與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及其獲取方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，采用標(biāo)記引物Xbarc192和Xbarc253對(duì)小麥品種京411的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為200bp和186bp，即為小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)QTss.cas-7A的分子標(biāo)記。本發(fā)明所提供的小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記可用于檢測(cè)小麥品種或品系中是否含有增加小穗數(shù)的主效基因位點(diǎn)QTss.cas-7A，以便快速篩選出具有該基因位點(diǎn)的小麥品種或品系用于育種，可大大加快小麥高產(chǎn)品種的選育進(jìn)程。
【專利說明】與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及其獲取方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及小麥分子生物技術(shù)與育種應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說是一種與增加小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及其獲取方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪饕募Z食作物之一，也是我國(guó)第二大糧食作物，其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)直接影響到我國(guó)人們生活水平和國(guó)家糧食安全。提高小麥單產(chǎn)、培育高產(chǎn)新品種是確保我國(guó)小麥總產(chǎn)水平、保障糧食安全的根本出路。小麥產(chǎn)量性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)(Quantitative trait locus, QTL)控制,具有遺傳力低、受環(huán)境影響大、選擇難度高的特性，所以在選育高產(chǎn)小麥品種時(shí)，傳統(tǒng)的育種方法常存在時(shí)間長(zhǎng)、耗費(fèi)大、成本高、成果小的問題。分子標(biāo)記輔助育種是一種采用與特定性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記作為輔助手段進(jìn)行育種的有效方法，具有不受環(huán)境條件限制、在植物發(fā)育的各個(gè)組織和生育時(shí)期均可檢測(cè)、選擇效率高的優(yōu)勢(shì)。
[0003]穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重是小麥產(chǎn)量構(gòu)成的三要素。數(shù)十年來，在提高小麥產(chǎn)量方面，通過增加穗數(shù)和千粒重來提高小麥產(chǎn)量已經(jīng)取得較大進(jìn)展，目前較難取得進(jìn)一步突破；而通過增加穗粒數(shù)仍能繼續(xù)提高產(chǎn)量潛力(何中虎等，作物學(xué)報(bào)，2011，37:202-215)。小穗數(shù)是穗粒數(shù)的重要構(gòu)成因素，提高小穗數(shù)可以有效增加穗粒數(shù)進(jìn)而提高小麥產(chǎn)量。因此，研究小穗數(shù)基因，通過分子標(biāo)記技術(shù)，提高小麥穗粒數(shù)獲得高產(chǎn)小麥新品種，在育種工作中具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是提供一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記及其獲取方法和應(yīng)用，通過發(fā)明獲得的與小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，來檢測(cè)小麥品種或品系中是否具有增加小穗數(shù)的基因位點(diǎn)，以加快小麥高產(chǎn)品種的選育進(jìn)程。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明所提供的一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記為油似和油arc為?，其所述分子標(biāo)記油似的左端引物序列如SEQ ID NO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO: 2所述；所述分子標(biāo)記油ardM的左端引物序列如SEQ ID NO: 3所述、右端引物序列如SEQ ID N0:4所述。
[0006]一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取方法，它包括以下步驟:米用分子標(biāo)記Xbarcl似的引物，
左端引物序列 GCGAATAGCACTATGGTAAACATTGAGGTAC (如 SEQ ID 勵(lì):1所述)、
右端引物序列 GCGGGTTCAATTATCAAAAGGCACAG (如 SEQ ID NO:2 所述)
和分子標(biāo)記Xbarc253的引物，
左端引物序列 GGGAAGACACGACACGACTC (如SEQ ID勵(lì):3所述)、右端引物序列 TCGTAAGATTACCTCGGATGAAGAA (如 SEQ ID NO:4 所述)
對(duì)小麥品種京411的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 4 11101/1)各1.0 μ I, IOXBuffer 2.0 μ I,Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 yl，Taq 酶(5 U/μ 1)0.2 μ l,dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ I,DNA (30 ng/μ I) 2.0 口1，其余用(1(1!120補(bǔ)足；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性7 min;94°C變性30 s，50°C退火45 s，72°C延伸60 s,34個(gè)循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)；擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為200 bp和186 bp，即得到與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)QTss.cas~7A緊密連鎖的分子標(biāo)記。
