一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白及其制法和用途
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白融合蛋白及其制法和用途。該融合蛋白是由膜聯(lián)蛋白、連接肽、腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白組成的，通過克隆構(gòu)建該融合蛋白的編碼基因。該腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白融合蛋白具有顯著增強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果，能夠使得誘導(dǎo)對細(xì)胞凋亡不敏感的腫瘤細(xì)胞凋亡，能夠降低獲得治療效果所需要的蛋白給藥劑量。
【專利說明】—種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白及其制法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白及其制法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是世界上導(dǎo)致死亡的第二大因素。目前治療癌癥的方法除手術(shù)外，主要是化療和放療，但這兩種方法缺乏特異性，具有明顯的細(xì)胞毒性。理想的抗腫瘤藥物是能選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞。許多化療藥物是通過誘導(dǎo)凋亡來殺死腫瘤細(xì)胞的，腫瘤細(xì)胞也會通過產(chǎn)生抑制凋亡的機(jī)制而導(dǎo)致化療的失敗。因此，凋亡通路成為研制抗腫瘤藥物的最具吸引力的靶點(diǎn)。
[0003]自從Aggarwal等人1984年分離并鑒定出首個(gè)腫瘤壞死因子(TNF)至今，這個(gè)蛋白家族已有19名成員。腫瘤壞死因子家族成員通過與其受體家族一腫瘤壞死因子受體家族相互作用，發(fā)揮重要生理作用。腫瘤壞死因子及其受體家族系統(tǒng)在自身免疫性疾病、細(xì)菌和病毒感染、腫瘤、糖尿病、骨質(zhì)疏松等多種疾病的發(fā)生與發(fā)展中起關(guān)鍵作用。因此，大部分腫瘤壞死因子及其受體家族成員被作為多種疾病的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行廣泛開發(fā)。美國食品藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)5種TNF阻斷劑藥物上市銷售，主要用于關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、克羅恩病等炎癥和自身免疫疾病治療，其中有三種藥物的銷售額已躋身于美國“重磅炸彈”(年銷售額過10億美元)行列，成為最成功的生物技術(shù)類藥物之一。2010年11月FDA批準(zhǔn)腫瘤壞死因子家族成員之一 -RANKL的人源化抗體(Xgeva)用于防治腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的骨破壞病癥；近期，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)另外一種腫瘤壞死因子家族成員BAFF的中和抗體(Benlysta)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)治療。另外，還有多種腫瘤壞死因子及其受體家族成員相關(guān)藥物正處于不同的臨床試驗(yàn)階段。腫瘤壞死因子及其受體家族成為藥物開發(fā)中的明星家族，相信不久的將來會有更大的發(fā)展。腫瘤壞死因子及其受體家族成員中，大部分腫瘤壞死因子家族成員均可以表達(dá)為II型跨膜蛋白，包括氨基端的胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)、羧基端的胞外區(qū)三部分。腫瘤壞死因子家族成員的胞外區(qū)結(jié)構(gòu)比較類似，都是由多條反向平行的β折疊片層組成典型的β蛋卷結(jié)構(gòu)，在與受體結(jié)合的幾個(gè)區(qū)域，氨基酸序列比較保守。大部分跨膜型TNF家族成員胞外區(qū)可以被特定的酶水解產(chǎn)生可溶性蛋白；可溶性與膜結(jié)合型TNF家族成員與受體結(jié)合能力相似，但是可以激活不同的信號途徑，介導(dǎo)不同的生理與病理作用。
[0004]到目前為止，大約有19種腫瘤壞死因子超家族的成員被克隆出來，有部分已經(jīng)作為藥物使用如TNF a，TNF β，大部分還處于臨床階段，如FasL、TRAIL、TWEAK、RANKL等。其中，大部分腫瘤壞死因子家族成員(例如，F(xiàn)asL、TNF、TRAIL等)都是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其生物學(xué)及其治療功能。以下僅以腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體為例，說明腫瘤壞死因子家族成員誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用、應(yīng)用及其面臨的問題。
[0005]腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的又一成員，自從1995年被發(fā)現(xiàn)以來，因?yàn)槠淠苷T導(dǎo)一系列的腫瘤細(xì)胞凋亡而不影響正常細(xì)胞而成為具有重要應(yīng)用前景的抗腫瘤生物藥物(Walczak.H等，1999，Nat.Med5:157-163)。TRAIL是分子量為30KD的II型跨膜蛋白，能被半胱氨酸蛋白酶加工成分子量為20KD的可溶性蛋白(S.M.Mariani 等，1998，Eur.J.1mmono128:973-982)? TRAIL 的 N 端區(qū)域是不保守的，但C端與該家族的其它成員有高度的保守性。TRAIL是該家族唯一含有半胱氨酸Cys230的蛋白，該Cys230使三個(gè)TRAIL分子能相互作用。與該Cys結(jié)合的鋅離子對維持三聚體結(jié)構(gòu)、可溶性以及正常的生物學(xué)功能具有重要的作用(Mongkolsapaya J等，Nat StructB1l6:1048-1053)。本發(fā)明中所稱的TRAIL是指可溶性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，通常是指、但不局限于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體114-281氨基酸序列，其中包括了由腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體衍生物(截短的、加長的、突變的突變體蛋白質(zhì))。TNF超家族的成員FasL以及TNFa的表達(dá)是嚴(yán)格控制的、并且只短暫表達(dá)于一些活化的細(xì)胞中Hmtrail在多種正常組織包括淋巴細(xì)胞，脾，胸腺，前列腺，卵巢以及腸等組織中組成型表達(dá)(在腦和肝臟中不表達(dá))(Wiley, S.R.等，1995, Immunity3:673-682)。在體內(nèi)，系統(tǒng)給藥時(shí)，F(xiàn)asL以及TNFa除了能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡外還能引起炎癥反應(yīng)以及肝毒性，但TRAIL不會(Ashkenazi, Α.等，1998，Science281:1305-1308)。因此，TRAIL 是一種有前景的抗腫瘤藥物。
[0006]凋亡主要由兩條通路引起，即胞外信號通路和胞內(nèi)信號通路，但這兩條通路最終激活相同的凋亡效應(yīng)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)和凋亡效應(yīng)分子。胞內(nèi)凋亡信號通路是由嚴(yán)重的DNA損傷、缺氧以及其它壓力引起的(如化療和放療)。胞內(nèi)信號通路很大程度上是由Bcl-2蛋白家族的凋亡與抗凋亡成員相互作用來介導(dǎo)和調(diào)控的(Wei，M.C.等，2001，Science292:727 - 730)。 胞外凋亡信號通路是由TNF超家族配體結(jié)合到相應(yīng)的受體上引起的。TRAIL主要是通過胞外通路來誘導(dǎo)凋亡的(Scaffidi C.等，1998，EMBO J.17:1675 -1687)。與TNF超家族其它成員不同，TRAIL能與一系列受體結(jié)合，與不同受體結(jié)合的親和力不同，引起的結(jié)果也不同。TRAIL-Rl (DR4)和TRAIL-R2(DR5)是凋亡受體，能將TRAIL誘導(dǎo)的凋亡信號傳到細(xì)胞內(nèi)(LeBlanc, H.N.等，2004, Cell Death DifferlO:66 - 75)0TRAIL-R3(DcRl)和TRAIL-R4 (DcR2)是假受體，可拮抗TRAIL的凋亡信號。TRAIL-R3沒有胞內(nèi)區(qū)域而TRAIL-R4的死亡結(jié)構(gòu)域是剪切了的，因此它們都不能傳導(dǎo)凋亡信號。此外，TRAIL還能與OPG結(jié)合，但親和力較低。
[0007]如同其它TNF超家族配體成員一樣，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體誘導(dǎo)凋亡的第一步是三聚體的TRAIL與TRAIL-Rl和TRAIL-R2的結(jié)合。TRAIL與其受體的相互作用促使受體成簇并招募接頭蛋白FADD, FADD通過死亡效應(yīng)區(qū)域進(jìn)一步招募Casapase8前體,進(jìn)而形成死亡信號誘導(dǎo)復(fù)合物(DISC) (Kischkel FC 等，2000，Immunityl2:611 - 20)。Casapase8前體招募到DISC后，通過構(gòu)象變化以及自我剪切而激活，激活后的Caspase8進(jìn)一步剪切和活化效應(yīng)CaSpaSe3，6，7從而執(zhí)行細(xì)胞凋亡。根據(jù)是否需要胞內(nèi)信號通路來執(zhí)行凋亡可將細(xì)胞分為兩種類型即I型和II型。在I型細(xì)胞中，DISC完全活化CaspaseS并通過直接活化 Caspase3, 6，7 而誘導(dǎo)凋亡(Gonzalvez F.等，2010, 0ncogene29:4752 - 4765)。在 II 型細(xì)胞中,DISC活化的Caspase8不足以誘導(dǎo)凋亡因而需要胞內(nèi)信號通路來放大凋亡信號。胞內(nèi)信號通路是在Caspase8介導(dǎo)的Bid剪切成活性形式tBid后而激活的。tBid迅速移位到線粒體內(nèi)并激活Bax和Bak，從而引起線粒體膜電位的改變。從而，凋亡因子如細(xì)胞色素C和Smac/DIABLO釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與接頭蛋白Apaf-1結(jié)合并將Caspase_9招募到凋亡復(fù)合物中?；罨腃aspase-9進(jìn)一步激活Caspase_3,從而引起完全的凋亡。
[0008]雖然很多報(bào)道證實(shí)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，是一種有前景的抗腫瘤藥物，但是許多原發(fā)的腫瘤對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡具有抵抗作用(Dyer，M.J.等，2007，J.Clin.0ncol.25:4505-4506)。這種抵抗機(jī)制發(fā)生在TRAIL誘導(dǎo)的凋亡通路中從受體到效應(yīng)分子的多個(gè)水平。在受體水平，DR4或DR5重要區(qū)域如死亡受體區(qū)域和與TRAIL結(jié)合區(qū)域的突變會抑制TRAIL誘導(dǎo)的凋亡(MCDONALD ER3RD等，2001，J B1lChem276:14939 - 14945)。DcRl 與 DR4 和 DR5 競爭結(jié)合 TRAIL 而抑制 DISC 的形成，而 DcR2與DR5 一起被招募到DISC中并抑制起始caspase的激活(Merino D.等,2006, Mol CellB1l26:7046 - 7055)。在 TRAIL DISC 水平，cFLIP 與 Caspase8 競爭結(jié)合 FADD 從而抑制caspase 的活化(Kataoka T.等，2005, Crit.Rev.1mmunol.25:31 - 58)。XIAP 的高表達(dá)可直接抑制 Caspase3, 7, 9 (Deveraux, Q.L 等，1997, Nature388:300 - 304)。Bcl_2 家族的抗凋亡蛋白如Bcl-2，Bcl-X L以及Mcl-1可抑制線粒體膜電勢的改變而抑制凋亡(TaitS.W.等，2010,Nat.Rev.Mol.Cell B1lll:621_632)。此外，其他生存信號通路包括 AKT 和NF-κ B通路的激活也會導(dǎo)致對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的抑制(LoPiccolo J等，2008，Drug ResistUpdatll:32 - 50)。腫瘤細(xì)胞對TRAIL的抵抗性限制了 TRAIL的使用，因此了解腫瘤細(xì)胞對TRAIL抵抗的胞內(nèi)分子機(jī)制有助于基于TRAIL的抗腫瘤方法的發(fā)展。
[0009]目前，化療和放療與TRAIL聯(lián)合使用是較常用的增加腫瘤細(xì)胞對TRAIL敏感性的方法，但放療和化療對正常細(xì)胞也有一定的影響。此外，TRAIL不穩(wěn)定容易變性，并且半衰期短，這些對其應(yīng)用都有影響。因此，如何利用生物學(xué)的方法增加以腫瘤細(xì)胞為代表的疾病細(xì)胞或病理組織腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性？這對于TRAIL的應(yīng)用具有重要的意義。對于以細(xì)胞凋亡活性為主要生物學(xué)功能的腫瘤壞死因子家族配體成員而言，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是它們的主要生物學(xué)功能及藥學(xué)價(jià)值，在治療過程中被治療的靶細(xì)胞對于細(xì)胞凋亡的抵抗對于腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白的應(yīng)用具有重要的意義。
