一株高產(chǎn)dha的寇氏隱甲藻突變株及發(fā)酵方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株高產(chǎn)DHA的寇氏隱甲藻突變株及發(fā)酵方法和應(yīng)用，ATCC30772寇氏隱甲藻藻株經(jīng)60Co-γ射線輻照誘變，篩選出了一株高產(chǎn)DHA的寇氏隱甲藻突變株，寇氏隱甲藻（Crypthecodinium?cohnii）2.4K-2A2-52.4K-2A2-5，CCTCCNO:M2012151。該株的油脂質(zhì)量和含油率分別比出發(fā)株提高了51.66%和66.37%，平均DHA含量達(dá)到39.04%，比出發(fā)株提高了3.39%，其DHA產(chǎn)量按g/L發(fā)酵液計(jì)，比出發(fā)株提高了56.92%。該寇氏隱甲藻ATCC30772突變株發(fā)酵生產(chǎn)的DHA具有廣闊的市場(chǎng)前景。
【專利說(shuō)明】一株高產(chǎn)DHA的寇氏隱甲藻突變株及發(fā)酵方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和生物工程和油脂工程，具體涉及一株高產(chǎn)DHA的寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii (seligo) JavoruicKy)的突變株,還涉及該突變株的制備方法，還涉及該突變株在制備DHA中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂類是人體必不可少的組成部分，具有許多重要的生理功能，脂肪酸又是脂類的關(guān)鍵成分，根據(jù)雙鍵存在與否，分飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸(polyunsaturated fattyacids，PUFAs);據(jù)雙鍵離甲基端的位置，又分為ω-3，ω-6，ω-9等不飽和脂肪酸。1971年，丹麥科學(xué)家Dyeherg J.在格陵蘭島發(fā)現(xiàn)愛(ài)斯人少患心血管疾病，這可能是由于食用了含有DHA等ω-3的PUFAs。DHA因其對(duì)人體的特殊功能，被科學(xué)家譽(yù)為“腦黃金”而倍受青睞。開(kāi)發(fā)利用DHA資源已成為全世界生物學(xué)家、營(yíng)養(yǎng)學(xué)家、油脂學(xué)家、醫(yī)學(xué)學(xué)家等研究的熱門(mén)方向之一。
[0003]目前市場(chǎng)上銷售的DHA產(chǎn)品大多來(lái)自深海魚(yú)油。由于魚(yú)油中含有難以除去的膽固醇或二噁英、聯(lián)苯等有毒物質(zhì)和魚(yú)腥味，導(dǎo)致純化成本極高或質(zhì)量不能達(dá)標(biāo)。因?yàn)轸~(yú)油中的DHA不是魚(yú)自身合成的，而是魚(yú)食用了含有DHA的藻類、細(xì)菌等因素在脂肪中積累的，故魚(yú)油中的DHA含量受到環(huán)境、季節(jié)、魚(yú)餌料、氣候、溫度等的極大影響，這就限制人從魚(yú)油中提取的DHA在食品行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用。利用微生物生產(chǎn)DHA，尤其是利用寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii(seligo)JavoruicKy) (Seligo, A, 1985, Beitraege Biol.Pflanzen4:145-180.)可進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)DHA，且具有脂肪酸組成簡(jiǎn)單，DHA含量高，沒(méi)有魚(yú)腥味，也沒(méi)有殺蟲(chóng)劑有機(jī)氯化物和金屬離子的活性等優(yōu)點(diǎn)。上世紀(jì)九十年代起，世界各地興起了利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)多不 飽和脂肪酸的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用。
