一種從茶葉籽粕中提取酪氨酸酶抑制劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及酪氨酸酶抑制劑的提取方法，旨在提供一種從茶葉籽粕中提取酪氨酸酶抑制劑的方法。該方法包括以下步驟：將茶葉籽粕預(yù)處理后進(jìn)行脫脂，然后加入乙醇水溶液提取，離心得到濾渣和提取液；向?yàn)V渣中加入緩沖液，進(jìn)行浸提、超聲提取、離心得到提取液；將之前得到的提取液真空濃縮后，萃取得到萃余液，將之后得到的提取液用60%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫得到60%乙醇洗脫液；將萃余液和60%乙醇洗脫液混合，濃縮后冷凍干燥得到酪氨酸酶抑制劑。本發(fā)明有效提高了目標(biāo)物的萃取精度，大大提高了提取的效率，可以有效提高茶葉籽粕資源的經(jīng)濟(jì)效益，且制備的酪氨酸酶抑制劑是一種天然高效的酪氨酸酶抑制劑，對(duì)酪氨酸酶的抑制效果顯著。
【專利說(shuō)明】一種從茶葉籽粕中提取酪氨酸酶抑制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于酪氨酸酶抑制劑的提取方法，特別涉及一種從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑色素沉積形成的各類色斑給現(xiàn)代人尤其是女性造成了生理和心理的困擾，祛斑已是眾多女性美容的首要目標(biāo)。研究表明，酪氨酸酶是黑色素形成的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的銅結(jié)合酶，通過(guò)將酪氨酸羥化，產(chǎn)生L-3，4- 二羥基苯丙氨酸(L-D0PA)，然后再將L-DOPA進(jìn)一步氧化成多巴醌，從而形成黑色素。同時(shí)，酪氨酸酶在果蔬保存和運(yùn)輸過(guò)程產(chǎn)生的褐變中扮演著重要角色，能降低果蔬的外觀和品質(zhì)，從而降低其價(jià)值。因此，對(duì)酪氨酸酶的抑制不僅能有效抑制黑色素形成，從而阻滯人體各類色斑的形成，而且能有效防止果蔬褐變，保持其品質(zhì)和價(jià)值。
[0003]茶葉籽柏是茶葉籽榨油后的固體殘?jiān)?。?009年12月衛(wèi)生部批準(zhǔn)將茶葉籽油列入新食品資源，茶葉籽油生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，造成茶葉籽柏這一加工副產(chǎn)物的產(chǎn)量也不斷增加。研究表明，茶葉籽柏中含有包括多酚、多糖、皂苷和蛋白等多種生物活性成分，具有極高的開發(fā)價(jià)值。然而，目前除少量茶葉籽柏被作為肥料低價(jià)值利用外，這一生物資源還未被有效開發(fā)。近年來(lái)，從植物中提取安全而有效的天然酪氨酸酶抑制劑備受關(guān)注。目前還未見從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑的相關(guān)報(bào)道或?qū)＠?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能有效利用茶葉籽柏資源，且能提取出天然酪氨酸酶抑制劑的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的解決方案是:
[0005]提供一種從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，包括粉碎茶葉籽柏，包括以下具體步驟:
[0006]步驟A:將茶葉籽柏預(yù)處理后進(jìn)行脫脂，以茶葉籽柏和體積濃度95%的乙醇水溶液為Ig:15ml~Ig:25ml的比例，向脫脂后的茶葉籽柏中加入體積濃度95%的乙醇水溶液，在40~50°C下提取30~40min，然后以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，得到濾渣和提取液；
[0007]步驟B:以步驟A得到的濾洛和緩沖液為Ig:20ml~Ig:30ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入緩沖液，在40~60°C下浸提2~3h，再超聲提取10~20min后，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，得到提取液；所述緩沖液為PH是7~9，且含占脫脂后茶葉籽柏干重3~5%的堿性蛋白酶的緩沖液；
[0008]步驟C:將步驟A得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5~1/15，然后以濃縮后的提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，向濃縮后的提取液中加入氯仿進(jìn)行萃取，得到萃余液；
[0009]步驟D:將步驟B得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5~1/7，過(guò)DlOl大孔樹脂進(jìn)行柱層析，用體積濃度分別為20%、60%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為lml/min,收集60%乙醇洗脫液；
[0010]步驟E:將步驟C中得到的萃余液和步驟D中得到的60%乙醇洗脫液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑。
[0011 ] 作為進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟A中的預(yù)處理是將茶葉籽柏粉碎，然后過(guò)40~60目篩。