[0010]膜聯(lián)蛋白(Annexins)是一大類鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族,在結(jié)構(gòu)上均具有保守C-端中心結(jié)構(gòu)域，及其N -端結(jié)構(gòu)域。被定義為膜聯(lián)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)是，能夠在鈣離子存在條件下可逆地結(jié)合于細(xì)胞表面帶負(fù)電的磷脂；并且必須包含具有約70個(gè)氨基酸的重復(fù)序列，這種重復(fù)序列被稱作膜聯(lián)蛋白折疊。膜聯(lián)蛋白基因超家族具有獨(dú)特的、保守的四個(gè)同源重復(fù)序列，該結(jié)構(gòu)具有鈣和磷脂結(jié)合能力。從序列比對和進(jìn)化上看，膜聯(lián)蛋白1、2、3、9、10、3’ 6高度同源和相似，膜聯(lián)蛋白4、5 (V)、8、5’ 6高度同源和相似。但是膜聯(lián)蛋白I (膜聯(lián)蛋白I)的空間結(jié)構(gòu)域膜聯(lián)蛋白V (Annexin5)幾乎完全重疊，顯示出膜聯(lián)蛋白在結(jié)構(gòu)及功能(與細(xì)胞表面帶負(fù)電的磷脂結(jié)合)上的高度相似性。膜聯(lián)蛋白V (Annexin V)是膜聯(lián)蛋白(Annexin)家族的成員之一,在鈣離子存在的條件下可與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合。其表達(dá)較廣泛，特別是在骨骼，心臟，平滑肌，內(nèi)皮細(xì)胞，軟骨細(xì)胞以及神經(jīng)元。膜聯(lián)蛋白V參與了多種胞內(nèi)胞外過程，包括凝血，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抗炎癥反應(yīng)，膜運(yùn)輸以及離子通道活性(Rahman，Μ.Μ.等，1997, Anat.Embryoll9 5:31-39)。此外,最近的研究還發(fā)現(xiàn),膜聯(lián)蛋白V可封閉腫瘤細(xì)胞自分泌的含有EGFR的微囊泡從而抑制腫瘤血管的新生(Khalid Al-Nedawi等，2009，Proc Natl Acad Scil06:3794 - 3799)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種以腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白為基礎(chǔ)的、克服靶細(xì)胞或者治療患者對于腫瘤壞死因子家族成員誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抵抗的蛋白，它是膜聯(lián)蛋白(Annexin)或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白衍生物與腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白衍生物構(gòu)成的融合蛋白。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種以腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)為基礎(chǔ)的、克服以靶細(xì)胞(例如，一些腫瘤細(xì)胞)或者患者(例如，腫瘤患者)對TRAIL抵抗的蛋白，它是膜聯(lián)蛋白V (Annexin V)或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白V衍生物與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體衍生物構(gòu)成的融合蛋白。
[0013]本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述融合蛋白的DNA、含有該DNA序列的載體和含該載體的宿主細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供一種成本低廉，效果顯著地生產(chǎn)所述融合蛋白的方法。
[0015]本發(fā)明的再一目的是提供所述的融合蛋白在制備包括抗腫瘤藥物在內(nèi)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。
[0016]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白，其特征在于它具有膜聯(lián)蛋白的氨基酸序列或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白衍生物序列、腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白的氨基酸序列或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白衍生物序列、以及位于膜聯(lián)蛋白氨基酸序列和腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白氨基酸序列之間的連接肽序列，是通過基因工程方法構(gòu)建由膜聯(lián)蛋白或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白衍生物、連接肽、腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白衍生物三個(gè)部分組成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體融合蛋白質(zhì)，即利用常規(guī)基因工程方法通過人工合成或者克隆構(gòu)建融合蛋白的編碼基因、可溶性地重組表達(dá)和簡便地分離純化。
[0017]所述的膜聯(lián)蛋白是指具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白家族成員或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白衍生物，所述的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白是指腫瘤壞死因子家族中具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的成員蛋白質(zhì)或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白衍生物。所述的連接肽序列是一段具有柔性結(jié)構(gòu)的、不含支鏈氨基酸的短肽，其中，短肽長度為、但不局限于，1-30個(gè)氨基酸殘基，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等不含支鏈的氨基酸組成。所述的衍生物是指具有磷脂結(jié)合活性的，截短的、加長的、突變的膜聯(lián)蛋白突變體，或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的，截短的、加長的、突變的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白突變體。
[0018]上述由膜聯(lián)蛋白或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白衍生物與腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白衍生物所構(gòu)成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白可以是將膜聯(lián)蛋白或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白衍生物置于腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白衍生物的N端，中間添加一段含有但不局限于1-30個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽；也可以將膜聯(lián)蛋白或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白衍生物置于腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白衍生物的C端，中間添加一段含有但不局限于1-30個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽。
[0019] 優(yōu)選的所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
[0020]在本發(fā)明的第二方面，還提供了一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白，其特征在于它具有膜聯(lián)蛋白V的氨基酸序列或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白V衍生物的氨基酸序列、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的氨基酸序列或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體衍生物的氨基酸序列、以及位于膜聯(lián)蛋白V的氨基酸序列或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白V衍生物的氨基酸序列和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體氨基酸序列或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體衍生物的氨基酸序列之間的連接肽序列，是通過基因工程方法構(gòu)建由膜聯(lián)蛋白V或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白V衍生物、連接肽、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體衍生物三個(gè)部分組成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體融合蛋白質(zhì)，即利用常規(guī)基因工程方法通過人工合成或者克隆構(gòu)建融合蛋白的編碼基因、可溶性地重組表達(dá)和簡便地分離純化。
[0021]所述的連接肽序列是一段具有柔性結(jié)構(gòu)的、不含支鏈氨基酸的短肽，其中，短肽長度為、但不局限于，1-30個(gè)氨基酸殘基，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等不含支鏈的氨基酸組成。
[0022]優(yōu)選的所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:1_5中所示的氨基酸序列。
[0023]上述由膜聯(lián)蛋白V與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體所構(gòu)成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白可以是將膜聯(lián)蛋白V或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白V衍生物置于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體衍生物的N端，中間添加一段含有但不局限于1-30個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽；也可以將膜聯(lián)蛋白V或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白V衍生物置于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體衍生物的C端，中間添加一段含有但不局限于1-30個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽。
[0024]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發(fā)明上述的融合蛋白，較佳的，所述的DNA分子編碼包括SEQ ID NO:1_6中所示的氨基酸序列的融合蛋白。更加的，所述的DNA分子包括SEQ ID NO:7~12中所示的核苷酸序列。
[0025]在本發(fā)明的第四方面，提供含有上述DNA分子的載體；還提供了含有上述載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以選用基因工程中常用的工程菌，優(yōu)選的為大腸埃希菌BL21。
[0026]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明融合蛋白的方法，它包括如下步驟:
[0027]在適合表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
[0028]具體的，本發(fā)明提供了一種在大腸桿菌中可溶性表達(dá)、能夠方便地進(jìn)行大規(guī)模分離純化的、高純度的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的方法。目前腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在大腸桿菌中表達(dá)多為無生物活性的包涵體產(chǎn)物，而本發(fā)明中的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的分子結(jié)構(gòu)和分子量比野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體更為復(fù)雜，因此在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，其包涵體形成將更為嚴(yán)重、純化將更為復(fù)雜。本發(fā)明采用了低溫下培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的表達(dá)方法，使得表達(dá)產(chǎn)物有效避免了包涵體的形成；本發(fā)明同時(shí)利用了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體具有鏊合金屬離子的生物功能，利用離子交換層析和金屬親和層析相結(jié)合使得腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白得到了有效的純化、獲得了高純度的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而且純化產(chǎn)物具有高比例的聚體形式，因此具有非常好的生物活性。其中低溫指10°C-35°C。當(dāng)然，利用高等生物的細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等)能夠比大腸桿菌更好地產(chǎn)生可溶性的融合蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0029]膜聯(lián)蛋白V與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合后，能夠顯著提高腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白多聚體的比例，由于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的活性依賴于多聚體(尤其是三聚體)的形成，因此腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性得以顯著提高。
