一種檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療sle療效的試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒，包括：檢測(cè)GR基因序列的引物；PCR擴(kuò)增酶，純化PCR產(chǎn)物的純化酶及相應(yīng)緩沖液；dNTP；單堿基延伸反應(yīng)酶及相應(yīng)的緩沖液。GR基因分型結(jié)果中rs10482672多態(tài)性位點(diǎn)為T(mén)（CT+TT）的患者療效差，rs4912905多態(tài)性位點(diǎn)為C（GC+CC）的患者療效好，rs17100234多態(tài)性位點(diǎn)為A（CA+AA）的患者療好，rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)為A（AA）的患者療效差。本發(fā)明提供了一種基于GR基因多態(tài)性檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒和方法，為實(shí)現(xiàn)SLE患者的個(gè)體化治療提供新的思路和方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒，具體涉及一種基于GR基因多態(tài)性檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒和方法，屬于醫(yī)藥衛(wèi)生【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，世界范圍內(nèi)SLE的發(fā)病率約為50/10萬(wàn)，我國(guó)約為70/10萬(wàn)。該病多見(jiàn)于女性，男女發(fā)病率比約為1:9。近年來(lái)，SLE發(fā)病率和患病率不斷升高，對(duì)青中年女性的身心健康造成了很大危害，已經(jīng)成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。SLE的藥物治療主要以糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GC)為主。GC具有強(qiáng)大的抗炎和免疫抑制作用，其主要作用機(jī)制是基因調(diào)控途徑，即與細(xì)胞衆(zhòng)內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)相結(jié)合,形成GC-GR復(fù)合物，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)基因調(diào)控機(jī)制發(fā)揮作用。可見(jiàn)，GR是GC發(fā)揮生理和藥理作用的重要環(huán)節(jié)。
[0004]制定個(gè)體化治療方案是SLE治療的基本原則。臨床實(shí)踐表明GC的臨床療效存在極大的個(gè)體化差異，有相當(dāng)一部分患者病情不能迅速得到緩解。同時(shí)，GC的應(yīng)用結(jié)果像一把雙刃劍，在取得療效的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致許多不良反應(yīng)，有的不良反應(yīng)甚至?xí)苯訉?dǎo)致患者死亡。這給SLE患者的臨床合理用藥帶來(lái)嚴(yán)重困難。目前，臨床醫(yī)生對(duì)SLE患者是否應(yīng)該給予GC治療，治療后在病程不同階段應(yīng)該使用何種劑量，病情穩(wěn)定后應(yīng)該如何調(diào)整劑量等都還主要依靠臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行嘗試性治療，導(dǎo)致相當(dāng)一部分病人不能適時(shí)的得到最佳治療。
[0005]藥物基因組學(xué)是 繼人類(lèi)基因組計(jì)劃完成之后出現(xiàn)的功能基因組學(xué)研究的一個(gè)分支，它的出現(xiàn)對(duì)于提高藥物療效，減輕不良反應(yīng)具有重要的意義。藥物基因組學(xué)介導(dǎo)的個(gè)體化用藥就是藥物治療在充分考慮每個(gè)病人的遺傳因素基礎(chǔ)上制定安全、合理、有效、經(jīng)濟(jì)的藥物治療方案。近年，國(guó)際權(quán)威雜志《N Engl J Med》、《SCienCe》等刊登的研究證據(jù)表明藥物基因組學(xué)研究在轉(zhuǎn)化應(yīng)用中能夠迅速獲得回報(bào)。藥物基因組學(xué)的主要手段是檢測(cè)相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(single neucleotide polymorphism, SNP)。這種SNP可能會(huì)影響到其所表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，或者影響蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，進(jìn)而影響與其相互作用的外源性分子的效應(yīng)，即藥物療效。不久的將來(lái)，患者基因型將成為確定患者個(gè)體化治療的重要依據(jù)。
