濃度為5ppb (0.005mg/L)。
[0004]美國環(huán)保署規(guī)定飲用水中五氯酚的含量不能高于0.001mg/L，至于短期的暴露則是一天不能超過1.0mg/Lo美國環(huán)保署也估計(jì),一個平均體重的成人一天暴露0.03mg/d,會引起屬于癌癥方面的危害。
[0005]目前，處理PCP的技術(shù)有物理化學(xué)降解(包括光催化氧化降解法、電化學(xué)降解法、超聲波誘導(dǎo)降解法)和生物降解(包括氧化脫氯降解、還原脫氯降解、高效菌種法)。相比物理化學(xué)方法，生物法具有成本低、效率高、無二次污染、不破壞植物生長所需的土壤環(huán)境及易操作等特點(diǎn)，它在將來的PCP污染治理中將會有較廣闊的前景，但生物法也有處理速度慢的缺點(diǎn)。因此，分離篩選高效的PCP降解菌種，對其降解能力進(jìn)行分析。對照目前已知的PCP降解途徑，分析所獲取降解菌可能的降解途徑，對其關(guān)鍵基因進(jìn)行分析，以期構(gòu)建高效工程菌株，應(yīng)用于相關(guān)廢水的處理當(dāng)中。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種五氯酚降解菌及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用，獲得能夠高效快速降解五氯酚的菌株，解決五氯酚環(huán)境污染的問題，提高生物法處理速度。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0008]一種五氯酹降解菌，該降解菌為朽1檬酸桿菌Citrobacter sp.,于2013年6月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC保藏，保藏編號=CGMCCN0.7817，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
[0009]所述的五氯酚降解菌，該降解菌代號為0C9，菌落呈淺黃色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，顯微鏡觀察為桿狀，革蘭氏染色陰性。
[0010]所述的五氯酚降解菌，該降解菌的菌株16SrDNA的GenBank登陸號為:KF657722。
[0011]所述的五氯酚降解菌的生產(chǎn)方法，具體步驟如下:
[0012](I)取I-2g化工廠污水池的污泥樣品，用100-200mL無菌水稀釋；
[0013](2)取0.5-ImL稀釋液加入20-50mL液體LB培養(yǎng)基中，28-30°C，130-150rpm振蕩培養(yǎng)20-24h，形成富集培養(yǎng)菌液；
[0014]液體LB培養(yǎng)基中，IL培養(yǎng)基的成分:NaC110g，酵母膏5g，蛋白胨10g，余量為水，pH=7.0 -7.5 ;
[0015](3)在無菌操作件下，將獲得的富集培養(yǎng)菌液梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為KT1-10_8，根據(jù)需要取稀釋濃度的培養(yǎng)液10-100 μ 1，用`涂布棒均勻涂布在五氯酚濃度為50-IOOmg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，28-30°C倒置培養(yǎng)24h-48h，獲得能夠利用五氯酚生長的菌株;
[0016]無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，IL培養(yǎng)基的成分:NaC10.5-1.0g, K2HPO4L 5-2.0g,MgSO40.5 -1.0g, KH2PO40.5 -1.5g, NH4Cl0.5 -1.5g, NH4NO3L O -2.0g,酵母膏 0.05 -
0.lg，余量為水，ρΗ=6.5 -7.5。
[0017]所述的五氯酚降解菌的生產(chǎn)方法，對獲得的菌株進(jìn)行五氯酚耐受性測試，將其分別點(diǎn)種在五氯酚濃度為50-250mg/L的固體選擇性平板上，挑取各平板上的優(yōu)勢菌落，繼續(xù)劃線至單菌落；將單菌落在相同條件下液體培養(yǎng)24h后，取ImL所得菌液加入30-50wt%的無菌甘油，-20--70°C保存。
[0018]所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，五氯酚降解菌應(yīng)用在氯酚類化合物污染水體生物修復(fù)中。
[0019]所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，氯酚類化合物為五氯酚。
[0020]所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，五氯酚降解菌對五氯酚的降解，合適降解條件為30°C>pH7.4。
[0021]所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，將降解菌菌種活化后轉(zhuǎn)入五氯酚初始濃度為50-100mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28-30°C，130-150rpm振蕩培養(yǎng)4-5d，取菌液5mL，轉(zhuǎn)入含有100-200mg/L五氯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至菌株生長；重復(fù)上述操作，至培養(yǎng)基中五氯酚的終濃度達(dá)200-400mg/L ；