[0030]同時(shí)公開編碼腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的cDNA，它可以通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的cDNA與膜聯(lián)蛋白V cDNA序列、以及連接肽的DNA序列制備。上述組成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的cDNA可用于基因治療。
[0031]本發(fā)明的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白可以通過采用聚乙二醇、脂肪酸化、重組加上抗體Fe片段或白蛋白等方法修飾，從而延長腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的半衰期，達(dá)到更好的藥代動力學(xué)效果。
[0032]在本發(fā)明的第六方面，提供了如上所述的融合蛋白在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括所述融合蛋白單獨(dú)用于制備腫瘤治療藥物，或與現(xiàn)有的腫瘤治療藥物組成組合物，或與現(xiàn)有化療、放療、中藥治療、生物治療等方法在腫瘤治療中聯(lián)合運(yùn)用。
[0033]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
[0034]在本發(fā)明的第八方面，由于腫瘤壞死因子及其受體家族在進(jìn)化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其作用方式、生物學(xué)功能等方面的高度同源和相似，因此，本發(fā)明公開的技術(shù)方案不僅僅局限于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體衍生物，也適用于腫瘤壞死因子家族其它成員或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白衍生物。
[0035]在本發(fā)明的第九方面，由于膜聯(lián)蛋白家族在進(jìn)化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其作用方式、生物學(xué)功能等方面的高度同源和相似，因此，本發(fā)明公開的技術(shù)方案不僅僅局限于膜聯(lián)蛋白V或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白V衍生物，也適用于膜聯(lián)蛋白家族其它成員或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白衍生物。
[0036] 同已有的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體及其變體相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0037](I)更好的形成聚體的能力:與野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體單獨(dú)或者與膜聯(lián)蛋白V混合存在時(shí)相比較，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白具有更高的多聚體存在形式，例如，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的三聚體形式比野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體高11倍。由于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體誘導(dǎo)凋亡的第一步是三聚體的TRAIL與其受體結(jié)合，因此，三聚體形式則必然使得腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白具有更高的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物活性。
[0038](2)更為高效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白呈現(xiàn)出比腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體更高的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白能顯著誘導(dǎo)TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的腫瘤細(xì)胞凋亡，而且對于Colo-205和MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行測定EC50實(shí)驗(yàn)時(shí)，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體僅僅需要作用細(xì)胞4小時(shí)，而不是像常規(guī)測定其他腫瘤細(xì)胞時(shí)需要作用24小時(shí)，由此可見腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白具有強(qiáng)烈增強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。
[0039]除誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡之外，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白還具有長期的作用效應(yīng)，它能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的克隆形成，因此具有抑制腫瘤生長的能力。
[0040](3)可靠的選擇性作用:雖然腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力顯著增強(qiáng)，但腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白對腫瘤細(xì)胞的特異性并沒有改變，正常細(xì)胞系(如L02和293T)并不響應(yīng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，即是說與TRAIL相比較，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白不會帶來額外的毒副作用。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式與TRAIL完全相同，均依賴于Caspase-8。TRAIL,膜聯(lián)蛋白V與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體混合物(AnnexinV+TRAIL)以及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白與腫瘤細(xì)胞A549細(xì)胞表面的受體DR4/DR5的結(jié)合能力沒有差異。下游的信號分子(如DR4，DR5，DcR2以及與線粒體通路相關(guān)的蛋白如Bcl-XL,Bax,Bim,Noxa,Puma)的表達(dá)在經(jīng)不同藥物處理后也無差異。但是Caspase-8,Caspase-3, PARP只有在經(jīng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白處理后才被明顯激活。而且,Caspase-8抑制劑Z-1ETD-FMK可明顯減少腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而Caspase-9抑制劑Z-LEHK-FMK對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白誘導(dǎo)的凋亡無明顯影響。這充分說明，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白與TRAIL具有完全一樣的作用機(jī)制，其安全性與TRAIL相同。
[0041](4)更為高效的抗腫瘤效果:由于本專利發(fā)明的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白具有顯著增加的誘導(dǎo)TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的能力，與野生型TRAIL、靶向于腫瘤細(xì)胞表面的整合素ανβ3、ανβ5的TRAIL變體RGD-L-TRAIL (中國發(fā)明專利申請?zhí)?200710133862.1)、靶向于腫瘤細(xì)胞表面的CD13的TRAIL變體NGR-L-TRAIL (中國發(fā)明專利申請?zhí)?200710133862.1)相比，無論在單獨(dú)使用、還是與現(xiàn)有的化療、放療、中藥治療、生物治療等方法聯(lián)合使用時(shí)都表現(xiàn)出具有更好的抗腫瘤效果。
[0042](5)更低的使用劑量:由于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白比相同劑量的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體具有更好的抗腫瘤效果，因此在使用時(shí)，能夠在保證相同抗腫瘤療效的情況下，大大降低腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的用量。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白給藥劑量的降低將能夠克服腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在腫瘤治療中潛在的副作用，同時(shí)可以降低腫瘤患者的治療費(fèi)用，達(dá)到高效、低毒副作用、低成本腫瘤治療的效果。
[0043](6)可溶性的表達(dá)和簡易的分離純化:盡管目前腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)易形成無生物活性的包涵體產(chǎn)物，而本專利發(fā)明的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的分子結(jié)構(gòu)和分子量比野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體更為復(fù)雜，因此依照常規(guī)條件在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白時(shí)，其包涵體形成將更為嚴(yán)重、純化難度更大。本發(fā)明采用了低溫下培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的表達(dá)方法，使得表達(dá)產(chǎn)物有效避免了包涵體的形成；本發(fā)明同時(shí)利用了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體具有鏊合金屬離子的生物功能，將金屬親和層析和離子交換層析方法相結(jié)合使得腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白得到了有效的純化、獲得了高純度的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。本發(fā)明通過可溶性表達(dá)和簡易分離純化方法的優(yōu)化最終導(dǎo)致純化產(chǎn)物具有高比例的聚體形式，從而保證了獲得的產(chǎn)物具有非常好的生物活性。生產(chǎn)高比例聚體形式的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白，這是本發(fā)明與同類研究的顯著區(qū)別。本發(fā)明提供了一種有效表達(dá)和高效獲得高的聚體含量的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的表達(dá)方法和純化工藝。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚地理解，下面根據(jù)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中
[0045]圖1.SDS-PAGE分析腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8純化結(jié)果及聚體形成情況。
[0046]圖1.1.Zn2+離子金屬親和層析與DEAE離子交換層析純化獲得的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8:1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，2.純化后的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8 ；
[0047]圖1.2.非還原 SDS-PAGE 分析 TRAIL 以及 Annexin V+TRAIL 中 TRAIL 單體、二聚體以及三聚體形成情況:1.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，2.Annexin V, 3.TRAIL, 4.Annexin V+TRAIL ；21.TRAIL 三聚體，22.TRAIL 二聚體，23.TRAIL 單體；
[0048]圖1.3.非還原SDA-PAGE分析腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8單體、二聚體以及三聚體形成情況:31.TP8三聚體，32.TP8 二聚體，33.TP8單體。
[0049]圖2.不同細(xì)胞系對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8敏感性分析。
[0050]圖2.1.不同濃度的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8對正常的人源細(xì)胞293T的影響分析；
[0051]圖2.2.不同濃度的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8對正常的人源細(xì)胞L02的影響分析。
[0052]圖3.等摩爾數(shù)的不同藥物處理A549相同時(shí)間后A549細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡分析以及克隆形成分析。
[0053]等摩爾數(shù)的Annexin V,TRAIL,Annexin V+TRAIL以及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8處理A549相同時(shí)間后，以PBS作為陰性對照:
[0054]圖3.1.在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化:1.PBS ；2.Annexin V ；3.TRAIL ；
4.Annexin V+TRAIL ；5.TP8 ；
[0055]圖3.2.透射電鏡觀察經(jīng)不同蛋白處理后細(xì)胞形態(tài)變化:1.PBS ;2.Annexin V ；
