抗ihnv單克隆抗體5h3及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種抗傳染性造血組織壞死病毒（IHNV）單克隆抗體5H3及其應(yīng)用。該單克隆抗體由雜交瘤細胞株IHNV-5H3分泌，該細胞株的保藏號為CCTCC?C201359。該雜交瘤細胞株IHNV-5H3能穩(wěn)定產(chǎn)生單克隆抗體5H3，該抗體具有抗體效價高、靈敏度高、特異性強、與天然抗原的親和力強等優(yōu)點。本申請還提供了一種包含該單克隆抗體5H3的快速檢測試紙條及其試劑盒，其采用膠體金免疫層析檢測技術(shù)，具有良好的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性和再現(xiàn)性等特點。同時，該試紙條和試劑盒使用簡單方便、檢測速度快、檢測結(jié)果直觀且檢測成本低，可滿足食品安全、屠宰、檢測機構(gòu)等的檢測要求，特別適用于現(xiàn)場檢測。
【專利說明】抗IHNV單克隆抗體5H3及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請涉及傳染性造血組織壞死病毒檢測領(lǐng)域，特別涉及一種抗傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)單克隆抗體5H3及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]魚傳染性造血器官壞死病(或稱傳染性造血器官壞死病，infectioushaematopoietic necrosis of fish,IHN)是由一種毒力很強的彈狀病毒，即傳染性造血器官壞死病毒血癥病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,簡稱IHNV)所引起的急性、全身性的嚴重傳染病，致病因子IHNV病毒粒子呈彈狀，有囊膜，其內(nèi)表面為基質(zhì)蛋白(M)，囊膜上有糖蛋白(G)突起膜內(nèi)有基質(zhì)蛋白、核蛋白、聚合酶等，侵染的主要靶器官是腎造血組織。這種爆發(fā)性疾病最早流行于北美太平洋西北養(yǎng)殖場的鮭科魚類稚幼魚，后來在日本、歐洲和朝鮮也曾檢測到。1988年在中國東北地區(qū)各養(yǎng)鱒場陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病毒，最近在深圳和北京2個水產(chǎn)養(yǎng)殖場牙鲆、虹鱒及從美國進口的匙吻鱘卵中也檢測到IHNV的存在。
[0003]IHNV主要感染鮭、鱒魚，敏感寄主通常為稚幼魚，一般認為成魚比稚幼魚難以感染，成魚一般不表現(xiàn)臨床癥狀，成為病毒的終身攜帶者，在苗種期感染IHNV后殘留的帶病毒魚是主要傳染源，病毒可 隨著糞、尿、性腺產(chǎn)物排入水中。病毒放到水中或拌在飼料中投喂均可引起發(fā)病。感染IHNV的病魚典型體表癥狀為厭食嗜睡、異常游動、眼突出、體色發(fā)黑、腹部積水，鰭條基部和 肛門周圍充血，肛門外有白色不透明糞便，有些感染該病毒后存活的魚脊柱變形。解剖病魚可見肝臟、脾臟、腎臟、腸道等充血，并有卡他性炎癥，體腔內(nèi)有積水，鰓及內(nèi)臟顏色變淡；口腔、骨骼肌、脂肪組織、腹膜、腦膜、鰾和心包膜常有出血斑點，腸出血，魚苗的卵黃囊也會出血、因充滿漿液而膨大，腸道內(nèi)常常沒有食物。顯微鏡檢結(jié)果表明，腎臟、造血組織、胰臟、腸道和腎上腺皮質(zhì)出現(xiàn)退化和壞死；胃、腸固有膜的顆粒細胞、部分胰腺及胰島細胞也會發(fā)生變性和壞死。
[0004]IHN被國際獸疫局列為必須申報的疾病，是魚類口岸第I類檢疫對象，被我國列為二類動物疫病。
[0005]防止IHNV的傳播是控制IHN發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，而加強檢疫是防止IHNV傳播的關(guān)鍵，因此應(yīng)用靈敏、有效、快速的病毒檢測技術(shù)非常重要。目前，IHNV的檢測技術(shù)主要有細胞培養(yǎng)、免疫學(xué)技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴增技術(shù)(RT-PCR、Real-time RT-PCR、等溫擴增技術(shù))等。