[0022]所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，IL培養(yǎng)基的成分:NaC10.5-1.0g, K2HPO4L 5-2.0g,MgSO40.5 -1.0g, KH2PO40.5 -1.5g, NH4Cl0.5 -1.5g, NH4NO3L O -2.0g,酵母膏 0.05 -
0.lg，余量為水，ρΗ=6.5 -7.5。[0023]所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，當(dāng)培養(yǎng)液中五氯酚終濃度為100mg/L，培養(yǎng)溫度300C，培養(yǎng)液pH=7.4的條件下，降解菌菌株在24h到達(dá)對數(shù)生長期，96h到達(dá)穩(wěn)定期，最高菌液濃度為OD6tltl=0.4 ;伴隨細(xì)菌的生長，五氯酚的降解率逐步提高，至72h五氯酚的降解率達(dá)90%，然后隨著細(xì)菌生長狀態(tài)的穩(wěn)定和新老交替，降解率緩慢提升，至測定終點(diǎn)168h，降解率達(dá) 93%。
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是:
[0025]本發(fā)明所提供的高效降解菌(0C9)來源于煙臺化工廠廢水池，經(jīng)富集、馴化、分離、培養(yǎng)獲得，其實(shí)施步驟為菌種的篩選與分離純化、馴化、PCP降解能力測定及最適降解條件探索。本發(fā)明可以有效處理工業(yè)廢水，在五氯酚污染或氯酚類化合物復(fù)合污染水體的生物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為0C9的生長情況及PCP降解率的關(guān)系。其中，PCP終濃度為100mg/L，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)液pH=7.4。
[0027]圖2為PCP濃度 對0C9生長及PCP降解率的影響。其中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)液pH=7.4，培養(yǎng)時間96h。
[0028]圖3為環(huán)境pH對0C9生長與PCP降解率的影響。其中，PCP終濃度為100mg/L，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間96h (小時)。
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1:菌種分離與純化
[0030]取I-2g來源于煙臺化工廠污水池的污泥樣品，用100-200mL無菌水稀釋。取
0.5-ImL稀釋液加入20-50mL液體LB培養(yǎng)基中(IL培養(yǎng)基的成分:NaC110g，酵母膏5g，蛋白胨10g，余量為水，pH=7.0-7.5)，28-30°C，130-150rpm (轉(zhuǎn)/分鐘)振蕩培養(yǎng)20-24h。在無菌操作條件下，將獲得的富集培養(yǎng)菌液梯度稀釋(稀釋倍數(shù)為KT1-10_8)，取合適稀釋濃度的培養(yǎng)液10-100 μ I，用涂布棒均勻涂布在PCP濃度為50-100mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(IL 培養(yǎng)基的成分=NaCl0.5g，K2HPO4L 5g, MgSO40.5g, KH2PO40.5g, NH4Cl0.5g，NH4NO3L 0g，酵母膏0.05g，余量為水，pH=7.4)平板上，28-30°C倒置培養(yǎng)24h-48h。從而，獲得能夠利用PCP生長(降解五氯酚)的菌株。
[0031]對獲得的菌株進(jìn)行PCP耐受性測試。將其分別點(diǎn)種在PCP濃度為50，80，120，150，200，250mg/L的固體選擇性培養(yǎng)基(IL培養(yǎng)基的成分=NaCl0.5，K2HPO4L 5g, MgSO40.5g, KH2PO40.5g, NH4Cl0.5g, NH4NO3L 0g，酵母膏 0.05g, PCP50 -250mg,余量為水，pH=7.0)平板上，挑取各平板上的優(yōu)勢菌落，繼續(xù)劃線至單菌落。將單菌落在相同條件下液體培養(yǎng)24h后，取ImL所得菌液加入30-50wt%的無菌甘油，-20-_70°C保存。對獲得的菌株進(jìn)行16SrDNA序列測定，采用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為，取PCR產(chǎn)物2-5 μ I進(jìn)行l(wèi)wt%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測.用瓊脂糖凝膠純化試劑盒(購自大連寶生物公司)切膠回收約1.5kb大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。菌株的16SrDNA序列測序結(jié)果登錄GenBank,并用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，將得到的相似菌株的16SrDNA，利用MEGA4.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析各分離菌株的進(jìn)化地位。經(jīng)鑒定:該降解菌的菌株16SrDNA的GenBank登陸號為KF657722，初步鑒定為檸檬酸桿菌。