[0012]作為進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟A中的脫脂方法是:按照預(yù)處理后的茶葉籽柏和正己烷為Ig:10ml~Ig:20ml的比例，向預(yù)處理后的茶葉籽柏中加入正己烷，在30~50°C下浸提I~2h，然后以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后棄上清液，取殘?jiān)娓伞?br> [0013]作為進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟B中的堿性蛋白酶的活力不小于20000U/g。
[0014]作為進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟B中的緩沖液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
[0015]作為進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟B中的超聲提取的頻率是150~250W。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0017]本發(fā)明通過(guò)極性區(qū)別提取有效提高了目標(biāo)物的萃取精度，并通過(guò)酶法結(jié)合超聲提取大大提高了提取的效率，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，本發(fā)明中制備的酪氨酸酶抑制劑一種天然高效的酪氨酸酶抑制劑，對(duì)酪氨酸酶的抑制效果顯著。此外，本發(fā)明技術(shù)可以有效提高茶葉籽柏資源的經(jīng)濟(jì)效益。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中提取的酪氨酸酶抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制效果對(duì)比圖。【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:
[0020]本發(fā)明從茶果皮中提取血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶抑制劑的方法具體步驟包括:
[0021]步驟A:將茶葉籽柏預(yù)處理，預(yù)處理方法是將茶葉籽柏粉碎，然后過(guò)40~60目篩；茶葉籽柏預(yù)處理后進(jìn)行脫脂，脫脂方法是:按照預(yù)處理后的茶葉籽柏和正己烷為Ig:IOml~Ig:20ml的比例，向預(yù)處理后的茶葉籽柏中加入正己烷，在30~50°C下浸提I~2h,然后以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后棄上清液，取殘?jiān)娓?。以茶葉籽柏和體積濃度95%的乙醇水溶液為Ig:15ml~Ig:25ml的比例，向脫脂后的茶葉籽柏中加入體積濃度95%的乙醇水溶液，在40~50°C下提取30~40min，然后以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，得到濾渣和提取液。
[0022]步驟B:以步驟A得到的濾洛和緩沖液為Ig:20ml~Ig:30ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入緩沖液，在40~60°C下浸提2~3h，再用頻率為150~250W的超聲提取10~20min后，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，得到提取液。所述緩沖液為PH是7~9，且含占脫脂后茶葉籽柏干重3~5%的堿性蛋白酶的緩沖液，所述堿性蛋白酶的活力不小于20000U/g,緩沖液優(yōu)選磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
[0023]步驟C:將步驟A得到的 提取液真空濃縮到原體積的1/5~1/15，然后以濃縮后的提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，向濃縮后的提取液中加入氯仿進(jìn)行萃取，得到萃余液；
[0024]步驟D:將步驟B得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5~1/7，過(guò)DlOl大孔樹脂進(jìn)行柱層析，用體積濃度分別為20%、60%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為lml/min,收集60%乙醇洗脫液；
[0025]步驟E:將步驟C中得到的萃余液和步驟D中得到的60%乙醇洗脫液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑。
[0026]下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)的專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0027]實(shí)施例1 [0028]步驟A:將茶葉籽柏預(yù)處理，預(yù)處理方法是將茶葉籽柏粉碎，然后過(guò)40目篩；茶葉籽柏預(yù)處理后進(jìn)行脫脂，脫脂方法是:按照預(yù)處理后的茶葉籽柏和正己烷為Ig =IOml的比例，向預(yù)處理后的茶葉籽柏中加入正己烷，在30°C下浸提2h，然后5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘后棄上清液，取殘?jiān)娓?；以茶葉籽柏和體積濃度95%的乙醇為Ig:15mlml的比例，向20g脫脂后的茶葉籽柏中加入體積濃度95%的乙醇，在40°C下提取40min，然后12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘后，得到濾渣和提取液；