采用核酸檢測技術(shù)，如專利CN1687447 (2005)，公開了用RT-PCR法同步檢測三種魚病病毒的試劑盒及其檢測方法；專利CN102212620A (2011)公開了檢測三種魚類彈狀病毒的測量審核用試劑盒，為用PCR方法檢測此三種病毒的準確性提供了測評基準。然而，以上檢查方法均需要一定的條件和技術(shù)，或因為需要特殊儀器，或因為費用昂貴等，其現(xiàn)場檢測推廣及多次重復(fù)追蹤復(fù)查受到限制。此外，采用免疫學(xué)技術(shù)檢測，如專利US20050163795A1和“朱旭等，傳染性造血器官壞死病毒糖蛋白抗血清的制備及應(yīng)用，《漁業(yè)科學(xué)進展》，201206 (33)”采用IHNV-G蛋白(表達蛋白)作為抗原，制備抗體，檢測IHNV，卻仍存在不能確保IHNV-G蛋白有很好的抗原性，或抗原活性蛋白含量低、抗體特異性差的缺點。
[0006]20世紀80年代興起的膠體金免疫層析檢測，基于血清學(xué)檢測原理，操作簡單快捷、結(jié)果清晰易于判斷、無需復(fù)雜的實驗技能和特殊設(shè)備，特別適于現(xiàn)場檢測。因此，研究開發(fā)適合于快速檢測用的抗IHNV單克隆抗體具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本申請的一個目的是提供一種適用于快速檢測的抗傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)單克隆抗體。
[0008]本申請的另一個目的是提供該單克隆抗體在傳染性造血組織壞死病毒檢測中的應(yīng)用，特別的提供了一種特異性高、靈敏度高的傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)快速檢測試紙條及其試劑盒。[0009]為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案:
[0010]本申請公開了一種可產(chǎn)生抗傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)單克隆抗體的雜交瘤細胞株IHNV-5H3，該細胞株已于2013年6月6日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為 CCTCC C201359。
[0011]本申請公開了一種由上述保藏號CCTCC C201359的雜交瘤細胞株IHNV-5H3產(chǎn)生的抗IHNV單克隆抗體，在本申請中也將該抗體稱為抗IHNV單克隆抗體5H3(或簡稱為單克隆抗體5H3)。
[0012]本申請同時公開了保藏號CCTCC C201359的雜交瘤細胞株IHNV-5H3在制備IHNV檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
[0013]本申請還公開了上述抗IHNV單克隆抗體5H3在制備IHNV檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
[0014]本申請?zhí)峁┝艘环NIHNV快速檢測試紙條，該試紙條包含上述抗IHNV單克隆抗體5H3。
[0015]進一步的，上述IHNV快速檢測試紙條中，抗IHNV單克隆抗體5H3包附膠體金。
[0016]本申請還提供了一種IHNV檢測試劑盒，該試劑盒包括上述IHNV快速檢測試紙條，例如可由上述IHNV快速檢測試紙條組裝而成。
[0017]本申請還提供了上述IHNV快速檢測試紙條或IHNV檢測試劑盒在IHNV檢測中的應(yīng)用。
[0018]由于采用了上述技術(shù)方案，本申請的有益效果在于:
[0019]本申請?zhí)峁┑碾s交瘤細胞株IHNV-5H3能穩(wěn)定產(chǎn)生抗IHNV單克隆抗體5H3，該抗體特異性好、效價高，可應(yīng)用于IHNV快速檢測領(lǐng)域。