[0004]DHA具有健腦益智的作用，DHA是大腦的主要組成成分之一，約占腦細(xì)胞脂肪酸的10%左右。在胎兒期，DHA必須從人體獲得，如母體攝入DHA量不足，會(huì)導(dǎo)致胎兒腦細(xì)胞發(fā)育和生長(zhǎng)不正常，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致弱智。嬰幼兒期，DHA促進(jìn)大腦生長(zhǎng)發(fā)育，攝食富含DHA的食物，可以促進(jìn)思維敏捷，增強(qiáng)語(yǔ)言能力和學(xué)習(xí)能力。青少年學(xué)生期，多多攝入DHA，可增強(qiáng)記憶力，改善注意力。對(duì)成年人而言，DHA也是維系腦功能必不可少的脂肪酸。否則，尤其是老年人可能會(huì)發(fā)生心情抑郁，注意力不集中和辦事效率低下，甚至導(dǎo)致老年癡呆癥等。因而DHA脂肪酸對(duì)人的一生是不可缺的，稱其為人體的“腦黃金”一點(diǎn)也不過(guò)分。
[0005]DHA具有抗凝血，抑制血小板聚集和血栓形成，從而預(yù)防和治療心血管疾病的作用。DHA在人的視網(wǎng)膜中含量豐富，如長(zhǎng)期缺乏DHA，人的視力會(huì)降低。DHA能明顯抑制腫瘤的發(fā)生、成長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明ω-3系列(DHA)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸與有促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的ω-6系列長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸形成競(jìng)爭(zhēng)吸收，對(duì)癌癥有抑制作用。而且ω-3與ω-6的比率是控制癌細(xì)胞發(fā)展的一個(gè)重要指標(biāo)。因而，DHA在癌癥的預(yù)防和治療工作中具有重要的作用。
[0006]除上述作用外，DHA還有增強(qiáng)機(jī)體免疫作用和抗炎癥等功能。[0007]—般認(rèn)為，除了魚(yú)類和一些海產(chǎn)品含有DHA外，牛、豬、禽肉以及蛋、谷物、水果、蔬菜中不含DHA。傳統(tǒng)的魚(yú)油是DHA的主要來(lái)源，但從魚(yú)油中提取DHA工藝復(fù)雜，成本高，資源減少，除去腥味和膽固醇的難度較大并且含有污染物，魚(yú)油中DHA又因季節(jié)、環(huán)境、氣候、攝食種類不同的魚(yú)而有很大差異，而且魚(yú)類本身不合成DHA，而是魚(yú)類攝食了能合成DHA而積累于體內(nèi)的藻類和浮游植物等水生物。而獲得的科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)浮游植物和藻類中，DHA含量占總脂肪酸的12-34%,其中研究最多的是海洋微藻-寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii (seligo)JavoruicKy) (Seligo, A, 1985, Beitraege Biol.Pflanzen4:145-180.)。
[0008]自然條件下，寇氏隱甲藻多以一個(gè)物種的綜合體的形式出現(xiàn)，它經(jīng)常寄生于其它藻類中。它分布廣泛，海洋、紅樹(shù)林、污染的含鹽的河流和湖泊，甚至冷凍的港灣都是其棲息地，然而分布在不同的地區(qū)的寇氏隱甲藻，基因并不完全相同。它盡管能游動(dòng)，但I(xiàn)Km/年的游動(dòng)速度表明它的自身的游動(dòng)只是決定其分布廣泛的次要因素，主要因素是其隨海洋環(huán)流和大型藻類的移動(dòng)而移動(dòng)(Beam Camd Himes Μ, 1982，J.Protozool29:8-15)，這就決定了不同研究人員從不同地區(qū)分離純化出來(lái)的寇氏隱甲藻藻種不盡相同。
[0009]寇氏隱甲藻以游動(dòng)細(xì)胞和孢囊的兩種形式存在(Bhaudy and almon JM, 1991, J.Cell Scil00:675-682)孢囊形式的寇氏隱甲藻比游動(dòng)細(xì)胞具有更高的油脂和DHA含量(Ratledge, 2003，GB Patentl03301 )，但各地的分離株，其油脂和DHA含量也不盡相同。
C.Cohnii在實(shí)驗(yàn)室中已有相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的研究歷史，可追溯到1908年，大量的研究報(bào)告從未顯示這種藻類具有致病性或毒性(張秋會(huì)、馬鶯，2003，西部糧油科技(6):32-34)。
