一種安福霉素類化合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種安福霉素類化合物及其制備方法，所述方法如下：將鏈霉菌菌株的單孢子在新鮮的天冬氨酸瓊脂斜面培養(yǎng)，菌株斜面培養(yǎng)成熟后接種于種子培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液進(jìn)行大孔樹脂吸附柱層析，得到粗提物；將粗提物用水懸浮，用等體積正丁醇萃取，加入等體積蒸餾水，充分振蕩混勻后兩相分離取水相；將水相液濃縮后進(jìn)行中壓反相硅膠柱層析以獲得二次粗產(chǎn)物，并分部收集安福霉素類化合物。本發(fā)明通過微生物發(fā)酵制得一種新的安福霉素類化合物，其具有抗菌性。
【專利說明】一種安福霉素類化合物及其制備方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及一種安福霉素類化合物及其制備方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]隨著抗菌藥物的大量使用，不少致病菌出現(xiàn)多重耐藥性。例如，由革蘭氏陽性菌，如抗萬古霉素腸球菌(VRE)和抗甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和青霉素耐受性肺炎鏈球菌(PRSP)等引起的感染(包括醫(yī)院內(nèi)感染)正在增加。耐藥性問題的發(fā)生和蔓延已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人類的健康，因此篩選新結(jié)構(gòu)、新作用機(jī)制的抗菌藥物成為近年來研究的重點。
[0003]環(huán)脂肽類抗菌素是一類對抗革蘭氏陽性耐藥菌非常有效的重要抗菌素。其中，Daptomycin[Debono M, Barnhart M, Carrell C B, et al.A21978C, a complex of newacidic peptide antibiotics:1solation, chemistry and mass spectral structureelucidation[J].J Antibiot, 1980, 42(6):761-777.]是第一個用于臨床的環(huán)脂肽類抗菌素，于2003年在美國成功上市，具有高殺菌性和快速作用性，對多種耐藥菌均有抗菌作用，包括但不限于VRE和MRSA等耐藥菌。Daptomycin具有獨特的作用機(jī)制，耐藥株出現(xiàn)幾率很低。在鈣離子存在的條件下，達(dá)托霉素以非共價鍵的形式結(jié)合到細(xì)胞膜蛋白上，擾亂細(xì)胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的磷壁(酸)脂質(zhì)(LTA)的生物合成，改變細(xì)胞質(zhì)膜的性質(zhì)；另外，它還能通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，使其內(nèi)容物外泄而達(dá)到殺滅細(xì)菌的目的[Alborn WEJr, Allen NE, Preston DA.Daptomycin disrupts membranepotential in growing Staphylococcus aureus[J].Antimicrob Agent s Chemother, 1991,35(11):2282]。尤為重要的是，daptomycin是近四十年來應(yīng)用到臨床的唯一化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制全新的抗生素，Daptomycin的成功使得環(huán)脂肽類化合物,成為當(dāng)今新抗菌素篩選和研發(fā)的熱點。
[0004]安福霉素(Amphomycin)[Heinemann B, Kaplan M A, Muir R D, etal.Amphomycin, a new antibiotic [J].Antibiot Chemother, 1953，3:1239 - 1242.]發(fā)現(xiàn)于上個世紀(jì)50年代，研究表明其具有廣泛的抗革蘭氏陽性菌作用。隨后，研究人員又發(fā)現(xiàn)了一系列與其在理化性質(zhì)、抗菌活性相近的環(huán)脂肽化合物，如aspartocin, tsushimycin,laspartocin, friulimicin B 等[Baltz R.H., Miao V.&ffrigley S.K.(2005).Naturalproducts to drugs:daptomycin and related lipopeptide antibiotics.Nat.Prod.Rep.22(6),717-741.]。這一類化合物均由氨基酸組成環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)，只是氨基酸種類以及數(shù)量，或側(cè)鏈脂肪鏈不盡相同。Amphomycin因其有溶血作用而不能用藥,但其與daptomycin相比，具有更好的治療指數(shù)[V.J.Leea.Ant1-gram positive agents of naturalproduct origin[J].Co mprehensive Medicinal Chemistry II.2007，7，653-671.]。以amphomycin結(jié)構(gòu)為骨架，對其進(jìn)行修飾，有助于發(fā)現(xiàn)更多有效的抗菌藥物。Cameron 等[ffacowich-Sgarbi,S A,Boyd V A,Cameron D R, et al.Synthesis andStructure - Activity Relationship (SAR) Studies on Dab-9Substitutions of theLipopeptide Antibiotic Amphomycin.229th American ChemicalSociety Meeting, SanDiego, CA, Mar 13 - 17, 2005; Abs367.]對 amphomycin 結(jié)構(gòu)中 9 位的 Dab 以及脂肪鏈進(jìn)行修飾，得到化合物M-1396，其抗菌活性與daptomycin相當(dāng)。溫哥華MIGENIX生物制藥公司研發(fā)了 amphomycin 半合成衍生物 MX-2401 [MIGENIX Inc.MIGENIX Reports.Effectiveness ofMX-2401in Pneumonia Model[R].Vancouver, BC, Canada&San Diego, CA, USA, 2005, June23/PRNewswire.]，其結(jié)構(gòu)與amphomycin相似，僅側(cè)鏈脂肪酸和肽環(huán)中一個氨基酸有差異。Rubinchik 等[Rubinchik E, Schneider T, et al.Mechanism of Action andLimited Cross-Resistance of New Lipopeptide MX-2401.Antimicrob[J].AgentsChemother, 2011, 55(6):2743 - 2754.]對MX-2401的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其通過結(jié)合十一戊烯磷酸基質(zhì)(C55-P)來抑制肽聚糖的合成，抑制細(xì)胞壁前體Iipid I和lipid II以及細(xì)胞壁磷酸前體lipid III的合成，與達(dá)托霉素機(jī)制不同。Dominique等[Dominique