[0020]同時，本申請?zhí)峁┝艘环NIHNV快速檢測試紙條及其試劑盒，將膠體金檢測技術(shù)應(yīng)用到IHNV的檢測領(lǐng)域，在膠體金試紙上全部使用抗體作為基本試劑，生物安全性好，不存在試紙條擴散病毒的潛在危險。該試紙條具有特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性好，同時具備可重復(fù)性和再現(xiàn)性等優(yōu)點，檢測結(jié)果受外界因素影響較小，可在養(yǎng)殖現(xiàn)場進行檢測，安全穩(wěn)定，膠體金無毒性，不造成環(huán)境污染，其膠體金顆粒與單克隆抗體是物理吸附不改變抗體的性質(zhì)，可最大限度的保持單抗的活性?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0021]圖1為本申請【具體實施方式】中的一種傳染性造血組織壞死病毒快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]保藏信息
[0023]培養(yǎng)物名稱:雜交瘤細胞株IHNV-5H3
[0024]保藏日期:2013年6月6日
[0025]保藏單位:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)
[0026]保藏編號:CCTCCC201359【具體實施方式】
[0027]本申請采用滅活純化的IHNV做免疫原，制備得到了雜交瘤細胞株IHNV-5H3，該雜交瘤細胞株細胞染色體穩(wěn)定，能穩(wěn)定、高表達的分泌出具有高抗原親和力、高特異性、效價高的抗IHNV單克隆抗體5H3。具體的，該單抗可由上述雜交瘤細胞株通過注射Balb/c小鼠腹腔，誘生腹水，通過辛酸-硫酸銨純化而大量獲得。該獲得的單克隆抗體5H3是針對病毒的天然結(jié)構(gòu)的所有抗體，有比較好的抗原性，與天然抗原的親和力強，同時特異性好、抗體效價高，可以作為IHNV多種檢測方法中的重要試劑原料。該抗IHNV單克隆抗體5H3特別適用于IHNV快速檢測領(lǐng)域，尤其適用于IHNV膠體金免疫層析檢測法。
[0028]由抗IHNV單克隆抗體5H3制備得到的IHNV膠體金快速檢測試紙條，特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性好，同時具備可重復(fù)性和再現(xiàn)`性等優(yōu)點。該試紙條可進一步與其他部件構(gòu)成IHNV檢測試劑盒，其IHNV快速檢測試紙條則是該試劑盒的核心。本申請?zhí)峁┑脑嚰垪l及其試劑盒生產(chǎn)和檢測成本低。使用該試紙條不需另配其它儀器、設(shè)備和試劑，節(jié)省大量儀器、設(shè)備和附加試劑費用，專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時隨地進行現(xiàn)場檢測，節(jié)省檢測成本。其應(yīng)用范圍廣，便于普遍推廣，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖和個體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場前景和較好的經(jīng)濟、社會效益。同時，該試紙條和試劑盒可快速檢測，10-15分鐘即可完成檢測。由于不需特殊儀器設(shè)備，且操作簡單，一步完成，無需專業(yè)人員操作，因此特別適用于現(xiàn)場操作。
[0029]本申請中的單克隆抗體5H3除了應(yīng)用于上述膠體金免疫層析檢測試紙條外，還可以用于其他IHNV檢測試劑盒、試劑或設(shè)備中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，將本申請所述的單克隆抗體5H3直接或間接結(jié)合其他信號基團(如磁性微球、辣根過氧化酶等)，或?qū)⒈旧暾埶龅膯慰寺】贵w5H3作為包被抗體(例如ELISA)，則可用于其他形式的IHNV檢測試劑或設(shè)備。故本申請所制備得到的雜交瘤細胞及其分泌的抗體可廣泛適用于制備IHNV檢測試劑或設(shè)備。
[0030]此外,本申請中所采用的傳染性造血組織壞死病毒(Infectious hematopoieticnecrosis virus,簡稱IHNV)的毒株為IHNV-UK,英國CEFAS贈送，由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心保存，紫外分光光度儀MK3購自Therom Fisher scientific公司。
[0031]下面通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本申請作進一步詳細說明。[0032]實施例一:傳染性造血組織壞死病毒的純化