3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；5.TP8 ；
[0056]圖3.3.流式細(xì)胞儀分析不同藥物處理后A549凋亡情況:1.PBS ；2.Annexin V ；
3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；5.TP8 ；
[0057]圖3.4.不同藥物處理對A549克隆形成的影響:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；
4.AnnexinV+TRAIL ；5.TP8。
[0058]圖4.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡的劑量及作用時(shí)間的關(guān)系分析。
[0059]圖4.1.流式細(xì)胞分析術(shù)分析A549凋亡與TP8劑量的關(guān)系:1.PBS;2.10ng/mlTP8 ;3.50ng/ml TP8 ;4.lOOng/ml TP8 ;5.200ng/ml TP8 ;6.400ng/ml TP8 ;7.600ng/mlTP8 ；8.800ng/ml TP8 ；
[0060]圖4.2.TP8處理時(shí)間與A549細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
[0061]圖5.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體TRAIL、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體RGD-TRAIL、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8以及TP8變體誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡的效果比較。
[0062]圖5.1.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體TRAIL、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體RGD-TRAIL、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡的效果比較。
[0063]圖5.2.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8變體TP8-C230G誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549凋亡的效果比較:1.未給藥對照組；2-6.100、200、400、600、800ng/ml腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8 (黑色柱狀)及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8變體TP8-C230G (白色柱狀)。
[0064]圖6.TP8誘導(dǎo)A549凋亡機(jī)制分析
[0065]圖6.l.Western blotting分析凋亡通路中重要蛋白的變化情況:1.PBS組；2.Annexin V 組；3.TRAIL 組；4.Annexin V+TRAIL 組；5.TP8 組；
[0066]圖6.2.RT-PCR分析細(xì)胞凋亡信號通路中重要蛋白質(zhì)的變化情況:1.PBS組；
2.Annexin V 組；3.TRAIL 組；4.Annexin V+TRAIL 組；5.TP8 組；
[0067]圖 6.3.流式細(xì)胞儀分析 Annexin V,TRAIL,Annexin V+TRAIL 以及 TP8 與 A549 細(xì)胞結(jié)合情況。蛋白經(jīng)熒光染料標(biāo)記后與A549 —起孵育，再經(jīng)流式檢測；
[0068]圖6.4.流式細(xì)胞儀分析不同藥物處理后A549細(xì)胞表面的TRAIL受體DR4和DR5表達(dá)情況:1.DR5 ;2.DR4。
[0069]圖1.Caspase8 和 Caspase3 活性分析:
[0070]圖 7.1.Caspase8 活性分析:1.PBS 組；2.Annexin V 組；3.TRAIL 組；4.AnnexinV+TRAIL組；5.TP8組;**ρ〈0.01，ΤΡ8組與其它組比較；
[0071]圖 7.2.Caspase3 活性分析:1.PBS 組；2.Annexin V 組；3.TRAIL 組；4.AnnexinV+TRAIL組；5.TP8組;**ρ〈0.01，ΤΡ8組與其它組比較；
[0072]圖7.3.Caspase8和Caspase3抑制劑對TP8誘導(dǎo)的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡的影響分析；**p〈0.01，TP8與Caspase-8抑制劑同時(shí)處理組與TP8處理組比較。
[0073]圖8.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8對不同腫瘤的抑瘤效果分析。
[0074]圖8.1.不同蛋白對A549腫瘤抑制作用比較:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；
4.AnnexinV+TRAIL ;5.ΤΡ86.25mg/kg ;6.TP812.5mg/kg ;7.TP825mg/kg ;**P < 0.01 ；
[0075]圖8.2.不同蛋白對A549腫瘤倍增時(shí)間(即腫瘤體積增加一倍所需天數(shù))和腫瘤生長延遲時(shí)間(即腫瘤體積長到100mm3時(shí)相對于PBS組所需天數(shù))的比較:
[0076]圖 8.2.1.腫瘤倍增時(shí)間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；
5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**P < 0.01，TP812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0077]圖8.2.2.腫瘤生長延遲時(shí)間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.AnnexinV+TRAIL ；5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**P < 0.01,TP812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0078]圖8.3.不同蛋白對 Bel7402 腫瘤抑制作用比較:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.AnnexinV+TRAIL ;5.TP86.25mg/kg ;6.TP812.5mg/kg ;7.TP825mg/kg ;**P < 0.01 ；
[0079]圖8.4.不同蛋白對Bel7402腫瘤倍增時(shí)間和腫瘤生長延遲時(shí)間的比較:
[0080]圖 8.4.1.腫瘤倍增時(shí)間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；
5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**P < 0.01，TP812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0081]圖8.4.2.腫瘤生長延遲時(shí)間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.AnnexinV+TRAIL ；5.ΤΡ86.25mg/kg ；6.ΤΡ812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**Ρ < 0.01,ΤΡ812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0082]圖8.5.不同蛋白對Colo205腫瘤抑制作用t匕較:1.PBS ；2.Annexin V ；
3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ；*p〈0.05;**p〈0.01 ；
[0083]圖8.6.不同蛋白對Colo-205腫瘤倍增時(shí)間和腫瘤生長延遲時(shí)間的比較:
[0084]圖 8.6.1.腫瘤倍增時(shí)間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；
5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**P < 0.01，TP812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0085]圖8.6.2.腫瘤生長延遲時(shí)間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.AnnexinV+TRAIL ；5.ΤΡ86.25mg/kg ；6.ΤΡ812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**Ρ < 0.01,ΤΡ812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++〈0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較。
[0086]圖9.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8治療A549腫瘤的病理分析。
[0087]TUNEL法分析不同蛋白誘導(dǎo)的腫瘤凋亡情況:1.PBS ；2.Annexin V ；3.TRAIL ；
4.AnnexinV+TRAIL ；5.TP8。
[0088]圖10.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8與聯(lián)合抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549腫瘤效果評價(jià)。
[0089]1.PBS ；2.順鉬；3.TP8 ；4.TP8+ 順鉬;**ρ〈0.01。

【具體實(shí)施方式】
[0090]實(shí)施例1
[0091]腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的設(shè)計(jì)、表達(dá)、制備與鑒定
[0092]利用計(jì)算機(jī)輔助結(jié)構(gòu)模擬和分子設(shè)計(jì)，在SGI計(jì)算機(jī)工作站上，利用MSI公司的分子設(shè)計(jì)軟件(InsightI1、Discover等模塊),在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體和膜聯(lián)蛋白V晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體和膜聯(lián)蛋白V融合蛋白，進(jìn)行分子模建和分子設(shè)計(jì)，確定連接肽的氨基酸長度。
[0093]在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)中，發(fā)明人利用對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)模擬和分子設(shè)計(jì)，在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體和膜聯(lián)蛋白V晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體與膜聯(lián)蛋白V之間的連接肽氨基酸序列和長度進(jìn)行分子模建和分子設(shè)計(jì)，確定連接肽的氨基酸長度。結(jié)果發(fā)現(xiàn):由于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體和膜聯(lián)蛋白V的N端及C端都暴露在分子的外表面，因此無論將2個(gè)分子的哪一個(gè)分子放在N端都能夠保持各自的空間結(jié)構(gòu)，不影響2個(gè)分子與各自靶點(diǎn)或者受體的結(jié)合。在計(jì)算機(jī)分子設(shè)計(jì)時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn):在添加1-30個(gè)氨基酸短肽長度內(nèi)，只要短肽由不含支鏈的、柔性較大的氨基酸殘基、例如:甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等組成，都不會對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白中的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體和膜聯(lián)蛋白V結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，也不會影響2者的功能；而且在分子動力學(xué)所計(jì)算的不含支鏈、柔性較大的30個(gè)氨基酸短肽長度范圍內(nèi)，短肽長度越長，對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體和膜聯(lián)蛋白V的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的擾動越??；因此，30個(gè)氨基酸以上的連接肽也不會影響腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的功能。此外，即使在2個(gè)分子之間不添加連接肽將兩個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行融合，兩個(gè)蛋白質(zhì)也可以較好地保持各自的空間結(jié)構(gòu)，2個(gè)分子與各自靶點(diǎn)或者受體的結(jié)合也可以基本不受影響，但是融合蛋白的活性還是會受到一定程度的影響。