[0010]在研究實(shí)踐中，因?yàn)榭苁想[甲藻常常是大孢囊和小孢囊混為一體，很難將其純化分離成單一體，大小孢囊體總是在同一藻落中生長(zhǎng)，但只有大孢囊才具有高的脂肪酸和DHA含量，因而在發(fā)酵生產(chǎn)中造成很大的技術(shù)難題，致使產(chǎn)量低，成本高。為了解決這些技術(shù)難題，我們想通過(guò)誘變育種技術(shù)提高大孢囊體的脂肪酸和DHA含量，同時(shí)減少小孢囊在混合體中的比例，以提高DHA和油脂產(chǎn)量，降低成本，實(shí)現(xiàn)DHA工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)化生產(chǎn)。
[0011]由于不同的藻種不但生長(zhǎng)速度不同，而且組成成分也有一定差異。在微藻生產(chǎn)中，不僅要獲得高產(chǎn)量，還要提高微藻產(chǎn)品質(zhì)量，也就是提高有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物活性物質(zhì)的含量。因此必須對(duì)微藻藻種進(jìn)行改良已培養(yǎng)出高產(chǎn)生物量、高油脂和高DHA的新品種，以滿足人們對(duì)藻油和DHA的日益增長(zhǎng)的要求。
[0012]1998年，汪志明、徐步進(jìn)(浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，24 (2 ): 121-121)，采用60Co- Y射線輻照不同品系和形狀的螺旋藻，結(jié)果表明，采用低劑量輻照能夠可刺激藻細(xì)胞生長(zhǎng)，并得到細(xì)胞低溫下能良好生長(zhǎng)的突變體。6tlCo-Y射線是產(chǎn)生于原子核的高能量電磁輻射，誘變強(qiáng)度較大，可以大大的提高藻株突變率，還可以省去傳統(tǒng)育種方法的煩瑣程序，大大的減輕了工作量，加快育種進(jìn)程。
[0013]在80年代中期，我國(guó)創(chuàng)立了低能量離子生物學(xué)，它具有能量、動(dòng)量、質(zhì)量和電荷的中和與交換的各種作用于一體，同時(shí)具有集束性好，射程可控以及質(zhì)量、能量、動(dòng)量和電荷等組合的特點(diǎn)，其結(jié)果是突變率高和突變譜廣。姚建銘，余增亮等(生物工程學(xué)報(bào)，2000，16
(4)=478-481)和袁成凌等人(高技術(shù)通訊，2003，(6):22_42)，利用低能離子束生物技術(shù)對(duì)產(chǎn) ARA (Arachidionic Acid, ARA)的高山被抱霉(Mortierella alpina, N7)進(jìn)行誘變，獲得了高產(chǎn)ARA的突變株L49-N18，該突變株產(chǎn)AM高達(dá)4.66g/L，比出發(fā)菌株產(chǎn)AM提高126.2%，在50噸的發(fā)酵罐中產(chǎn)ARA平均達(dá)到5，llg/L。2001年，古紹彬等，(中江水產(chǎn)科學(xué)，2002，9 (3):13-15),以對(duì)等鞭金藻(Isochrysis galbana3011)為材料,進(jìn)行離子束注入誘變，對(duì)離子束引入藻類誘變育種中確定注入條件，注入劑量與微藻存活的關(guān)系的研究有非
常重要的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的在于提供了一種高產(chǎn)DHA的寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii (seligo) JavoruicKy)的藻株。該藻株已于2012年5月2日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏,分類命名:寇氏隱甲藻2.4K-2A2-5Crypthecodinium cohnii2.4K_2A2_5,保藏編號(hào):CCTCCN0:M2012151地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)。該藻株的發(fā)酵產(chǎn)物可用于食品工業(yè)、嬰幼兒食品和奶類制品、保健品及醫(yī)藥品。同時(shí)藻體用作家禽、畜和水產(chǎn)品飼料，也可以用于制備生物柴油。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種寇氏隱甲藻2.4K-2A2-5的發(fā)酵方法,方法簡(jiǎn)單，易行，設(shè)備簡(jiǎn)單，適用于規(guī)模化的DHA的生產(chǎn)。