[0033]差速離心的方法，1000Og,將挑斑后的病毒接種到已長成單層的EPC細胞中，置于15°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集病變的細胞。凍融三次，41:條件下，10，00(^離心101^11，去除細胞碎片。上清液以140，OOOg (Beckman sw28轉(zhuǎn)頭)于4°C離心3h，收集沉淀，加入適量PBS懸浮。懸浮的病毒置于蔗糖梯度(30%、45%、60%)頂部，4°C以140，OOOg離心3h，收集位于蔗糖濃度30%與45%界面的病毒。加PBS洗滌后，140，OOOg離心3.5h去蔗糖，收集沉淀，懸于適量的STE緩沖液中，置_20°C保存?zhèn)溆茫鯯ET緩沖液含0.1mol/LNaCI, IOmmol/LTris-Cl(PH8.0)，lmmol/L EDTA(PH8.0)。
[0034]實施例二:抗傳染性造血組織壞死病毒單克隆抗體的制備:
[0035](I)共選取8周齡BALB/C小鼠5只，免疫程序如下:
[0036]首免:以實施例1中得到的純化后的IHNV作為免疫原，以QuickAntibody-Mouse5ff作為免疫佐劑，免疫劑量為10 μ g/只(10 μ g免疫原+10 μ LQuickAntibody-Mouse5ff+生理鹽水80ul),大腿肌肉注射。
[0037]加強免疫:于首免后第21天進行，免疫劑量為10 μ g/只(10 μ g免疫原+10 μ LQuick Antibody-Mouse5ff+生理鹽水80ul),共免疫2次，第35天斷尾采血分離血清，用間接ELISA法檢測抗IHMV懸液的血清抗體效價。若效價達到1:5000,即可用于細胞融合。
[0038]選取ELISA法檢測抗體較高的免疫小鼠，眶下竇采血，分離血清。脫頸致死小鼠；
[0039]無菌手術(shù)取出脾臟制備脾細胞，并與NSO細胞在50%PEG作用下進行細胞融合；
[0040]將融合后的細胞懸液加到96孔細胞培養(yǎng)板上，用HAT培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)。融合后的細胞置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0041]用間接ELISA法以0.5 μ g/孔的蛋白的量包被酶標板進行陽性篩選。P/N大于2.1時即為陽性。對強陽性、細胞生長旺盛的孔進行3次有限稀釋克隆化，得到保藏號為CCTCCC201359的雜交瘤細胞株IHMV-5H3。
[0042](2)單抗的大量制備:
[0043]本例采用腹水法大量制備抗IHNV單克隆抗體5H3。將雜交瘤細胞株IHNV-5H3擴大培養(yǎng)，給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細胞株IO7個細胞，7天后抽取腹水，用IHNV、病毒懸液包被酶標板測其ELISA效價、抑制價。
[0044](3)單抗的純化:
[0045]采用辛酸一硫酸銨法進行單抗的純化。將20mL腹水加入離心管中，于40C 12000rpmX15min，將上清轉(zhuǎn)移至另一溶器中；
[0046]向上清中加入4倍腹水體積的0.06M pH4.8的醋酸緩沖液，室溫邊加邊攪拌；
[0047]向上述混合物中加入適量的辛酸(33 μ L/mL)，滴加時要緩慢，室溫滴加，邊滴加邊攪拌；辛酸滴加完后，室溫攪拌30min ；
[0048]于4°C離心，12000rpmX 30min,取上清,用濾紙過濾；
[0049]向濾液中加入≤45%的飽和硫酸銨溶液(SAS)，室溫攪拌30min，4°C靜置2h或過夜；
[0050]于4°C離心 12000rpmX 30min,棄上清，沉淀用適量 0.01mol/L PH7.4PBS 重懸,用
0.01mol/L PH7.4PBS 于 4°C透析 24h，其間換液 4 次；[0051]將透析物于4°C離心12000rpmX30min，收集上清分裝于EP管中，用核酸蛋白測定儀測定蛋白含量，稀釋至10mg/mL，置于_20°C保存。
[0052](4)單克隆抗體特異性檢測:
[0053]用純化的抗IHNV單克隆抗體5H3分別與其他魚類病毒(錦鯉皰疹病毒(KHV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、病毒性出血性敗血病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、草魚出血病病毒(GCHV)和流行性造血器官壞死病毒(EHNV))包被的ELISA板反應(yīng)，鑒定單克隆抗體的特異性。