[0094]在分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，我們嘗試表達(dá)了連接肽為甘氨酸(SEQ ID N0:2)、丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(SEQ ID N0:3)的短肽的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白，含有以上三個(gè)重復(fù)的甘氨酸-(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)_(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)-(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)的25個(gè)氨基酸殘基的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白(SEQ ID NO:4)，以及含有甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸的短肽的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白(SEQ ID NO:1 )，而且在每種連接肽情況下，都嘗試將腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體和膜聯(lián)蛋白V分別置于N端(例如腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白PT8，SEQ ID NO:5)，都獲得了相似的結(jié)果和活性，從而證明了計(jì)算機(jī)分子設(shè)計(jì)的正確性。當(dāng)然不同融合蛋白質(zhì)的表達(dá)量會有一些差別，相形之下，添加了 14個(gè)氨基酸連接肽的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白(Annexin V-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸_甘氨酸_絲氨酸_甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-TRAIL，代號TP8，即第8種融合蛋白)(SEQ ID NO:1)的表達(dá)水平最高，并且其表達(dá)產(chǎn)物可溶性表達(dá)水平最好，因此便于大規(guī)模制備和分離純化，其它融合蛋白質(zhì)不是表達(dá)水平略低、就是表達(dá)產(chǎn)物的可溶性較差，不利于大規(guī)模分離純化用于動物實(shí)驗(yàn)。因此，本專利著重呈現(xiàn)第8種融合蛋白(即TP 8)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
[0095]本專利還構(gòu)建了由腫瘤壞死因子家族另一細(xì)胞凋亡蛋白腫瘤壞死因子(TNF)構(gòu)成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白(Annexin V-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸_甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-TNF) (SEQ ID NO:6)，也獲得了與TRAIL融合蛋白相似的結(jié)果。
[0096]腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8表達(dá)載體的構(gòu)建:從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取人源的Annexin V和人源TRAIL可溶部分的mRNA序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物，并化學(xué)合成相應(yīng)的引物，其中，Annexin V 上游引物:5’ -GTTCCATGGGCGCACAGGTTCT CAGAGGCA-3’，下游引物:5，-ACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCGTCATCTTCTCCACAGAGCA-3，；TRAIL上游引物為:5’-GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT GTG AGAGAA-3’，下游引物為:5’ -TCCGCTCGAGTTAGCCAACTAAAAA GGCCC CG-3’。
[0097]以Annexin V表達(dá)質(zhì)粒和TRAIL表達(dá)質(zhì)粒為模板，用PCR的方法分別擴(kuò)增得到AnnexinV和TRAIL序列。PCR反應(yīng)的條件為:Annexin V基因:94°C熱變性I分鐘，60°C退火I分鐘，72C延伸1.5分鐘，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。TRAIL基因:94°C熱變性I分鐘，60°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。以PCR擴(kuò)增的AnnexinV和TRAIL為模板，以Annexin V上游引物和TRAIL下游引物為上下游引物，再次PCR擴(kuò)增，得到TP8序列。PCR反應(yīng)條件為:94°C熱變性I分鐘，65 °C退火I分鐘，72 °C延伸2分鐘，共進(jìn)行26個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后進(jìn)行Nco I/XhoI雙酶切，表達(dá)載體pET28a也經(jīng)Nco I/XhoI雙酶切，使用T4DNA連接酶將兩條雙酶切回收片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO菌株感受態(tài)細(xì)胞，用限制性內(nèi)切酶酶切及PCR法篩選陽性克隆，得到質(zhì)粒pET28a-TP8，經(jīng)過DNA序列測序分析驗(yàn)證序列的正確性。
[0098]腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的表達(dá)純化:表達(dá)質(zhì)粒pET28a_TP8轉(zhuǎn)化到埃希氏大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌中，并在宿主菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將平板中的新鮮轉(zhuǎn)化的菌接種到LB (卡那霉素)培養(yǎng)基中，在搖床上37°C培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)入到新鮮的LB(卡那霉素)培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)2.5小時(shí)左右，0D600nm為0.6~0.8左右時(shí)將培養(yǎng)溫度降至28°C繼續(xù)培養(yǎng)0.5小時(shí)后，加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)TP8表達(dá)4小時(shí)。誘導(dǎo)表達(dá)的菌體經(jīng)50mM Tris, pH8.0重懸后,加入終濃度為lmg/ml的溶菌酶，20mM Cac12,65%的鹿糖，室溫下攪拌I小時(shí)。用50mM Tris, pH8.0, 20mM Cac12將菌液稀釋20倍并于室溫下攪拌I小時(shí)，離心去上清，沉淀用50mM Tris,pH8.0, 20mM EDTA解離后，超聲使核酸斷裂。離心回收可溶性蛋白，并用硫酸銨沉淀收集由10%-50%的硫酸銨沉淀下來的蛋白，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸氫二鈉，1mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，pH7.6)溶解后用Zn-NTA親和柱進(jìn)行純化。平衡緩沖液為50mM磷酸氫二鈉，1mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，pH7.6，洗脫緩沖液為50mM磷酸氫二鈉，1mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，60mM咪唑，pH7.6，收集洗脫峰。收集到的蛋白溶液對50mM Tris, pH8.0透析除去鹽離子后,用DEAE-Sepharose陰離子交換樹脂進(jìn)一步純化。平衡緩沖液為50mM Tris, pH8.0, 1mM氯化鈉，洗滌緩沖液為50mMTris，pH8.0，70mM氯化鈉，洗脫緩沖液為50mM Tris,pH8.0, 220mM氯化鈉，收集洗脫峰。蛋白溶液對PBS透析，除去Tris，過濾除菌，分裝，保存于_80°C。
[0099]純化好的TP8蛋白分布用12%的還原性SDS-PAGE和8%的還原性SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍(lán)染色檢測。還原性SDS-PAGE用于分析蛋白的純度，非還原性SDS-PAGE用于分析二聚體以及三聚體形成情況。
[0100]在以往的報(bào)道中，野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，常常會以無生物活性的包涵體產(chǎn)物形式存在；本專利發(fā)明的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白在TRAIL的基礎(chǔ)上又增加了 318個(gè)氨基酸，該融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)應(yīng)當(dāng)比野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體更加容易形成無生物活性的包涵體產(chǎn)物、純化將更為困難。本發(fā)明通過優(yōu)化表達(dá)條件和分離純化過程、成功地實(shí)現(xiàn)了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白以可溶性形式表達(dá)，而且經(jīng)過硫酸銨沉淀、鎳金屬親和層析和離子樹脂層析，純化獲得了具有生物活性的、高純度的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白，純度高達(dá)98%以上(圖1.1)。而且在本專利的表達(dá)條件和純化工藝下，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體TRAIL及TP8具有很高的聚體比例(圖1.3)，這一點(diǎn)在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體表達(dá)和純化的同類工作中是難得一見的。腫瘤壞死因子超家族蛋白都有形成單體、二聚體和三聚體的特性，并且它們的生物學(xué)活性依賴于二聚體和三聚體形式，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體也不例外。為了檢測與Annexin V融合后是否對腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白形成聚體的能力產(chǎn)生影響，非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示:野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體單獨(dú)或者與膜聯(lián)蛋白V混合存在時(shí)，有70.14%為單體形式，27.25%為二聚體形式，2.62%為三聚體形式。而腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的單體形式僅在31.69%，38.70%為二聚體形式，三聚體形式則高達(dá)29.61%，三聚體形式比野生型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體高11倍。Annexin V增強(qiáng)了融合蛋白TP8的二聚體和三聚體形成能力，這與TP8較TRAIL有更強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡的能力相關(guān)。重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白具有形成聚體的能力。以上結(jié)果證明:本專利表達(dá)、純化的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白確實(shí)具有正確的空間結(jié)構(gòu)、比以往報(bào)道的大腸桿菌表達(dá)的TRAIL具有更好的生物活性。
[0101]實(shí)施例2
[0102]人源的不同腫瘤細(xì)胞系對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的敏感性檢測
[0103]將不同的人源腫瘤細(xì)胞株:結(jié)腸癌Colo-205、乳腺癌MDA-MB-231、宮頸癌Hela、小細(xì)胞肺癌H446、肝癌PLC、非小細(xì)胞肺癌H1229、肝癌Bel7402、非小細(xì)胞肺癌A549、乳腺癌MCF-7、淋巴瘤U937、肝癌H印G2、結(jié)腸癌HT29、乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞MDA-MB-435、舌鱗癌TCA8113、結(jié)腸癌HCT116、胰腺癌SW1990、K562細(xì)胞，慢性髓原白血病K562等在含10%新生牛血清的DMEM(含100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素)中，并放置37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中生長。K562和Colo205在含10%新生牛血清的RPMI1640(含100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素)中，并放置37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中生長。所有細(xì)胞均購自ATCC。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長到70%時(shí)加藥，濃度為10ng/ml，30ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml, 400ng/ml, 600ng/ml, 800ng/ml,每個(gè)濃度三個(gè)孔重復(fù)，藥物處理18小時(shí)后，經(jīng)胰酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200 μ I結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結(jié)合緩沖液并轉(zhuǎn)入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI)，在30分鐘內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。由于研究的人腫瘤細(xì)胞株數(shù)量眾多，下面僅以非小細(xì)胞肺癌A549為例，簡要描述研究腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8體外、體內(nèi)的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制的方法:
[0104]細(xì)胞形態(tài)分析:取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長到70%時(shí)用不同的藥物處理，藥物及其濃度如下:Annexin V (360ng/ml) , TRAIL (180ng/ml) , Annexin V (360ng/ml)+TRAIL (180ng/ml)以及TP8 (600ng/ml),以PBS作為對照，處理6小時(shí)后，用PBS洗兩遍，在顯微鏡下觀察。