[0006]當(dāng)前，迫切需要風(fēng)濕科醫(yī)生治療SLE病人時(shí)能夠在充分考慮每個(gè)病人的遺傳因素基礎(chǔ)上制定安全、合理、有效、經(jīng)濟(jì)的藥物治療方案。GR是GC發(fā)揮生理和藥理作用的重要環(huán)節(jié)，目前本領(lǐng)域缺乏基于GR基因(NR3C1)多態(tài)性檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的方法和試劑盒。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的是提供一種基于GR基因多態(tài)性檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒和方法。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種基于GR基因多態(tài)性檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒，包括以下試劑，保存溫度為_(kāi)20°C:
(1)檢測(cè)GR基因序列的引物；
(2)PCR擴(kuò)增酶，純化PCR產(chǎn)物的純化酶及相應(yīng)緩沖液；
(3)dNTP ；
(4)單堿基延伸反應(yīng)酶及相應(yīng)的緩沖液。
[0010]所述的檢測(cè)GR基因序列的引物包括擴(kuò)增基因序列多態(tài)性位點(diǎn)的引物以及單堿基延伸基因序列多態(tài)性位點(diǎn)的延伸引物。
[0011]所述的GR基因序列的分子標(biāo)記為rsl0482672，rs4912905, rsl7100234和rs7701443。
[0012]所述的擴(kuò)增rsl0482672多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
5’ - CAAAGCAGGGCTGGGCTTTACT -3’
5’ - TGTTGTGTTTGCAT ATCCATGAGAGTT -3’
所述的擴(kuò)增rs4912905多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
5， - GAAGAACTTGCCAAGAGGCTAGAGAA -3，
5’ - CAATTCATTGACCTTACAGAATCACTGG -3’
所述的擴(kuò)增rsl7100234多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
5， - GCATAAAGCCAAAACCTGAAAAGAAGA -3，
5， - AAATGGGGCCAGCCTACAACTG -3，
所述的擴(kuò)增rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
5’ - GCTACCAATGACTAACACTTTGAGGATTCA -3’
5’ - CCGTATCTGTCTCCATTTCCTCCA -3’。
[0013]所述的單堿基延伸rsl0482672多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
5’ _ TTTTTTTTTTTTTTGCCATCCTTGTAATCTTTGTGGT -3’
所述的單堿基延伸rs4912905多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
GGTTTCTGTGACACAATTCTGTTT -3’
所述的單堿基延伸rsl7100234多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
AATAGCGTCAACCAGTCATTTCA -3，
所述的單堿基延伸rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
5’ - TTTCCCAGTATAAGGCTGCAGGG -3’。
[0014]本發(fā)明還提供了一種基于GR基因多態(tài)性檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的方法，包括以下步驟:
(1)DNA的提?。?br> (2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(3)純化反應(yīng)；
(4)單堿基延伸反應(yīng)；
(5)基因分型；
(6)療效判斷:GR基因分型結(jié)果中rsl0482672多態(tài)性位點(diǎn)為T(mén)(CT+TT)的患者療效差，rs4912905多態(tài)性位點(diǎn)為C (GC+CC)的患者療效好，rsl7100234多態(tài)性位點(diǎn)為A (CA+AA)的患者療好，rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)為A (AA)的患者療效差。
[0015]所述PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中包括有 rsl0482672，rs4912905, rsl7100234, rs7701443 四對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)的引物。
[0016]所述單堿基延伸反應(yīng)中包括有rsl0482672，rs4912905, rsl7100234, rs7701443四條單堿基延伸多態(tài)性位點(diǎn)的引物。
[0017]所述的糖皮質(zhì)激素包括但不限于潑尼松、氫化可的松、可的松、強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍、甲強(qiáng)龍、甲基潑尼松、對(duì)氟米松、氟潑尼松龍、氯地米松、地塞米松、倍他米松等。
[0018]所述的療效為患者治療后臨床癥狀是否緩解,緩解為療效好，沒(méi)有緩解為療效差。