[0054]實施例三:IHNV膠體金快速檢測試紙條的制備
[0055]( 1)膠體金顆粒的制備
[0056]取1%氯金酸溶液lml，加99ml超純水成終濃度0.01%的氯金酸溶液，加熱沸騰后，取1%檸檬酸三鈉1.6ml 一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，繼續(xù)加熱至溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍黑色最終變?yōu)榱良t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5min，室溫冷卻，補充失水至原體積。
[0057](2)膠體金-抗體復(fù)合物試劑的制備與純化:
[0058]取100ml膠體金溶膠,用0.lmol/L碳酸鉀調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH,大約調(diào)到pH8.0 ；
[0059]迅速向金溶膠中加入最佳標記量的抗IHNV單克隆抗體5H3 (10ug/ml)攪拌2_3分鐘充分混合，室溫下反應(yīng)10分鐘；
[0060]迅速加入IOml 10%牛血清白蛋白(BSA)溶液，充分混合，室溫下反應(yīng)10分鐘；
[0061]取膠體金溶液至離心管中于13000轉(zhuǎn)4°C冷凍離心機離心30分鐘，小心吸去上清液(切忌傾倒)；
[0062]將沉淀懸浮于1/10體積含0.5mg/ml BSA的磷酸緩沖液中，置4°C保存。
[0063](3)固相硝酸纖維素(NC)膜的活化
[0064]裁取20mmX3_4mm的NC膜，于0.lmol/L的碳二亞胺溶液中浸泡，15min后取出，室溫風(fēng)干8min?？笽HNV多克隆抗體(2mg/ml)包被于硝酸纖維素膜的觀察結(jié)果的測試反應(yīng)區(qū)，定義為檢測線(T)，包被羊抗鼠IgG(2mg/ml)于質(zhì)控區(qū)，定義為質(zhì)控線(C)，且兩者間距4~1 Omm ,優(yōu)選 6_。
[0065]其中，該抗IHNV多克隆抗體可通過以下方法制備得到:
[0066]將實施例1中純化后的IHNV作為免疫原，以Quick Antibody-Rabbit5W作為免疫佐劑，免疫劑量為30 μ g/只(30 μ g免疫原+50 μ L Quick Antibody-Rabbit5W)，再用生理鹽水補充至lOOul，每針次lOOul，大腿肌肉注射免疫家兔，首免后第21天用同樣的方法進行加強免疫，共免疫2次，免疫后第35天耳靜脈采血，分離血清，用表達蛋白包被的ELISA板檢測抗體效價，如果具有較高的抗體滴度，通過頸動脈放血，收集全血，分離血清。用辛酸硫酸銨法提取IgG，用核酸蛋白測定儀測定蛋白含量，將其稀釋至10mg/mL，置于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0067]兔抗血清經(jīng)飽和硫酸銨鹽粗提,透析,再依次過SephadexG25和DEAE纖維素柱進一步提純，并將收集的蛋白質(zhì)于透析袋中。置蔗糖或聚乙二醇中濃縮，紫外分光光度計測其280nm、260nm波長處OD值，以公式計算蛋白含量后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0068]經(jīng)過I次初免，I次加強免疫后，兔抗血清效價可達1:30000以上，具有很高的抗血清效價。
[0069]其中，多克隆抗體動物種屬來源應(yīng)為非小鼠來源，可為兔、山羊、綿羊、人、豬、馬、牛，制備多克隆的方法可以進行簡單替換。[0070](4)金標結(jié)合墊的制備:
[0071]取40 μ L的上述膠體金-抗體復(fù)合物試劑用金標稀釋液進行3倍稀釋，裁取7mmX IOcm的玻璃纖維素膜，浸泡于上述稀釋后的膠體金_抗體復(fù)合物溶液中，再于室溫潔凈條件真空干燥備用，該金標稀釋液為含0.01M PBS,0.5% (質(zhì)量百分含量)BSA、
0.2%Twen-20 (體積百分含量)、2.5%蔗糖(質(zhì)量百分含量)的緩沖液。
[0072](5)樣品墊的制備:
[0073]截取1.1cmX IOcm的玻璃纖維素膜，將其均勻浸泡于如下溶液中l(wèi)Omin，再在室溫潔凈條件真空干燥備用，所述溶液為含0.01M PBS,0.5% (質(zhì)量百分含量)BSA、0.2%Twen-20(體積百分含量)的緩沖液。
[0074](6)試紙條的組裝
[0075]試紙條由樣品墊、金標結(jié)合墊、固相硝酸纖維素膜及吸水紙4個部分組成。樣品墊和金標結(jié)合墊用玻璃纖維素膜，底板為雙面膠聚乙烯塑料板。順序裝配，裁成寬度為3_的檢測試紙條。本例中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，該膠體金快速檢測試紙條，包括樣品墊1、膠體金結(jié)合墊2、檢測線(T) 3、固相硝酸纖維素膜4、質(zhì)控線(C) 5、吸水紙6以及底板
7。其中底板7 —端粘貼樣品墊1，另一端粘貼吸水紙6，膠體金結(jié)合墊2是由膠體金標記的抗IHNV單克隆抗體復(fù)合物結(jié)合在玻璃纖維膜，其一端置于樣品墊I下，另一端緊密連接固相硝酸纖維素膜4 ;檢測線(T) 3為抗IHNV多克隆抗體；質(zhì)控線(C) 5為羊抗鼠IgG抗體；檢測線(T) 3和質(zhì)控線(C) 5位于固相硝酸纖維素膜底板4的中間；吸水紙6連接固相硝酸纖維素膜4。
[0076](7)待測樣品的前處理
[0077]當所述樣品為魚類組織時，病毒釋放后，樣品前處理方法為:
[0078]I)取樣方式:表面健康的魚:取腎、脾和腦；有臨床癥狀的魚:體長< 4cm取全魚；體長在4~6cm之間，取包括腎臟和腦在內(nèi)的所有臟器；體長> 6cm，取腎、脾和腦；
[0079]2)取組織6~7g，加入適量已滅菌石英砂，充分研磨，然后加入50mL M199培養(yǎng)基(含10%FBS和100IU/mL青霉素和100 μ g/mL雙氫鏈霉素的雙抗)，轉(zhuǎn)入50ml離心管，4°C孵育過夜。最后取孵育后的細胞懸液作為檢測樣品。
[0080](8)檢測方法與判斷標準
[0081]將待檢測樣品滴加到試紙條的樣品墊上,水平放置,反應(yīng)lOmin。
[0082]判斷標準:若只在質(zhì)控線C出現(xiàn)紅色，則表示為陰性；若在試紙的質(zhì)控線、檢測線均出現(xiàn)紅色，則判定為陽性。
[0083]實施例四:試紙條的檢測試驗
[0084]( I)樣品中傳染性造血組織壞死病毒的檢測
[0085]抗體標記在膠體金顆粒上，當加入樣本后，金標抗體和樣本一起向硝酸纖維素膜方向擴散，并最終滲入吸水紙端，擴散過程中待檢的IHNV可與膠體金標記的抗IHNV單克隆抗體相結(jié)合。當樣本中的IHNV超過檢測限時，檢測線(T)顯紅色，多余的金標單克隆抗體與質(zhì)控線(C)的羊抗鼠IgG 二抗相結(jié)合顯色，C線顯紅色，形成2條紅色印記為陽性；反之，待測樣品中無IHNV時，膠體金標記抗體在向硝酸纖維素膜方向擴散的過程中，不能與抗IHNV多克隆抗體相結(jié)合，不能形成固相多克隆抗體一抗原一膠體金標記抗體復(fù)合物，因此T線不顯色，膠體金標記抗體只能與羊抗鼠IgG 二抗結(jié)合，C線顯紅色，記為陰性；如果硝酸纖維素膜沒有顯示紅色標記或C線不顯色，則表明試紙失效。
[0086](2)試紙條的敏感性試驗:分別將已知病毒陽性細胞培養(yǎng)液10份經(jīng)過倍比稀釋，分別用試紙條進行檢測，并且與病毒分離試驗進行敏感性比較，結(jié)果表明試紙條的靈敏度為 IOOTCId50, CV 值小于 15%。
[0087](3)試紙條的特異性試驗:檢測IHNV時顯示為陽性，當將狗魚彈狀病毒(PFRV)、牙鲆彈狀病毒(HRV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、病毒性出血性敗血病毒(VHSV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、草魚出血病病毒(GCHV)和流行性造血器官壞死病毒(EHNV)等幾種病毒陽性細胞培養(yǎng)液分別加入試紙的樣品墊上，靜置反應(yīng)10min后，檢測結(jié)果均為陰性，說明本試紙條特異性好，結(jié)果見表1，其中“ + ”表示陽性，表示陰性。
[0088]表1.試紙條的特異性試驗
[0089]
檢測 IHNVPFRV~ HRVIPNV KHV SVCV VHSV RSIV GCHV I EHNV樣品
檢測 +------
結(jié)果