[0105]不同藥物對誘導(dǎo)A549凋亡的分析:取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長到70%時(shí)用不同的藥物處理，藥物及其濃度如下:Annexin V(360ng/ml), TRAILC 180ng/ml), AnnexinV (360ng/ml) +TRAIL (180ng/ml)以及 TP8 (600ng/ml)，以 PBS 作為對照，處理 6 小時(shí)后，經(jīng)胰酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200μ I結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結(jié)合緩沖液并轉(zhuǎn)入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI)，在30分鐘內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。
[0106]藥物作用劑量對誘導(dǎo)A549凋亡的分析:取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長到70%時(shí)用不同濃度的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8處理即10ng/ml, 30ng/ml,50ng/ml, 100ng/ml, 200ng/ml, 400ng/ml, 600ng/ml, 800ng/ml,處理 6 小時(shí)后，經(jīng)膜酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200 μ I結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結(jié)合緩沖液并轉(zhuǎn)入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI )，在30分鐘內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。
[0107]藥物處理時(shí)間對誘導(dǎo)A549凋亡的分析:取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長到70%時(shí)用600ng/mlTP8分別處理I小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)，10小時(shí)后經(jīng)胰酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200 μ I結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結(jié)合緩沖液并轉(zhuǎn)入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI )，在30分鐘內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。
[0108]TRAIL、RGD-TRAIL以及TP8誘導(dǎo)A549凋亡的效果比較:取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長到70%時(shí)用等摩爾數(shù)的TRAIL，RGD-TRAIL以及TP8處理，處理6小時(shí)后，經(jīng)胰酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200 μ I結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結(jié)合緩沖液并轉(zhuǎn)入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI )，在30分鐘內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。
[0109]本發(fā)明在體外比較了一系列腫瘤細(xì)胞對TRAIL和TP8敏感性的差異。TP8較TRAIL有更強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，其能誘導(dǎo)TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的腫瘤細(xì)胞凋亡。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于結(jié)腸癌細(xì)胞Colo-205的EC50 (半有效劑量)是1.67nM，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.61nM，活性提高2.74倍；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的EC50是2.96nM，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.57nM,活性提高5.19倍；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于宮頸癌細(xì)胞Hela的EC50是33.75nM，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.84nM，活性提高40.18倍；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H446的EC50是48.63nM，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.85nM，活性提高57.21倍；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于肝癌細(xì)胞PLC的EC50是78.97nM，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.46nM，活性提高171.67倍；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1229的EC50是67.71nM，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為l.0lnM，活性提高67.04倍；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于肝癌細(xì)胞Bel7402的EC50是389.5nM，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為1.58nM，活性提高246.52倍；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的EC50大于1000.0nM (即本發(fā)明所設(shè)實(shí)驗(yàn)條件下無法檢出)，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為5.82nM，活性至少提高171.82倍以上；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于乳腺癌細(xì)胞MCF-7的EC50大于1000.0nM (即本發(fā)明所設(shè)實(shí)驗(yàn)條件下無法檢出)，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.57nM，活性至少提高1754.39倍以上；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的EC50對于淋巴瘤細(xì)胞U937的EC50大于1000.0nM (即本發(fā)明所設(shè)實(shí)驗(yàn)條件下無法檢出)，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為2.96nM，活性至少提高337.84倍以上；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體對于肝癌HepG2細(xì)胞的EC50大于1000.0nM (即本發(fā)明所設(shè)實(shí)驗(yàn)條件下無法檢出)，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為3.82nM，活性至少提高261.87倍以上。
[0110]由上述結(jié)果可見，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白能誘導(dǎo)TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的腫瘤細(xì)胞凋亡，而且對于Colo-205和MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行測定EC50實(shí)驗(yàn)時(shí)，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體僅僅需要作用細(xì)胞4小時(shí)，而不是像常規(guī)測定其他腫瘤細(xì)胞時(shí)需要作用24小時(shí)，由此可見腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白具有強(qiáng)烈增強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。而且，無論是對TRAIL高度敏感細(xì)胞，TRAIL中度敏感細(xì)胞，還是TRAIL抵抗細(xì)胞，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的EC50都不超過6nM，這充分說明腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白強(qiáng)大的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性。
[0111]雖然誘導(dǎo)凋亡的能力增強(qiáng)了，但TP8對腫瘤的特異性沒有改變，因?yàn)檎＜?xì)胞系L02和293T不受TP8的影響，即是說TP8不會帶來額外的毒副作用(圖2.1，2.2)。為了確定TP8誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡，經(jīng)等摩爾數(shù)的Annexin V，TRAIL, Annexin V+TRAIL以及TP8處理的A549細(xì)胞分別流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況以及用顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。流式結(jié)果表明，僅TP8誘導(dǎo)了明顯的凋亡(圖3.3)。與流式結(jié)果一致，A549細(xì)胞只在TP8處理后才有明顯的凋亡形態(tài)(圖3.1,3.2)。TP8誘導(dǎo)的A549凋亡具有時(shí)間和劑量依賴性(圖4.1,4.2)。除誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡之外，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白還具有長期的作用效應(yīng)，它能顯著抑制腫瘤細(xì)胞A549的克隆形成(圖3.4)，因此具有抑制腫瘤生長的能力。
[0112]RGD-TRAIL是本課題組研發(fā)的一個(gè)腫瘤靶向性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體變體蛋白，其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性顯著好于野生型TRAIL (中國發(fā)明專利號:ZL200710133862.1)。等摩爾數(shù)的 TRAIL、RGD-TRAIL、TP8 在誘導(dǎo) A549 凋亡時(shí)，RGD-TRAIL較TRAIL效果好，但是TP8的效果最好、為RGD-TRAIL的2倍以上。RGD-TRAIL和TP8誘導(dǎo)的凋亡隨著濃度的升高而增加，TRAIL隨著濃度的升高在誘導(dǎo)凋亡的效果上沒有明顯變化(圖 5.1.)。
[0113]由Annexin V-TNF構(gòu)成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白(SEQ ID NO:6)也在標(biāo)準(zhǔn)的TNF測活細(xì)胞L929上表現(xiàn)出類似的增強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性。
[0114]實(shí)施例3
[0115]腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的作用機(jī)制分析
[0116]Western Blot從蛋白水平檢測與凋亡通路相關(guān)的重要蛋白表達(dá)情況:將A549細(xì)胞置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板生長至80%密度，根據(jù)要求加等摩爾數(shù)的藥物進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后，收取細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞沉淀洗滌一次后，加入適量細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑，Roche公司)懸浮混勻，冰上放置30分鐘后，4°C，12000rpm離心15分鐘，吸取上清，利用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定蛋白濃度,調(diào)整蛋白濃度，加入4X loading buffer并在沸水浴中煮樣5分鐘，樣品置于一 20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0117]按照分子克隆中的配方配制12% SDS-PAGE gel，通過測定的樣品蛋白含量計(jì)算，使各組樣品上樣量保持一致，上樣量為50 μ g。濃縮膠采用80伏恒壓進(jìn)行壓縮，分離膠采用120伏電壓分離，然后使用半干法將SDS-PAGE膠中蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF (polyvinylidenefluoride)膜上，10伏恒壓電轉(zhuǎn)2_3小時(shí)。轉(zhuǎn)印結(jié)束后根據(jù)預(yù)染Marker確定轉(zhuǎn)印效率。然后將轉(zhuǎn)印后的膜放在新鮮配制的5%脫脂奶粉(PBST配制)中進(jìn)行封閉，室溫孵育I小時(shí)。封閉結(jié)束后,根據(jù)抗體說明用含5%脫脂奶粉的PBST溶液稀釋一抗(primary antibody)至最佳工作濃度，將膜包被于一抗中置于4°C作用過夜。然后將膜用PBST置于搖床上輕輕搖蕩洗滌3次，每次5-10分鐘。洗滌完成后包被二抗，將HRP (辣根過氧化物酶)標(biāo)記的二抗用含5%脫脂奶粉的PBST溶液按1:2000稀釋，與膜共同孵育I小時(shí)，同樣以PBST洗滌3次，每次5-10分鐘。最后，按照產(chǎn)品說明配制發(fā)光底物溶液(ECL化學(xué)發(fā)光底物)滴加于PVDF膜上，室溫放置I分鐘，用濾紙將多余發(fā)光液吸干，將膜用保鮮膜包被后放入壓片夾移入暗房，取X光片置于膜上曝光1-5分鐘后，沖洗膠片，根據(jù)曝光條帶判斷蛋白的表達(dá)結(jié)果。