D,Haiyan Y, et al.Antimicrobial Properties of MX-2401, an Expanded-SpectrumLipopeptide Active in the Presence of Lung Surfactant[J].Antimicrob AgentsChemother, 2011，55(8):3720 - 3728.]研究了 MX-2401 的抗菌活性，結(jié)果表明 MX-2401 對VRE, MRSA、MSSA、MRSE等具有很好的抗菌能力，并且對支氣管肺泡肺炎動物模型有良好的治療作用。再者，MX-2401與daptomycin相比，具有更長的抗生素后效應(yīng)和半衰期,減少了給藥次數(shù)，從而減少了藥物毒性，有望成為另一個臨床運(yùn)用的環(huán)脂肽類化合物。因此，amphomycin及其類似物的研究對新藥開發(fā)具有極其重要的意義。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一，在于提供一種安福霉素類化合物，其為一種新的安福霉素類化合物，具有抗菌性。
[0006]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)上述技術(shù)問題之一的:
[0007]—種安福霉素類化合物， 所述安福霉素類化合物的分子結(jié)構(gòu)式如下:
[0008]
【權(quán)利要求】
1.一種安福霉素類化合物，其特征在于:所述安福霉素類化合物的分子結(jié)構(gòu)式如下:



2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種安福霉素類化合物的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 步驟一:將暗灰鏈霉菌菌株(Streptomyces canus) FIM-0916的單孢子在新鮮的天冬氨酸瓊脂斜面培養(yǎng)，菌株斜面培養(yǎng)成熟后接種于種子培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到暗灰鏈霉菌菌株(Streptomyces canus) FIM-0916發(fā)酵液； 步驟二:將步驟一所獲得的暗灰鏈霉菌菌株(Streptomyces canus)FIM-0916發(fā)酵液進(jìn)行大孔樹脂吸附柱層析，得到粗提物； 步驟三:將步驟二所獲得的粗提物用水懸浮，調(diào)PH至2-3，用等體積正丁醇萃取，正丁醇層調(diào)PH至7-8，加入等體積蒸餾水，充分振蕩混勻后兩相分離取水相； 步驟四:將步驟三所獲得的水相液濃縮后進(jìn)行中壓反相硅膠柱層析以獲得二次粗產(chǎn)物，進(jìn)行中壓反相硅膠柱層析時，先采用體積分?jǐn)?shù)為10%乙腈含0.1%三氟乙酸的水溶液為流動相平衡20分鐘后，然后流動相采用體積比10%~70%的乙腈-90%~30%含0.1%三氟乙酸的水溶液系統(tǒng)梯度洗脫120min，分部收集安福霉素類化合物，流動相的流速為5ml/min ;最后根據(jù)高效液相色譜檢測分部收集液； 所述暗灰鏈霉菌菌株(Streptomyces canus)FIM-0916,于2013年6月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.7792。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種安福霉素類化合物的制備方法，其特征在于:所述步驟一具體為: 將暗灰鏈霉菌菌株(Streptomyces canus)FIM-0916的單孢子在新鮮的天冬氨酸瓊脂斜面30°C培養(yǎng)7-10天；待暗灰鏈霉菌菌株(Streptomyces canus) FIM-0916斜面培養(yǎng)成熟后接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)40~48h，溫度30°C，轉(zhuǎn)速250r/min ;然后按1.0%的移種量將所獲得的種子液轉(zhuǎn)接入已消毒滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)110~130h，溫度 28°C，轉(zhuǎn)速 250r/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種安福霉素類化合物的制備方法，其特征在于: 所述斜面培養(yǎng)基的組分及其含量如下:酵母提取物4.0%，麥芽提取物10.0%，葡萄糖4.0%，瓊脂18.0%，蒸餾水IL ;且所述斜面培養(yǎng)基的pH為7.3-7.5，所述斜面培養(yǎng)基組分中的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種安福霉素類化合物的制備方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基的組分及其含量如下:蔗糖30.0%，KNO3L 0%，K2HPO4L 0%，蛋白胨5.0%，酵母膏2.0%, KC10.5%, MgSO4.7Η200.5%, FeSO4.7Η200.01%,且所述種子培養(yǎng)基 pH 為 7.3-7.5，所述種子培養(yǎng)基組分中的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種安福霉素類化合物的制備方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及其含量如下:黃豆粉10.0%，葡萄糖10.0%，NaC15.0%，KNO3L 0%，CaCO3L 0%，且所述發(fā)酵培養(yǎng)基pH為7.3-7.5，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分中的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種安福霉素類化合物的制備方法，其特征在于:所述步驟四中的高效液相色譜檢測條件為:分析柱為ODS C18，其中C18粒徑為5 μ m，分析柱長度乘以內(nèi)徑為250X4.6mm ;流動相為體積比35:65的含0.1%三氟乙酸的水-乙腈，流速為1.0ml/min ;柱溫為40° C ; 檢測波長為210nm。
【文檔編號】C12R1/465GK103554230SQ201310428077
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】鄭衛(wèi), 楊煌建, 張祝蘭, 周劍, 黃凱, 王德森 申請人:福建省微生物研究所