[0090](4)試紙條的重復(fù)性試驗:相同條件下,每天分別檢測批內(nèi)重復(fù)20份已知陽性樣品和已知陰性樣品，批間取3個 不同的批次進行檢測，持續(xù)檢測7天，通過試紙條顯色的變化來確定試紙條的重復(fù)性。結(jié)果顯示試紙條檢測結(jié)果一致，說明該試紙條的重復(fù)性好。
[0091](5)金標試紙條的穩(wěn)定性試驗:穩(wěn)定性主要通過破壞性試驗(55°C )和實際情況下長期穩(wěn)定性試驗。55°C老化試驗的原理根據(jù)阿侖尼烏斯公式:d(Ink)/dT=Ea/RT2, Ea為表觀活化能，R為摩爾氣體常量。變化趨勢為T增大，一般k也增大，Ea約等于19.5Kcal/mol。計算出對應(yīng)的溫度與老化天數(shù)關(guān)系，55°C 15天相當于25°C—年。全部數(shù)值以25°C —年穩(wěn)定性情況對比。
[0092]將3個批次檢測試紙條分為兩組，每組500份，一組置55°C恒溫溫箱中，與室溫放置(25°C)的另一組，同時進行對比實驗，通過對檢測限，假陰性率，假陽性率的變化，對其穩(wěn)定性進行考察。
[0093]檢測時間:將一組置55°C恒溫溫箱中，測試的時間間隔為第7天，第15天，第21天，第28天，與室溫放置的另一組，同時進行對比實驗，考察其檢測限、假陽性率、假陰性率，室溫的對照組為25°C，測試的時間間隔為第7天，第28天，第56天，第三個月，以后每隔3個月做一次。
[0094]觀察內(nèi)容:檢測線和質(zhì)控線有無、反應(yīng)線的清晰度以及結(jié)合墊釋放金標抗體的程
/又寸。
[0095]假陽性率:用不同保存條件和批次的檢測試紙各20份分別檢測20份確證陰性魚腎臟的假陽性率。假陽性率=假陽性數(shù)/20X 100%。
[0096]假陰性率:用不同保存條件和批次的檢測試紙各20份分別檢測20份確證陽性魚腎臟的假陰性率。假陰性率=假陰性數(shù)/20 X 100%。
[0097]IHNV膠體金快速檢測試紙條在不同條件和不同保存時間下，對其假陽性率和假陰性率進行檢測，結(jié)果見表2，表3，表4，表5，表6，表7。
[0098]表2.穩(wěn)定性測定表
【權(quán)利要求】
1.保藏號為CCTCCC201359的雜交瘤細胞株IHNV-5H3。
2.一種抗傳染性造血組織壞死病毒單克隆抗體，其特征在于:所述單克隆抗體由保藏號CCTCC C201359的雜交瘤細胞株IHNV-5H3產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞株IHNV-5H3在制備傳染性造血組織壞死病毒檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的抗傳染性造血組織壞死病毒單克隆抗體在制備傳染性造血組織壞死病毒檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
5.一種傳染性造血組織壞死病毒快速檢測試紙條，其特征在于:所述試紙條包含權(quán)利要求2所述的抗傳染性造血組織壞死病毒單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的傳染性造血組織壞死病毒快速檢測試紙條，其特征在于:所述的抗傳染性造血組織壞死病毒單克隆抗體包附膠體金。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的快速檢測試紙條在傳染性造血組織壞死病毒檢測中的應(yīng)用。
8.一種傳染性造血組織壞死病毒檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括如權(quán)利要求5或6中所述的傳染性造血組織壞死病毒快速檢測試紙條。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述`的試劑盒在傳染性造血組織壞死病毒檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/91GK103509759SQ201310433521
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】賈鵬, 鐘松清, 何俊強, 鄭曉聰, 譚攀, 王津津, 劉葒, 史秀杰, 蘭文升, 于力, 謝冬霞 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心, 深圳市三方圓生物科技有限公司