[0118]RT-PCR從mRNA水平檢測與凋亡通路相關(guān)的重要蛋白表達(dá)情況:
[0119](1)細(xì)胞mRNA提取:所有物品均提前用DEPC處理并滅菌(或購買的RNase free產(chǎn)品)。將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后分裝于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%密度后，加藥進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后，PBS洗滌一次。加入1ml Trizol，用移液槍吹打至細(xì)胞完全溶解。室溫放置5分鐘。加入200 μ I的氯仿/ml Trizol，振蕩15秒后室溫放置2-3分鐘，然后于4°C，12000g離心15分鐘。吸取上層(約400 μ I )，轉(zhuǎn)移至另一新印pendorf管中，加入500 μ I異丙醇，混勻，放置10分鐘，4°C，12000g離心10分鐘?？梢奟NA沉淀。棄去上清，加入lml75%乙醇洗滌沉淀，7500g離心5分鐘，在空氣中晾干RNA沉淀，加入30 μ I DEPC處理的DDW溶解，測定RNA濃度及純度，取一部分立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，剩余RNA凍存于-70°C，備用。
[0120](2) RNA逆轉(zhuǎn)錄:采用20 μ I逆轉(zhuǎn)錄體系，將提取的模板RNA約2 μ g與5Xbuffer4y 1,2 μ I dNTP(1mM)，I μ I oligo (dT) 18 (10 μ Μ)，RNase Inhibitorl μ 1，逆轉(zhuǎn)錄酶Rever-Tra Ace- α-1 μ 1，混勻后37°C 30分鐘，85°C水浴反應(yīng)5秒。
[0121](3)半定量PCR:取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，采用其引物進(jìn)行PCR,調(diào)整模板的使用量，然后利用調(diào)整后的模板同時(shí)擴(kuò)增目的基因和GAPDH基因，以GAPDH為參照，觀察不同加藥處理對與凋亡通路相關(guān)蛋白基因RNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。PCR采用20 μ I PCR反應(yīng)體系:2μ IlOXTaq buffer，2y I dNTPs,2y I Mg2+，I μ I 上游引物，I μ I 下游引物，I μ I cDNA 模板，0.5 μ I rTaq polymerase，用 DDW 補(bǔ)足到 20 μ I。PCR 條件:94°C熱變性4min，94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸40s，循環(huán)數(shù)為20-32個(gè)，最后72°C延伸分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀測儀下觀察，拍照記錄。
[0122]所用特異性引物為:DR4上游引物:5 ’ -CAGAACGTCCTGGAGCCTGTAAC-3，，下游引物:5’-ATGTCCATTGCCTGATTCTTTGTG-3’ ；DR5 上游引物:5 ’-GGGAAGAAGATTCTCCTGAGATGTG-3 ’，下游引物:5’-ACATTGTCCTC AGCCCCAGGTCG-3’；DcR2 上游引物:5’_CTTCAGGAAACCAGAGCTTCCCTC-3’，下游引物 5’ -TTCTCCCGTTTGCTTA-TCACACGC-3’ ；Bcl-xl 上游引物:5’ -TTGGACAATGGACTGGTTGA-3’，下游引物:5’ -GTAGAGTGGATGGTC AGTG-3’ ；Bax 上游引物:5’ -AAGAAGCTGAGCGAGTGT-3’，下游引物:5’ -GGAGGAAGTCCAATGTC-3’ ；Bim 上游引物:5’ -ATGAGAAGATCCTCCCTGC T-3’，下游引物:5’ -AATGCATTCTCCACACCAGG-3’;Noxa 上游引物:5’ -GTGCCCTTGGAAACGGAGA-3’，下游引物為:5’ -CCAGCCGCCCAGTCTAATC A_3’;Puma 上游引物:5’ -CAGACTGTGAATCCTGTGCT-3’，下游引物為:5’ -ACAGTATCTTACAGGCTGGG-3’ ；GAPDH上游引物:5’ -ACCACAGTCCAT GCCATCAC-3’，下游引物:5’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ ；
[0123]不同蛋白與A549結(jié)合能力分析:熒光染料FAM標(biāo)記的蛋白FAM-AnnexinV，F(xiàn)AM-TRAIL, FAM-Annexin V+FAM-TRAIL, FAM-TP8 與 A549 于 37°C孵育 30 分鐘，胰酶消化，收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗3遍后，用流式細(xì)胞儀分析。以FAM-BSA作為陰性對照。
[0124]DR4 和 DR5 表達(dá)水平的流式分析:A549 細(xì)胞經(jīng) PBS、Annexin V、TRAIL、AnnexinV+TRAIL、TP8處理6小時(shí)后，收細(xì)胞后，用含有0.2%FBS的PBS洗一遍。細(xì)胞與用含有0.2%FBS的PBS稀釋后的熒光標(biāo)記的抗體在4°C避光孵育I小時(shí)。用含有0.2%FBS的PBS將與抗體孵育后的細(xì)胞洗3遍后，細(xì)胞由4%多聚甲醛固定并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析。以與含有0.2%FBS的PBS孵育的細(xì)胞作為陰性對照。
[0125]Caspase8 和 Caspase3 活性分析:A549 細(xì)胞經(jīng) PBS、Annexin V、TRAIL、AnnexinV+TRAIL、TP8處理6小時(shí)后，收細(xì)胞后Caspase8和Caspase3活性分別用碧云天的Caspase8和CaSpaSe3活性檢測試劑盒進(jìn)行分析。用試劑盒提供的底物和標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。活性檢測的具體操作如下:
[0126]胰酶消化并收集細(xì)胞，600g4°C離心5分鐘，并用PBS洗一次。加入裂解液,冰上裂解15分鐘。4°C 16，000-20，OOOg離心10-15分鐘，上清轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，立即測定cspase活性。將蛋白裂解液加入底物中，37°C孵育I小時(shí)至2小時(shí)，顏色變化較明顯時(shí)，測定A405,同標(biāo)準(zhǔn)曲線對比即可得出caspase活性。
[0127]腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式與TRAIL完全相同，均依賴于Caspase-8。TRAIL, Annexin V+TRAIL以及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白與腫瘤細(xì)胞A549細(xì)胞表面的受體DR4/DR5的結(jié)合能力沒有差異(圖6.3)。下游的信號分子(如DR4, DR5, DcR2以及與線粒體通路相關(guān)的蛋白如Bcl-XL, Bax, Bim, Noxa, Puma)的表達(dá)在不同藥物處理后也無差異(圖6.1,6.2,6.4)。但是Caspase-8, Caspase-3, PARP只有在經(jīng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白處理后才被明顯激活(圖6.1,7.1,7.2)。而且，Caspase-8抑制劑Z-1ETD-FMK可明顯減少腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而Caspase-9抑制劑Z-LEHK-FMK對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白誘導(dǎo)的凋亡無明顯影響(圖7.3)。這充分說明，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白與TRAIL具有完全一樣的作用機(jī)制，其安全性與TRAIL相同。
[0128]此外，我們還構(gòu)建、表達(dá)和制備了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的變體，在該變體中腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的活性中心-TRAIL第230位的半胱氨酸(Cys230)變突變?yōu)楦拾彼帷Ｈ鐖D5.2所示，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白變體就不再具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，這充分說明腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白是通過增加腫瘤細(xì)胞對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體敏感性、即通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用的。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白并未增加了其它誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用方式，因此其具有與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體相同的安全性。
[0129]實(shí)施例4
[0130]腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白在腫瘤動物模型的抗腫瘤療效實(shí)驗(yàn)
[0131]小鼠背部皮下腫瘤模型制備:5-6周齡的雌性裸鼠購于北京軍事研究所。取指數(shù)生長期的A549或Bel7402或Colo205細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用PBS于800 Xg離心洗滌2次。計(jì)數(shù)后PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至17細(xì)胞/ml然后每只小鼠右側(cè)背部皮下經(jīng)皮下注射100 μ L (16細(xì)胞)，一周左右，腫瘤大小生長至50mm3左右，將小鼠分成8組，每組8只。分別用PBS、Annexin V、TRAIL、Annexin V+TRAIL、TP8以及化療藥物給藥，蛋白類藥物及PBS經(jīng)腹腔注射給藥，每天注射一次，共治療14天?；熕幬锝?jīng)尾靜脈給藥，每四天注射一次，共治療14天。從開始治療后每兩天測量腫瘤大小，并按下列公式計(jì)算腫瘤體積:0.5XL1X (L2)2,其中LI為腫瘤長軸，L2為腫瘤短軸。治療第15天,處死小鼠。
[0132]腫瘤組織切片⑶31染色分析:給藥結(jié)束后，處死老鼠，立即剖取出腫瘤組織用OTC包埋后，用冰凍切片機(jī)切片，切片厚度為5 μ m。切片完成后，風(fēng)干，在冰丙酮中固定10分鐘，室溫晾干。用PBST洗片三次，擦干邊緣，用油筆沿組織切片外緣畫圈，用羊血清封閉液室溫封閉30min。用抗體稀釋液稀釋一抗(⑶311:50)。PBST沖洗片子后包被一抗4°C過夜。PBST沖洗3-5次，擦干邊緣。包被二抗，37°C，45min。PBST洗三次。擦干邊緣。DAPI染細(xì)胞核，用熒光顯微鏡鏡檢。
[0133]腫瘤組織切片TUNEL分析:給藥結(jié)束后，處死老鼠，立即剖取出腫瘤組織用OTC包埋后，用冰凍切片機(jī)切片，切片厚度為5 μ m。切片完成后，風(fēng)干，在冰丙酮中固定10分鐘，室溫晾干。用PBST洗片三次，擦干邊緣，用油筆沿組織切片外緣畫圈，用蛋白酶K室溫孵育5分鐘，TBS洗一次。3%H202室溫孵育5分鐘后，TBS洗一次。TdT Equilibrat1n Buffer室溫孵育 15 分鐘，吸干 TdT buffer,滴加 TdT labeling react1n mixture, 37°C孵育 1.5 小時(shí)，TBS洗三次并吸干，加入stop buffer室溫孵育10分鐘，吸干stop buffer,加入conjugatebuffer,室溫孵育30分鐘，TBS洗一次并吸干，滴加DAB在組織表面，室溫孵育15分鐘后，ddH20洗一次并吸干，在組織表面滴加甲基綠室溫孵育3分鐘，吸去甲基綠，在組織表面滴加100%乙醇三次至組織表面無綠色。在組織表面迅速滴加二甲苯，并迅速吸干，重復(fù)一次，用甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。
[0134]本發(fā)明采用了三種腫瘤模型，即對TRAIL不敏感的A549腫瘤模型，對TRAIL中度敏感的Bel7402腫瘤模型以及對TRAIL敏感的Colo-205腫瘤模型評估了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8的抗腫瘤效果。在A549腫瘤模型中，腹腔注射TRAIL (5mg/kg/天)，Annexin V (7.5mg/kg/天)，TRAIL (5mg/kg/天)+Annexin V (7.5mg/kg/天)，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8 (6.25mg/kg/天、12.5mg/kg/天、25mg/kg/天)。與陰性對照組(磷酸緩沖液組)相比(腫瘤倍增時(shí)間為5.3天),Annexin V, TRAIL, Annexin V+TRAIL未能有效抑制腫瘤生長，三組的腫瘤倍增時(shí)間分別為:6.1天、6.1天、6.0天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時(shí)間(體積達(dá)到100mm3時(shí)，相對于PBS組所需時(shí)間)分別為:0天、0.6天、1.1天。而不同劑量的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8均能明顯抑制腫瘤生長，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8劑量的增加而增強(qiáng)，三個(gè)劑量組的腫瘤倍增時(shí)間分別為:6.5天、7.4天、7.9天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時(shí)間分別為:2.8天、6.9天、12.8天(圖8.1、8.2)。