[0007]本發(fā)明所述的與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記在選育高產(chǎn)小麥中的應(yīng)用，即為將與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記用于檢測(cè)小麥品種或品系的方法，該方法它包括以下步驟:
a.用Xbarc192和Xbarc253的標(biāo)記引物對(duì)小麥品種或品系的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 μ mol/L)各1.0 μ 1，IOXBuffer 2.0μ 1，Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 μ 1，Taq 酶(5 U/μ I) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ I,DNA (30 ng/μ 1)2.0 μ 1，其余用ddH20補(bǔ)足;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性7 min ;94°C變性30 s，50°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)；
b.將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如油似的擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為200 bp的分子標(biāo)記和油的擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為186 bp的分子標(biāo)記同時(shí)出現(xiàn)，則該小麥品種或品系為具有增加小穗數(shù)的基因位點(diǎn)cas~7A的品種或品系，否則，該小麥品種或品系屬于不具有該基因位點(diǎn)的品種或品系。
[0008]本發(fā)明提供的與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記的篩選方法，它包括以下步驟:
(i)以小麥品種小偃54為母本、京411為父本進(jìn)行雜交得到FnF1自交產(chǎn)生F2，采用單粒傳法獲得含有182個(gè)株系的F7代RIL群體；
(ii)用SDS法(Sharpet al.，1989)提取所述RIL群體各株系的DNA，采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR標(biāo)記)、基于表達(dá)序列標(biāo)簽的SSR標(biāo)記(EST-SSR)和Glu標(biāo)記對(duì)所述株系進(jìn)行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
(iii)利用MAPMAKER3.0作圖軟件將獲得的所述RIL群體的基因型資料構(gòu)建小麥的分子遺傳圖譜，其LOD 3.0 ；
(iv)將所述RIL群體進(jìn)行田間種植，并對(duì)RIL群體的各株系分別進(jìn)行表型調(diào)查，獲得各株系的小穗數(shù)的特征數(shù)據(jù)；
(v)利用基于混合線性模型的QTLNetwork2.1作圖軟件對(duì)每個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型資料與對(duì)應(yīng)每個(gè)株系的小穗數(shù)進(jìn)行連鎖分析，在/7 ( 0.001時(shí)，染色體7A上的小穗數(shù)QTL的峰值均在區(qū)間；
(vi)其油似和油ardM標(biāo)記引物在小麥品種京411的DNA中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為200 bp和186 bp，即為與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記。
[0009]本發(fā)明所述小麥品種京411的DNA是指對(duì)小麥品種京411植株的葉片分離提取后獲得的DNA。
[0010]本發(fā)明所述小麥品種京411和小偃54均為審定品種。其中京411于1991年通過北京市品種審定；1992年通過天津市、山西省和全國(guó)品種審定；京411可以從國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源庫(kù)索取，全國(guó)統(tǒng)一編號(hào)為ZM020984。小偃54于2000年通過陜西省品種審定，該品種可以從江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用研究中心索取，編號(hào)為蘇4394。
[0011]本發(fā)明所述8%聚丙烯酰胺凝膠是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8 g丙烯酰胺和0.2 g的甲叉丙烯酰胺。
[0012]本發(fā)明公開的小麥小穗數(shù)緊密連鎖的分子標(biāo)記Xbarc 192和Xbarc253充分體現(xiàn)了小麥品種或品系的小穗數(shù)的主效基因位點(diǎn)，通過該分子標(biāo)記對(duì)小麥衍生品種或品系PCR擴(kuò)增，可以很快捷地對(duì)小麥品種或品系是否具有小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)QTss.cas-7A進(jìn)行判斷，從而快速篩選出具有該基因位點(diǎn)的小麥品種或品系，加快高產(chǎn)小麥品種的選育進(jìn)程。