[0029]步驟B:以步驟A得到的濾渣和磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為Ig:20ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，在40°C下浸提3h，再用頻率為150W的超聲提取20min后，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，得到提取液；所述磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為PH是7，且含占脫脂后茶葉籽柏干重3%的堿性蛋白酶的緩沖液，所述堿性蛋白酶的活力不小于20000U/g ；
[0030]步驟C:將步驟A得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5，然后以濃縮后的提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，向濃縮后的提取液中加入氯仿進(jìn)行萃取，得到萃余液；
[0031]步驟D:將步驟B得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5，過(guò)DlOl大孔樹脂進(jìn)行柱層析，用體積濃度分別為20^^60%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為Iml/min,收集60%乙醇洗脫液；
[0032]步驟E:將步驟C中得到的萃余液和步驟D中得到的60%乙醇洗脫液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑0.72g，得率為3.6% (占脫脂后茶葉籽柏干重)。
[0033]實(shí)施例2
[0034]步驟A:將茶葉籽柏預(yù)處理，預(yù)處理方法是將茶葉籽柏粉碎，然后過(guò)50目篩；茶葉籽柏預(yù)處理后進(jìn)行脫脂，脫脂方法是:按照預(yù)處理后的茶葉籽柏和正己烷為Ig:15ml的比例，向預(yù)處理后的茶葉籽柏中加入正己烷，在40°C下浸提1.5h，然后5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘后棄上清液，取殘?jiān)娓?；以茶葉籽柏和體積濃度95%的乙醇為Ig:20ml的比例，向20g脫脂后的茶葉籽柏中加入體積濃度95%的乙醇，在45°C下提取35min，然后12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘后，得到濾渣和提取液；
[0035]步驟B:以步驟A得到的濾渣和磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為Ig:25ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，在50°C下浸提2.5h，再用頻率為200W的超聲提取15min后，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，得到提取液；所述磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為PH是8，且含占脫脂后茶葉籽柏干重4%的堿性蛋白酶的緩沖液，所述堿性蛋白酶的活力不小于20000U/g ；
[0036]步驟C:將步驟A得到的提取液真空濃縮到原體積的1/10，然后以濃縮后的提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，向濃縮后的提取液中加入氯仿進(jìn)行萃取，得到萃余液；
[0037]步驟D:將步驟B得到的提取液真空濃縮到原體積的1/6，過(guò)DlOl大孔樹脂進(jìn)行柱層析，用體積濃度分別為20^^60%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為Iml/min,收集60%乙醇洗脫液；
[0038]步驟E:將步驟C中得到的萃余液和步驟D中得到的60%乙醇洗脫液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑0.86g，得率為4.3% (占脫脂后茶葉籽柏干重)。
[0039]實(shí)施例3
[0040]步驟A:將茶葉籽柏預(yù)處理，預(yù)處理方法是將茶葉籽柏粉碎，然后過(guò)60目篩；茶葉籽柏預(yù)處理后進(jìn)行脫脂，脫脂方法是:按照預(yù)處理后的茶葉籽柏和正己烷為Ig:20ml的比例，向預(yù)處理后的茶葉籽柏中加入正己烷，在50°C下浸提lh，然后5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘后棄上清液，取殘?jiān)娓?；以茶葉籽柏和體積濃度95%的乙醇為Ig:25ml的比例，向20g脫脂后的茶葉籽柏中加入體積濃度95%的乙醇，在50°C下提取30min，然后12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘后，得到濾渣和提取液；
[0041]步驟B:以步驟A得到的濾渣和磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為Ig:30ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，在60°C下浸提2h，再用頻率為250W的超聲提取IOmin后，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，得到提取液；所述磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為PH是9，且含占脫脂后茶葉籽柏干重5%的堿性蛋白酶的緩沖液，所述堿性蛋白酶的活力不小于20000U/g ；