[0135]在Bel7402 腫瘤模型中，腹腔注射 TRAIL (5mg/kg/天)，Annexin V (7.5mg/kg/天)，TRAIL (5mg/kg/天)+Annexin V (7.5mg/kg/天),腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8 (6.25mg/kg/天、12.5mg/kg/天、25mg/kg/天)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8 (12.5mg/kg組)抑制腫瘤生長的效果較陰性對照組(磷酸緩沖液組),Annexin V組，TRAIL組以及Annexin V+TRAIL組要明顯，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8劑量的增加而增強(qiáng)。與陰性對照組(磷酸緩沖液組)相比(腫瘤倍增時(shí)間為7.3天)，Annex in V，TRAIL, Annexin V+TRAIL未能有效抑制腫瘤生長，三組的腫瘤倍增時(shí)間分別為:7.8天、8.0天、7.6天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時(shí)間分別為:4天、5.4天、5.0天。而不同劑量的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8均能明顯抑制腫瘤生長，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8濃度的增加而增強(qiáng)，三個(gè)劑量組的腫瘤倍增時(shí)間分別為:9.0天、9.3天、10.1天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時(shí)間分別為:9.3天、10.0天、18.5天(圖8.3,8.4)。
[0136]在Colo-205 腫瘤模型中，腹腔注射 TRAIL (5mg/kg/天)，Annexin V (7.5mg/kg/天)，TRAIL (5mg/kg/天)+Annexin V (7.5mg/kg/天),腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8 (6.25mg/kg/天、12.5mg/kg/天、25mg/kg/天)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8 (12.5mg/kg組)抑制腫瘤生長的效果較陰性對照組(磷酸緩沖液組)、Annexin V組、TRAIL組以及Annexin V+TRAIL組要明顯，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8劑量的增加而增強(qiáng)。與陰性對照組(磷酸緩沖液組)相比(腫瘤倍增時(shí)間為10.0天)，Annexin V, TRAIL, Annexin V+TRAIL未能有效抑制腫瘤生長,三組的腫瘤倍增時(shí)間分別為:10.2天、12.5天、10.4天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時(shí)間分別為:0.9天、4.6天、3.1天。而不同劑量的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8均能明顯抑制腫瘤生長，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8濃度的增加而增強(qiáng)，三個(gè)劑量組的腫瘤倍增時(shí)間分別為:14.5天、15.0天、14.0天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時(shí)間分別為:12.2天、18.3天、22天(圖8.5,8.6)。
[0137]用TUNEL對腫瘤組織切片中的腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行了評估。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，僅TP8組能夠明顯地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡(圖9)。
[0138]實(shí)施例5
[0139]腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8與順鉬聯(lián)用抑制腫瘤生長的療效評價(jià)實(shí)驗(yàn)
[0140]接種在皮下的A549腫瘤大小生長至50-100mm3左右，將小鼠分成8組，每組8只。分別用PBS、TP8 (6.25mg/kg/day)以及順鉬(5mg/kg/day)進(jìn)行治療。TP8與PBS經(jīng)腹腔注射給藥，每天注射一次，共治療14天。順鉬經(jīng)尾靜脈給藥，每四天注射一次，共治療14天。從開始治療后每兩天測量腫瘤大小，并按下列公式計(jì)算腫瘤體積:0.5XL1X (L2)2，其中LI為腫瘤長軸，L2為腫瘤短軸。
[0141]與PBS陰性對照組相比，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白TP8、順鉬以及TP8-順鉬聯(lián)用均能抑制A549腫瘤的生長。TP8和順鉬聯(lián)用時(shí)，抑制A549腫瘤生長的效果明顯好于TP8、以及順鉬單獨(dú)使用時(shí)的治療效果。PBS組腫瘤倍增時(shí)間為16.1天，順鉬組腫瘤倍增時(shí)間為31.35天，TP8組腫瘤倍增時(shí)間為30.96天，TP8與順鉬聯(lián)用組腫瘤倍增時(shí)間為40.92天。腫瘤生長延遲時(shí)間(即腫瘤體積達(dá)到100mm3時(shí)相對PBS組所需時(shí)間)順鉬組為15.25天，TP8組為14.87天，TP8與順鉬聯(lián)用組為24.83天(圖10)。
[0142]本發(fā)明還嘗試將腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白與抗腫瘤生物治療藥物，如重組內(nèi)皮抑素(Endostatin)、血管抑素(Vasostatin)等聯(lián)合使用，也取得了相似的協(xié)同治療效果。
[0143]本發(fā)明還嘗試將腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白與抗腫瘤中藥成分，如雷公藤內(nèi)酯醇等聯(lián)合使用，也取得了相似的協(xié)同治療效果。
[0144]本發(fā)明還嘗試將腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白與本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)研究多年的抗腫瘤減毒沙門氏菌VNP20009聯(lián)合使用，也取得了相似的協(xié)同治療效果。
[0145]本發(fā)明還嘗試?yán)媚[瘤靶向性的減毒沙門氏菌VNP20009為基因治療載體，利用本實(shí)驗(yàn)室前述開發(fā)的技術(shù)(《治療基因在厭氧組織靶向性遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)方法及應(yīng)用》中國發(fā)明專利申請?zhí)?201010565011.6)進(jìn)行腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白的基因治療。利用減毒沙門氏菌VNP20009將腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒在腫瘤動物中進(jìn)行基因治療，取得了比單獨(dú)用減毒沙門氏菌VNP20009治療更好的治療效果。
[0146]以膜聯(lián)蛋白和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體為主要成分而構(gòu)成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白具有顯著強(qiáng)大的抗多種腫瘤的生物活性、能夠克服多種腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的不敏感或者抵抗，并且能夠與化療藥物、生物藥物、基因治療、微生物藥物、中藥等治療方法聯(lián)合應(yīng)用，產(chǎn)生更好的治療效果。
[0147]因此，由具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白家族成員蛋白質(zhì)或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白家族成員蛋白質(zhì)衍生物與腫瘤壞死因子家族中具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的成員蛋白質(zhì)或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白衍生物構(gòu)成的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白具有顯著增強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物活性、能夠克服目前廣泛存在的包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種病理細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的不敏感或者抵抗，并且能夠與現(xiàn)有的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物或者治療方法(化療藥物、生物藥物、基因治療、微生物藥物、中藥等)聯(lián)合應(yīng)用，產(chǎn)生更好的治療效果。
[0148]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考一樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上訴講授內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種修改或改動，這些等價(jià)形式均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0149]

【權(quán)利要求】
1.一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白，其特征在于:它包括膜聯(lián)蛋白的氨基酸序列、腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白的氨基酸序列、以及位于膜聯(lián)蛋白氨基酸序列和腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白氨基酸序列之間的連接肽序列3部分，其中所述的膜聯(lián)蛋白是指具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白家族成員或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白家族成員衍生物，所述的腫瘤壞死因子家族細(xì)胞凋亡蛋白是指腫瘤壞死因子家族中具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的成員蛋白質(zhì)或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族成員衍生物。
2.一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白，其特征在于:它包括膜聯(lián)蛋白V的氨基酸序列或具有磷脂結(jié)合活性的膜聯(lián)蛋白V衍生物序列、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體的氨基酸序列或具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體衍生物序列、以及位于膜聯(lián)蛋白V的氨基酸序列和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體氨基酸序列之間的連接肽序列3部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白，其特征在于:所述連接肽序列由1-30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-6中所示。
5.一種分離的DNA分子，其特征在于:它編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID NO:7~12中所示。
7.—種載體,其特征在于:它含有權(quán)利要求5或6所述的DNA分子。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于:它含有權(quán)利要求7所述的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于:它包括重組大腸埃希菌BL21。
10.一種制備權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步驟:在適合表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于:所述宿主細(xì)胞在低溫下進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，所述低溫指10-35°c。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于:所述分離融合蛋白采用離子交換層析和金屬親和層析。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白在制備誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的治療藥物中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體融合蛋白在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利 要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用包括將所述融合蛋白單獨(dú)用于制備腫瘤治療藥物，或與現(xiàn)有的腫瘤治療藥物聯(lián)合用藥，或與現(xiàn)有的腫瘤治療藥物組成組合物，或與現(xiàn)有化療、放療、中藥治療、生物治療等方法在腫瘤治療中聯(lián)合應(yīng)用。
16.一種藥物組合物，其特征在于:包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白。
【文檔編號】C12N15/63GK104177500SQ201310432137
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月24日
【發(fā)明者】華子春, 邱樊, 胡敏進(jìn) 申請人:江蘇靶標(biāo)生物醫(yī)藥研究所有限公司