[0013]將本發(fā)明提供的與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)QTss.cas-7A緊密連鎖的分子標(biāo)記方法用于小麥育種，不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提聞了聞廣小麥品種或品系的選擇效率和質(zhì)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)QTss.cas-7A在染色體7A上的作圖區(qū)間。[0015]圖1中:空心長(zhǎng)方形代表染色體，右側(cè)是分子標(biāo)記的名稱，左側(cè)數(shù)字是標(biāo)記之間的遺傳距離，單位是CM ;標(biāo)有黑色下劃線的標(biāo)記為尬似和尬;染色體左下方的灰色填充的長(zhǎng)方形表示QTL作圖區(qū)間，TSS代表小麥小穗數(shù)。
[0016]圖2為小麥品種京411為親本的F7代RIL群體的10個(gè)衍生品系用Xbarc 192標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳條帶圖。
[0017]圖3為小麥品種京411為親本的F7代RIL群體的10個(gè)衍生品系用Xbarc253標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳條帶圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面實(shí)施例用于進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0019]實(shí)施例1
一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，
采用標(biāo)記引物Xbarc 192,
左端引物序列 GCGAATAGCACTATGGTAAACATTGAGGTAC (如 SEQ ID NO:1 所述)
右端引物序列 GCGGGTTCAATTATCAAAAGGCACAG (如 SEQ ID NO:2 所述)
和標(biāo)記引物油
左端引物序列 GGGAAGACACGACACGACTC (如 SEQ ID NO:3 所述)
右端引物序列 TCGTAAGATTACCTCGGATGAAGAA (如 SEQ ID NO:4 所述)
對(duì)小麥品種京411的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 μ mol/L)各 1.0 μ I, IOXBuffer 2.0 μ I,Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 yl，Taq 酶(5U/μ I) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ 1，DNA (30 ng/μ I) 2.0 口1，其余用(1(1!120補(bǔ)足；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性7 min;94°C變性30 s，50°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)；所使用的PCR儀型號(hào)為:Applied BiosystemsVeriti Thermal Cycler (本發(fā)明中所有PCR擴(kuò)增均采用該型號(hào)PCR儀)；擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為200 bp和186 bp，即為小麥小穗數(shù)主效QTL的分子標(biāo)記。
[0020]本發(fā)明提供的與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)QTss.cas~7A緊密連鎖的分子標(biāo)記的篩選方法，它包括以下步驟:
(i)以小麥品種小偃54為母本、京411為父本進(jìn)行雜交得到雜種FnF1自交產(chǎn)生F2，采用單粒傳法獲得含有182個(gè)株系的F7代RIL群體；
(ii)用SDS法(Sharpet al.，1989)提取上述RIL群體各株系的DNA，采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR標(biāo)記)和基于表達(dá)序列標(biāo)簽的簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(EST-SSR標(biāo)記)對(duì)所述株系進(jìn)行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
其中SSR、EST-SSR和Glu標(biāo)記標(biāo)記分析是將篩選株系的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在所述8%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離分析，根據(jù)分子標(biāo)記篩選結(jié)果，篩選出親本間有多態(tài)的引物，親本間有多態(tài)的引物在所選RIL群體的株系中進(jìn)行分析，獲得所述RIL群體的基因型資料
(iii)利用MAPMAKER3.0作圖軟件，將獲得的RIL群體的基因型資料構(gòu)建具有555個(gè)標(biāo)記的小麥的分子遺傳圖譜，以LOD ^3.0為標(biāo)準(zhǔn)；其中555個(gè)標(biāo)記是由523個(gè)SSR、18個(gè)EST-SSR和14個(gè)Glu位點(diǎn)組成；
(iv)將RIL群體進(jìn)行了兩年共六個(gè)試驗(yàn)環(huán)境的田間種植及表型鑒定，分別考查不同年份和不同環(huán)境條件下的各個(gè)株系的小穗數(shù)，其中兩年六個(gè)試驗(yàn)環(huán)境即2006年對(duì)照處理、2006年低氮處理、2006年低磷處理、2007年對(duì)照處理、2007年低氮處理和2007年低磷處理。
[0021]其中小麥種植方法:RIL群體中每個(gè)株系種植4行，行長(zhǎng)1.5 m、行間距0.25 m、每行種植30粒種子，正常生長(zhǎng)及收獲；小穗數(shù)測(cè)定方法:將收獲后各株系的小麥穗子取10穗調(diào)查小穗數(shù)，重復(fù)3次，取平均值計(jì)算小穗數(shù)。