[0019]本發(fā)明通過(guò)前瞻性的隊(duì)列研究提出了基于GR基因rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的方法和試劑盒。根據(jù)rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型的患者臨床療效的差異，進(jìn)行了卡方檢驗(yàn)和回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinburg平衡；rsl0482672，rs4912905,rsl7100234和rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)和糖皮質(zhì)激素治療SLE的療效之間存在顯著關(guān)聯(lián)，rsl0482672，rs4912905，rsl7100234和rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)能夠用來(lái)檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE的療效，其中，rsl04826`72多態(tài)性位點(diǎn)為T(mén) (CT+TT)的患者療效差，rs4912905多態(tài)性位點(diǎn)為C (GC+CC)的患者療效好，rsl7100234多態(tài)性位點(diǎn)為A (CA+AA)的患者療好，rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)為A (AA)的患者療效差。
[0020]本發(fā)明提供了一種基于GR基因多態(tài)性檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒和方法，為實(shí)現(xiàn)SLE患者的個(gè)體化治療提供了新的思路和方法，有利于風(fēng)濕科醫(yī)生治療SLE病人時(shí)，能夠在充分考慮每個(gè)病人的遺傳因素基礎(chǔ)上制定安全、合理、有效、經(jīng)濟(jì)的藥物治療方案。
[0021]
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解為，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。
[0023]本發(fā)明的基于GR基因多態(tài)性檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒由以下試劑組成:
(I)擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)的引物；
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)糖皮質(zhì)激素治療SLE療效的試劑盒，其特征在于，包括以下試劑，保存溫度為-20 0C: (1)檢測(cè)GR基因序列的引物， (2)PCR擴(kuò)增酶，純化PCR產(chǎn)物的純化酶及相應(yīng)緩沖液，
(3)dNTP, (4)單堿基延伸反應(yīng)酶及相應(yīng)的緩沖液； 所述的檢測(cè)GR基因序列的引物包括擴(kuò)增基因序列多態(tài)性位點(diǎn)的引物，以及單堿基延伸基因序列多態(tài)性位點(diǎn)的延伸引物； 所述的基因序列的分子標(biāo)記為rsl0482672，rs4912905, rsl7100234和rs7701443 ； 所述的擴(kuò)增rsl0482672多態(tài)性位點(diǎn)的引物: ， 5’ - CAAAGCAGGGCTGGGCTTTACT -3’ ， 5’ - TGTTGTGTTTGCATATCCATGAGAGTT -3’ 所述的擴(kuò)增rs4912905多態(tài)性位點(diǎn)的引物: ， 5， - GAAGAACTTGCCAAGAGGCTAGAGAA -3，
，5’ - CAATTCATTGACCTTACAGMTCACTGG -3’ 所述的擴(kuò)增rsl7100234多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
，5， - GCATAAAGCCAAAACCTGAAAAGAAGA -3，
，5， - AAATGGGGCCAGCCTACAACTG -3， 所述的擴(kuò)增rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
，5’ - GCTACCAATGACTAACACTTTGAGGATTCA -3’
，5’ - CCGTATCTGTCTCCATTTCCTCCA -3’ ； 所述的單堿基延伸rsl0482672多態(tài)性位點(diǎn)的引物: ， 5’ _ TTTTTTTTTTTTTTGCCATCCTTGTAATCTTTGTGGT -3’ 所述的單堿基延伸rs4912905多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
，5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
GGTTTCTGTGACACAATTCTGTTT -3’ 所述的單堿基延伸rsl7100234多態(tài)性位點(diǎn)的引物:
， 5，rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
AATAGCGTCAACCAGTCATTTCA -3， 所述的單堿基延伸rs7701443多態(tài)性位點(diǎn)的引物: ， 5’ - TTTCCCAGTATAAGGCTGCAGGG -3’。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103468812SQ201310426341
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】鄒延峰, 葉冬青, 徐建華 申請(qǐng)人:安徽醫(yī)科大學(xué)