[0016]本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供了一種寇氏隱甲藻2.4K-2A2-5在制備DHA中的應(yīng)用。
[0017]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0018]用來(lái)作為誘變出發(fā)藻種是從廣東微生物菌種保藏中心購(gòu)買(mǎi)的ATCC30772，該株具有典型的寇氏隱甲藻的特征，原始藻株引自美國(guó)典型培養(yǎng)物種保藏中心(American TypeCulture Collection)該藻屬于隱甲藻類,它是異氧隱甲藻,在它的細(xì)胞中產(chǎn)生很高的DHA而無(wú)其它的多不飽和脂肪酸(Van pettetal, 1999，J.Lipid.Res.40:1501-1505)。
[0019]經(jīng)6°Co_Y射線福照誘變的突變株藻號(hào)Crypthecodinium cohniiATCC307722.4K_2A2_5，簡(jiǎn)稱 C.Cohnii2.4K_2A2_5，中文名寇氏隱甲藻 2.4K_2A2_5 突變株。
[0020]寇氏隱甲藻2.4K-2A2-5突變株經(jīng)活化，斜面培養(yǎng)孢囊細(xì)胞，接種于一級(jí)液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24~48hr，轉(zhuǎn)接二級(jí)液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36~48h，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖蕩培養(yǎng)6~7天，離心收集培養(yǎng)物，進(jìn)行后處理，獲得油脂和DHA。
[0021]一種高產(chǎn)DHA的寇氏隱甲藻2.4K-2A2-5，其篩選過(guò)程如下(圖6):
[0022]1.藻種活化
[0023]從廣東微生物菌種保藏中心購(gòu)買(mǎi)ATCC30772寇氏隱甲藻藻株，經(jīng)瓊脂平板活化和液體搖瓶培養(yǎng)活化，兩種方法均成功通過(guò)顯微鏡檢查，比對(duì)寇氏隱甲藻的典型特征，獲得的培養(yǎng)物即為ATCC30772藻株(圖2A)。
[0024]2.藻種誘變預(yù)試驗(yàn)
[0025]將實(shí)驗(yàn)室保存的寇氏隱甲藻，經(jīng)不同劑量的6tlCo- Y射線分別輻照誘變，經(jīng)分離培養(yǎng)獲得了不同誘變劑量下藻種的致死率，并對(duì)它們的生長(zhǎng)時(shí)間，生長(zhǎng)速度以及生物量進(jìn)行T比較，以確定最佳誘變條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1.2KGy、l.8KGy、2.4KGy、3.0KGy、4.2KGy和
5.4KGy,在3.0KGy~5.4KGy劑量下致死率從99.03%~99.9999%,在1.8KGy劑量下獲得的突變株開(kāi)始培養(yǎng)36hr后，生長(zhǎng)量達(dá)到32.979g/L，而對(duì)照株即誘變出發(fā)株僅為21.23g/L，這為下步正式研究試驗(yàn)提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。
[0026]3.藻種誘變
[0027]在上述1.和2.的基礎(chǔ)上，將ATCC30772活化，液體搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)旺盛期(2~3)天。經(jīng)檢查，無(wú)污染。將培養(yǎng)液連續(xù)稀釋105、IO6UO7三個(gè)稀釋度，平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度三個(gè)平皿，計(jì)數(shù)結(jié)果為cfu=22X 105。將此原藻液分裝于9個(gè)離心管中，每管裝入5ml,每3個(gè)為一組分別于0.8KGy、l.6KGy、2.4KGy的劑量下輻射后，用黑布包多層，帶回實(shí)驗(yàn)室分離純化。
[0028]4.誘變菌株的篩選