[0022](V)利用基于混合線性模型的QTLNetwork 2.1作圖軟件，以/7 ( 0.001為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)分子標(biāo)記的群體基因型資料與對(duì)應(yīng)每個(gè)株系的小穗數(shù)進(jìn)行連鎖分析并作圖；
(vi)由QTL分析可得:在染色體7A上分別發(fā)現(xiàn)5個(gè)環(huán)境條件下重復(fù)出現(xiàn)小穗數(shù)QTL峰值的區(qū)間為Xbarc 192-Xbarc253,如圖1、表I所示。
[0023]表I小穗數(shù)基因位點(diǎn)QTss.cas~7A的定位結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)吸ks.cas~7A緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記為Xbarc 192和Xbarc253，其所述分子標(biāo)記Xbarc 192的左端引物序列如SEQ IDNO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO: 2所述；所述分子標(biāo)記油的左端引物序列如SEQ ID NO:3所述、右端引物序列如SEQ ID N0:4所述。
2.一種與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)cas~7A緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于它包括以下步驟: 以Xbarc 192 MXbarc253標(biāo)記引物對(duì)小麥品種京411的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為 20 μ 1，包括:左、右端引物(10 ymol/L)各 1.0 μ I, IOXBuffer 2.0 μ l,Mg2+(25 mmol/L) 1.2 μ 1，Taq 酶(5 U/μ I) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ 1，DNA (30ng/μ 1)2.0 μ 1，其余用ddH20補(bǔ)足；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性7 min ;94°C變性30 s,50°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)；擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量分別為200 bp和186 bp，即為小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)吸ks.cas~7A的分子標(biāo)記；其中油似標(biāo)記左端引物序列如SEQ ID NO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO: 2所述標(biāo)記左端引物序列如SEQ ID NO:3所述、右端引物序列如SEQ ID N0:4所述。
3.—種檢測(cè)小麥品種或品系的方法，其特征在于它包括以下步驟: a.用Xbarc192和油ardM的標(biāo)記引物對(duì)待測(cè)小麥品種或品系的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 ymol/L-l.0 μ I, IOXBuffer2.0 μ 1，Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 μ 1，Taq 酶(5 U/μ I) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6μ 1，DNA (30 ng/μ 1)2.0 μ 1，其余用 ddH20 補(bǔ)足;PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性 7 min ；94°C變性30 s，50°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72°C后延伸7 min ;最后10°C終止反應(yīng)； b.將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如油似的擴(kuò)增產(chǎn)物中分子量大小為200 bp的擴(kuò)增片段的擴(kuò)增產(chǎn)物中分子量大小為186 bp的擴(kuò)增片段同時(shí)出現(xiàn)，則該待測(cè)小麥品種或品系為具有增加小穗數(shù)的主效基因位點(diǎn)的品種或品系，否則，該待測(cè)小麥品種或品系屬于不具有該位點(diǎn)的品種或品系。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)吸ks.緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于所述小麥品種京411的DNA是指對(duì)小麥品種京411植株的葉片分離提取后獲得的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與小麥小穗數(shù)主效基因位點(diǎn)QTss.cas~7A緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于所述8%聚丙烯酰胺凝膠是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7.8 g丙烯酰胺和0.2 g的甲叉丙烯酰胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)小麥品種或品系的方法，其特征在于所述的小麥的品種或品系為以小麥品種京411為親本，通過采用常規(guī)雜交并繁衍至F2代以上獲得的小麥品種或品系。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103451183SQ201310427312
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】安調(diào)過, 許云峰, 王瑞芳, 童依平, 劉冬成, 張愛民, 李濱 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所