[0032]該降解菌于2013年6月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC保藏，保藏編號:CGMCC N0.7817，其分類命名為檸檬酸桿菌Citrobacter sp.。
[0033]實(shí)施例2:0C9降解PCP的能力分析
[0034]將_80°C保存的0C9菌種接種至含有100mg/L PCP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(見實(shí)施例1)中，培養(yǎng)12-24h，至0D600達(dá)到0.2-0.5，轉(zhuǎn)入100mg/L PCP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(見實(shí)施例1)中，28-30°C，130-150rpm振蕩培養(yǎng)4-5d (天)，取菌液5mL，轉(zhuǎn)入含有100mg/L PCP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(見實(shí)施例1)中，同樣條件下培養(yǎng)至菌株生長。重復(fù)上述操作，至培養(yǎng)基中PCP的終濃度達(dá)200mg/L。
[0035]將上述活化后的菌液，按照I-2wt%的接種量，接種于PCP濃度為100mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(見實(shí)施例1)中，28-30°C，130-150rpm振蕩培養(yǎng)。分別于接種后第0，24，48，72，96，120，144，168h，取菌液測定菌體的濃度(600nm吸光值)。分別取上述時間點(diǎn)的培養(yǎng)基8-10ml，10000-13000rpm室溫離心3-5min，上清液用0.22 μ m的濾膜過濾后，加入丙酮和二氯甲烷的混合液(體積比:丙酮/ 二氯甲烷=1/2-3)萃取三次。每次加入混合液的量分別為上清液體積I倍，0.5倍，0.5倍。將萃取液混合，避光，氮吹干燥。用無水甲醇溶解，定容至2mL。高效液相色譜法(HPLC)測定PCP殘留量(HPLC條件:cl8柱子，柱溫25°C，進(jìn)樣量5μ 1，流速lml/min，紫外檢測波長為219nm，流動相甲醇:2g/L乙酸銨=7:3)。其PCP降解率與菌株的生長量關(guān)系。當(dāng)培養(yǎng)液中PCP終濃度為100mg/L，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)液pH=7.4的條件下，0C9菌株在24h到達(dá)對數(shù)生長期，96h到達(dá)穩(wěn)定期，最高菌液濃度為0D_=0.4。伴隨細(xì)菌的生長，PCP的降解率逐步提高，至72h PCP的降解率達(dá)90%，然后隨著細(xì)菌生長狀態(tài)的穩(wěn)定和新老交替，降解率緩慢提升，至測定終點(diǎn)168h，降解率達(dá) 93% (圖1)。`
[0036]實(shí)施例3:降解條件測定
[0037]按照實(shí)施例2中菌株0C9的培養(yǎng)方法，將0C9馴化后，改變培養(yǎng)基中PCP的終濃度為100，300，400mg/L，測定菌體生長情況及PCP降解率。在培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)液pH=7.4的條件下，培養(yǎng)96h時，在PCP濃度100-300mg/L范圍內(nèi)，環(huán)境中PCP濃度的增加使得0C9的細(xì)菌濃度略有上升，但不明顯。而當(dāng)濃度超過300mg/L時，0C9的生長明顯受到抑制。說明PCP對于其降解菌具有較強(qiáng)的抑制生長的效果。伴隨PCP濃度的增加，0C9對于PCP的單位時間的降解能力顯著下降。說明對于低濃度的PCP，該菌具有較好的降解效果(圖2)。
[0038]將0C9接入含有100mg/L PCP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(見實(shí)施例1)中，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為30°C，改變培養(yǎng)基的pH分別為6.4,7.4,8.4，測定0C9的生長情況及PCP降解率，顯示在中性條件下，0C9的生長和降解能力最好(圖3)。
[0039]實(shí)施例結(jié)果表明，當(dāng)五氯酚為唯一碳源時，該菌能很好的對五氯酚進(jìn)行降解，72h對100mg/L的五氯酚的降解率可達(dá)90%。與其它菌株相比，該菌株具有高效的PCP降解能力、很好的環(huán)境適應(yīng)能力及多種氯酚的耐受性能。該菌在五氯酚污染或氯酚類化合物復(fù)合污染水體的生物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種五氯酚降解菌，其特征在于:該降解菌為檸檬酸桿菌Citrobacter sp.，于2013年6月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC保藏，保藏編號:CGMCC N0.7817，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