[0029]4.1ATCC30772 出發(fā)株經(jīng) 6ciCo-Y 射線 0.8KGy、1.6KGy、2.4KGy 的劑量輻射后，進(jìn)行連續(xù)稀釋，取稀釋度?ο—1~10_7濃度，并每個(gè)稀釋度各取0.2ml涂平板，在27± I °C，濕度80~90%時(shí)培養(yǎng)2天，計(jì)數(shù)藻落數(shù)，0.8KGy處理組為cfu=40 X IO2, 1.6KGy為cfu=33X 102, 2.4KGy 為 cfu=41X 10 個(gè)，致死率分別為 99.8095%,99.8429% 和 99.9804%。
[0030]從各處理組平板中隨機(jī)測(cè)量10個(gè)藻落，測(cè)定其直徑大小，OKGy (出發(fā)株)、0.8KGy、
1.6KGy、2.4KGy的測(cè)量結(jié)果(平均值)分別為3.44mm、6.3mm、6.55mm、6.60mm.。說(shuō)明在同一條件下經(jīng)6tlCo- Y射線輻照的藻株生長(zhǎng)速率快于出發(fā)株。
[0031]4.2將從0.8KGy、l.6KGy、2.4KGy三個(gè)處理組中各選出的個(gè)10個(gè)藻落分別轉(zhuǎn)接于
裝有3ml培養(yǎng)液的試管中，每個(gè)三支，培養(yǎng)3天后經(jīng)顯微鏡檢查，證明為純培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)噴涂于平板上培養(yǎng)。從生長(zhǎng)出的藻株中觀察藻落大小、形狀、顏色、光澤等指標(biāo)，并涂片鏡檢。記錄藻落生長(zhǎng)情況及鏡檢結(jié)果，從中選20個(gè)單藻株繼續(xù)研究。
[0032]4.3將選出的20株藻突變株，每株分別接入裝有5ml培養(yǎng)液的試管5支，共100支試管于搖床振蕩培養(yǎng)8天后，涂片鏡檢，檢查其有無(wú)污染，培養(yǎng)物大小，純度，藻典型性狀等指標(biāo)，從中選出0.8KGy處理的8株，1.6KGy中的10株，2.4KGy9株共27株。
[0033]4.4將選出的27株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，每株接8瓶搖瓶(每瓶IOOml培養(yǎng)液)，在培養(yǎng)中，每隔48小時(shí)涂片觀察，檢查其生長(zhǎng)及是否污染，培養(yǎng)7天后，用蘇丹黑B染色鏡檢，均顯示出脂肪。放瓶測(cè)出生物量(g/L)，油重(g/L)，和含油量(％)等指標(biāo)，從中選出下列藻株(見(jiàn)表1)。
[0034]表1篩選出6株寇氏隱甲藻突變株
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種寇氏隱甲藻突變株，其特征在于:寇氏隱甲藻cohnii)2.4K-2A2-5 2.4K-2A2-5, CCTCC NO: M2012151。
2.權(quán)利要求1所述寇氏隱甲藻突變株的發(fā)酵方法，其步驟如下: 將發(fā)酵培養(yǎng)基配制好，調(diào)PH6.0~7.0，滅菌，冷卻，IOL的發(fā)酵罐，發(fā)酵液裝6-8L，種子液IO7-1O8個(gè)細(xì)胞/ml，按5-15% v/v的接種量接入液體種子培養(yǎng)基，25~30°C，120~250rpm，通氣量:1:0.8-1.5，培養(yǎng)5~7天; 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為: 名稱用量g/L名稱用量g/L 葡萄糖40~120氯化鈉15~30 谷氨酸鈉 10~40七水硫酸鎂 0.1~0.3 酵母浸膏 2~12硫酸鈉2.0~5.0 維生素BI 0.05~0.15氯化鈉0.6~1.5 維生素 B2 0 .0001 ~0.0009硼酸0.02 ~0.04 維生素B12 0.0001~0.0009氯化鍶0.2~0.6 維生素H 0.0001~0.0009六水氯化鐵 0.005~0.015 維生素E 0.0001~0.0005甘油磷酸鈉 0.09~0.19 棉籽油5~10磷酸氫二鉀 0.05~0.16 六水氯化鈷 0.05-0.15硫酸鋅3.0~8.0 氯化猛3.0~8.0。
3.權(quán)利要求1所述寇氏隱甲藻突變株在制備DHA中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK103468575SQ201310428899
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】何東平, 陳明鍇, 胡傳榮, 陳濤, 田華, 佘雋, 張四紅, 姚理, 嚴(yán)玲華 申請(qǐng)人:武漢輕工大學(xué)