[0042]步驟C:將步驟A得到的提取液真空濃縮到原體積的1/15，然后以濃縮后的提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，向濃縮后的提取液中加入氯仿進(jìn)行萃取，得到萃余液；
[0043]步驟D:將步驟B得到的提取液真空濃縮到原體積的1/7，過(guò)DlOl大孔樹脂進(jìn)行柱層析，用體積濃度分別為20^^60%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為Iml/min,收集60%乙醇洗脫液；
[0044]步驟E:將步驟C中得到的萃余液和步驟D中得到的60%乙醇洗脫液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑0.98g，得率為4.9% (占脫脂后茶葉籽柏干重)。
[0045]將上述3個(gè)實(shí)施例的酪氨酸酶抑制劑進(jìn)行酪氨酸酶抑制效果驗(yàn)證:將從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑溶解于蒸餾水中，取100 μ I上述溶液，加入PH為6.8的磷酸鹽緩沖液56μ I與2.0mmo I/L的酪氨酸溶液94 μ I,待混合均勻后,在冰浴中迅速加入酪氨酸酶溶液50μ 1(50U)，在37°C中溫育lOmin，于490nm處測(cè)定吸光度。
[0046]酪氨酸酶抑制率計(jì)算如下:
[0047]酪氨酸酶抑制率(%)= [ (a-b) - (c-d) ] / [a-b] X 100 %
[0048]a:未加提取物而加酶的混合液所測(cè)的吸光度；
[0049]b:未加提取物也未加酶的混合液所測(cè)的吸光度；
[0050]c:加提取物和酶的混合液所測(cè)的吸光度；
[0051]d:加提取物而未加酶的混合液所測(cè)的吸光度。
[0052]如圖1所示，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)從茶葉籽柏中提取的酪氨酸酶抑制劑對(duì)酪氨酸酶具有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，可以應(yīng)用于美容祛斑.等藥物和保健品開發(fā)，以及果蔬護(hù)色保鮮等領(lǐng)域。
【權(quán)利要求】
1.一種從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，包括粉碎茶葉籽柏，其特征在于，包括以下具體步驟: 步驟A:將茶葉籽柏預(yù)處理后進(jìn)行脫脂，以茶葉籽柏和體積濃度95%的乙醇水溶液為Ig:15ml~Ig:25ml的比例，向脫脂后的茶葉籽柏中加入體積濃度95%的乙醇水溶液，在40~50°C下提取30~40min，然后以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，得到濾渣和提取液； 步驟B:以步驟A得到的濾渣和緩沖液為Ig:20ml~Ig:30ml的比例，向步驟A得到的濾渣中加入緩沖液，在40~60°C下浸提2~3h，再超聲提取10~20min后，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，得到提取液；所述緩沖液為PH是7~9，且含占脫脂后茶葉籽柏干重3~5%的堿性蛋白酶的緩沖液； 步驟C:將步驟A得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5~1/15，然后以濃縮后的提取液和氯仿的體積比為1:1的比例，向濃縮后的提取液中加入氯仿進(jìn)行萃取，得到萃余液； 步驟D:將步驟B得到的提取液真空濃縮到原體積的1/5~1/7，過(guò)DlOl大孔樹脂進(jìn)行柱層析，用體積濃度分別為20^^60%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為Iml/min,收集60%乙醇洗脫液； 步驟E:將步驟C中得到的萃余液和步驟D中得到的60%乙醇洗脫液混合，濃縮后冷凍干燥，即得到從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟A中的預(yù)處理是將茶葉籽柏粉碎，然后過(guò)40~60目篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟A中的脫脂方法是:按照預(yù)處理后的茶葉籽柏和正己烷為Ig =IOml~Ig:20ml的比例，向預(yù)處理后的茶葉籽柏中加入正己烷，在30~50°C下浸提I~2h，然后以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后棄上清液，取殘?jiān)娓伞?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟B中的堿性蛋白酶的活力不小于20000U/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟B中的緩沖液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從茶葉籽柏中提取酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟B中的超聲提取的頻率是150~250W。
【文檔編號(hào)】A23B7/154GK103520372SQ201310433236
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】徐平, 黃虔菲, 王岳飛 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)