2.按照權(quán)利要求1所述的五氯酚降解菌，其特征在于:該降解菌代號為0C9，菌落呈淺黃色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，顯微鏡觀察為桿狀，革蘭氏染色陰性。
3.按照權(quán)利要求1所述的五氯酚降解菌，其特征在于:該降解菌的菌株16SrDNA的GenBank 登陸號為:KF657722。
4.一種權(quán)利要求1所述的五氯酚降解菌的生產(chǎn)方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)取I-2g化工廠污水池的污泥樣品，用100-200mL無菌水稀釋； (2)取0.5-ImL稀釋液加入20-50mL液體LB培養(yǎng)基中，28-30°C，130-150rpm振蕩培養(yǎng)20-24h，形成富集培養(yǎng)菌液； 液體LB培養(yǎng)基中，IL培養(yǎng)基的成分:NaC110g，酵母膏5g，蛋白胨10g，余量為水，pH=7.0 -7.5 ; (3)在無菌操作件下，將獲得的富集培養(yǎng)菌液梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為10—1-10_8，根據(jù)需要取稀釋濃度的培養(yǎng)液10-100 μ 1，用涂布棒均勻涂布在五氯酚濃度為50-100mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基平 板上，28-30°C倒置培養(yǎng)24h-48h，獲得能夠利用五氯酚生長的菌株； 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，IL培養(yǎng)基的成分=NaCl0.5-1.0g, K2HPO4L 5-2.0g, MgSO40.5-1.0g，KH2PO40.5 -1.5g, NH4Cl0.5 -1.5g，NH4NO3L O -2.0g，酵母膏 0.05 -0.lg，余量為水，pH=6.5 -7.5。
5.按照權(quán)利要求4所述的五氯酚降解菌的生產(chǎn)方法，其特征在于，對獲得的菌株進(jìn)行五氯酚耐受性測試，將其分別點(diǎn)種在五氯酚濃度為50-250mg/L的固體選擇性平板上，挑取各平板上的優(yōu)勢菌落，繼續(xù)劃線至單菌落；將單菌落在相同條件下液體培養(yǎng)24h后，取ImL所得菌液加入30-50wt%的無菌甘油，-20-_70°C保存。
6.一種按照權(quán)利要求1所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，其特征在于:所述五氯酚降解菌應(yīng)用在氯酚類化合物污染水體生物修復(fù)中。
7.按照權(quán)利要求6所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，其特征在于:所述氯酚類化合物為五氯酚。
8.按照權(quán)利要求6所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，其特征在于:五氯酚降解菌對五氯酚的降解，合適降解條件為30°C、pH7.4。
9.按照權(quán)利要求6所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，其特征在于:將降解菌菌種活化后轉(zhuǎn)入五氯酚初始濃度為50-100mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28-30°C，130-150rpm振蕩培養(yǎng)4-5d,取菌液5mL,轉(zhuǎn)入含有100-200mg/L五氯酹的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至菌株生長；重復(fù)上述操作，至培養(yǎng)基中五氯酚的終濃度達(dá)200-400mg/L ； 所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，IL培養(yǎng)基的成分:NaC10.5-1.0g, K2HPO4L 5-2.0g,MgSO40.5 -1.0g, KH2PO40.5 -1.5g, NH4Cl0.5 -1.5g, NH4NO3L O -2.0g,酵母膏 0.05 -0.lg，余量為水，ρΗ=6.5 -7.5。
10.按照權(quán)利要求9所述的五氯酚降解菌的應(yīng)用，其特征在于:當(dāng)培養(yǎng)液中五氯酚終濃度為100mg/L，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)液pH=7.4的條件下，降解菌菌株在24h到達(dá)對數(shù)生長期，96h到達(dá)穩(wěn)定期，最高菌液濃度為0D600=0.4 ;伴隨細(xì)菌的生長，五氯酚的降解率逐步提高，至72h五氯酚的降解率達(dá)90%，然后隨著細(xì)菌生長狀態(tài)的穩(wěn)定和新老交替，降解率緩慢提升，至測定終點(diǎn)168h，降解率達(dá)93%。
【文檔編號】C12R1/01GK103451138SQ201310425870
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】焦緒棟, 秦松, 李莉莉 申請人:中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所