蝦成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開蝦成分環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物、試劑盒及檢測方法，其堿基序列如SEQ?ID?NO.17～20；采用LAMP檢測技術(shù)，建立了適用于食品中蝦成分特異性檢測的方法，本發(fā)明所述方法操作簡單，不依賴昂貴儀器，檢測時間在1小時左右，方法靈敏度達(dá)到0.5%，檢測效率達(dá)到傳統(tǒng)PCR方法或熒光定量PCR方法，能夠應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和各種基層實(shí)驗(yàn)室食品品質(zhì)監(jiān)控，適合作為行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用推廣。
【專利說明】蝦成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢驗(yàn)技術(shù)方法領(lǐng)域，具體涉及一種蝦成分環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)引物、試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】[0002]食物過敏醫(yī)學(xué)上也稱變態(tài)反應(yīng)，是指機(jī)體受抗原(包括半抗原)刺激后，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)再次接觸同一種抗原后在體內(nèi)引起體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，由此導(dǎo)致組織損傷或機(jī)體生理機(jī)能障礙。它是一種復(fù)發(fā)率很高的疾病，引起變態(tài)反應(yīng)的抗原被稱為變應(yīng)原，又名致敏原。食品成分中存在的天然致敏原成分會引起6%至8%的兒童和2%的成人的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的會危及生命。預(yù)包裝食品由于多是成分復(fù)雜的深加工產(chǎn)品，如果含有致敏原成分而又未能明確告之，就有可能引起過敏，危害消費(fèi)者的健康安全。目前大約有160多種食品致敏原，甲殼類動物為常見的致敏原之一。在可供食用的甲殼類動物中，最普遍為人類消費(fèi)的是蝦。蝦也是最常見引起過敏反應(yīng)的種類。2003年以來，歐盟、美國、香港等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)相繼制定了預(yù)包裝食品致敏原標(biāo)識要求的法規(guī)，并已于2005年起陸續(xù)發(fā)布和實(shí)施，對我國食品出口貿(mào)易造成了明顯影響。由于目前我國在食品致敏原成分檢測方法領(lǐng)域技術(shù)薄弱，隨著越來越多國家和地區(qū)對食品致敏原成分標(biāo)識法規(guī)的全面實(shí)施，食品標(biāo)簽的致敏原成分標(biāo)識要求和符合性檢驗(yàn)將會成為我國食品出口貿(mào)易的重要障礙。
[0003]蟲下(shrimp)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼亞門(Crustacea),種類很多，包括青蝦、河蝦、草蝦、小龍蝦、對蝦、明蝦、基圍蝦、琵琶蝦、龍蝦等。
[0004]目前，致敏原成分檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、色譜質(zhì)譜法、表面等離子共振免疫法等。但是不同的方法的檢測限存在較大的區(qū)別，因此機(jī)構(gòu)之間、國家之間應(yīng)該采用一種檢測結(jié)果較為精確、重復(fù)性較好的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前較多國家所認(rèn)可的方法是酶聯(lián)免疫法。但是酶聯(lián)免疫法也受許多因素制約，如被測食品母體、檢測人員、試劑盒等。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的新型鑒定技術(shù)已日益得到廣泛應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種較理想的手段，LAMP引物包括兩個外引物和兩個內(nèi)引物，特異結(jié)合靶序列上的6個特異區(qū)域。內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc (與Fl區(qū)域互補(bǔ))和F2序列，內(nèi)引物BIP包含Blc (與BI區(qū)域互補(bǔ))和B2序列，外引物為F3和/或B3序列，本發(fā)明在內(nèi)外引物的基礎(chǔ)上引入環(huán)引物BLP，大大縮短了反應(yīng)時間，具體LAMP的引物組成及對應(yīng)區(qū)域信息見圖1。其特點(diǎn)是:①只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性；②高特異性:采用六個區(qū)段，四條引物，擴(kuò)增特異性高，可以根據(jù)是否擴(kuò)增來判斷目標(biāo)基因的存在與否；③快速、高效擴(kuò)增:擴(kuò)增在不到Ih即可完成，且產(chǎn)率高；④靈敏度高:擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝或更少；⑤鑒定簡便:在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀，可用肉眼觀察判斷擴(kuò)增與否；另外，它利用恒溫和低反應(yīng)溫度(63°C )，減少細(xì)胞損傷，檢測人員實(shí)際操作非常簡便?？傮w而言，LAMP法是一種簡便、快速、高特異的基因擴(kuò)增法，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，采用該方法能建立起總成本低廉的檢測體系，在轉(zhuǎn)基因食品檢測、致敏原成份檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明擬在前期研究的基礎(chǔ)上，將LAMP檢測技術(shù)應(yīng)用于食品中過敏原成分蝦的檢測，針對蝦線粒體12S rRNA基因，應(yīng)用四條特異引物在恒溫的條件下、簡易的設(shè)備中，僅用一小時左右有效的完成篩查任務(wù)，結(jié)果判斷簡單，既能節(jié)省時間，又可大大降低檢測成本，適用于基層實(shí)驗(yàn)室，可作為傳統(tǒng)PCR方法的有益補(bǔ)充。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:通過考察并鎖定南美白對蝦成分靶基因，然后設(shè)計合成4套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ ID N0.1~20 ;，優(yōu)化體系，最后確定一套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ ID N0.17~20 ;進(jìn)而確定了 LAMP方法的技術(shù)參數(shù)，最后驗(yàn)證引物特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明涉及一種檢測蝦成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物，其堿基序列為SEQ IDN0.17~20，如下:
[0008]F3 tagaaaccga cctggctc(SEQ ID N0.17)
[0009]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.18)
[0010]FIP(Flc+F2)gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQ IDN0.19)
[0011]BIP(Blc+B2)ccttaattca acatcgaggt cgacagcgta atcttctttg agag (SEQ IDN0.20)
[0012]本發(fā)明的另一方面涉及一種蝦成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測試劑盒，其中，檢測試劑盒包括檢測引物:SEQ ID N0.17~20。
[0013]優(yōu)選的情況下:對于上述蝦成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測試劑盒中，每25ul反應(yīng)體系中包括:
[0014]SEQ ID NO: 19 ~20 各 1.6 μ M，SEQ ID NO: 17 ~18 各 0.2 μ M，20mM ρΗ8.8 的Tris-HCl, IOmM KCl,6mM MgSO4,10mM(NH4)2S04，0.l%Tween20，IM 甜菜堿，1.6mM dNTP，8UBst 大片斷 DNA聚合酶，0.5μ I SYT0-9。
[0015]上述試劑盒在使用過程中，除了按上述反應(yīng)體系加入上述試劑之外，還需要加入模板DNA和蒸餾水(補(bǔ)足25 μ L反應(yīng)體系)，再進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。
[0016]本發(fā)明的另一方面在于，公開一種利用上述蝦成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測試劑盒，來檢測蝦成分的方法，其方法步驟包括:
[0017]①提取待測樣品的基因組DNA ;
[0018]②以步驟①提取的DNA作為模板，利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測:
[0019]每25μL 的 LAMP 反應(yīng)體系包括:SEQ ID NO: 19 ~20 各 L 6 μ M，SEQ ID NO:17 ~18 各 0.2 μ M，20mM ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgSO4, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20,IM甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst大片斷DNA聚合酶，0.5 μ I SYT0-9,2y I DNA模板、蒸餾水:
余量；
[0020]反應(yīng)條件為:保溫階段為63°C 30s, I個循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s,45個循環(huán)。[0021]③檢測結(jié)果以擴(kuò)增曲線進(jìn)行判斷。
[0022]本發(fā)明的另一方面在于，公開一種利用上述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物在檢測蝦成分方面的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的創(chuàng)新特征是:
[0024]本發(fā)明將LAMP檢測技術(shù)應(yīng)用于蝦12S rRNA特異基因檢測，針對南美白對蝦12SrRNA特異基因，應(yīng)用特異引物在恒溫的條件下、簡易的設(shè)備中，僅用一小時左右有效的完成篩查任務(wù)，結(jié)果判斷簡單，既能節(jié)省時間，又可大大降低檢測成本，適用于基層實(shí)驗(yàn)室，可作為傳統(tǒng)PCR方法的有益補(bǔ)充。
[0025](I)本研究針對南美白對蝦12S rRNA特異基因設(shè)計了四套引物，從中篩選出一套出峰時間早，信號強(qiáng)的引物12S rRNA-4，將反應(yīng)條件控制在63 °C，45min進(jìn)行檢測，成功建立了蝦成分的LAMP檢測方法；
[0026](2)進(jìn)行了引物12S rRNA-4的靈敏度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示該引物檢測限可達(dá)0.5% (含DNA 濃度為 0.5ng/yL)；
[0027](3)進(jìn)行了引物12S rRNA-4的引物特異性，結(jié)果顯示該引物特異性良好，對(IOOng/ μ L)黃花魚、扇貝、黃金鰈魚、蝦夷貝、南美鱈魚、狹鱈魚、柳葉魚、牛眼蛤、沙丁魚、白艦子、雜色蛤、北極蝦、鱈蟹、庸鰈魚、文蛤、真鱈魚、蛇鲅魚、貽貝、金槍魚、章魚、鮐鲅魚、牡蠣、鰈魚、馬哈魚、比目魚、鯡魚均無非特異擴(kuò)增；
[0028](4)進(jìn)行了引物12S rRNA-4的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示引物5%(含DNA濃度為5ng/μ L)，1% (含DNA濃度為lng/ μ L)及0.5% (含DNA濃度為0.5ng/ μ L)的穩(wěn)定性均良好。
[0029](5)進(jìn)行了引物12S rRNA-4的實(shí)際樣品實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示引物對芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻醬、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水餃、豬肉芹菜水餃不能檢出，對南美白對蝦DNA、熟蝦醬、蜢子蝦醬有檢出。性能參數(shù)等同于傳統(tǒng)PCR方法或熒光定量PCR方法，能夠應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和各種基層實(shí)驗(yàn)室食品品質(zhì)監(jiān)控，適合作為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用推廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1:LAMP的引物組成及對應(yīng)區(qū)域信息；
[0031]圖2:12S rRNA-1引物的LAMP反應(yīng)結(jié)果
[0032]圖3:12S rRNA-2引物的LAMP反應(yīng)結(jié)果；
[0033]圖4:12S rRNA-3引物的LAMP反應(yīng)結(jié)果；
[0034]圖5:12S rRNA-4引物的LAMP反應(yīng)結(jié)果；
[0035]圖6:LAMP 引物 12S rRNA-4 的靈敏度；
[0036]圖7:12S rRNA-4引物特異性鑒定圖；
[0037]圖8:5%精密度實(shí)驗(yàn)圖；
[0038]圖9:1%精密度實(shí)驗(yàn)圖；
[0039]圖10:0.5%精密度實(shí)驗(yàn)圖；
[0040]圖11:0%精密度實(shí)驗(yàn)圖；
[0041]圖12:實(shí)際樣品檢測圖；。【具體實(shí)施方式】
[0042]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0043](I)LAMP引物設(shè)計步驟如下:
[0044]①查閱南美白對蝦相關(guān)文獻(xiàn)，了解不同品系南美白對蝦中的特異基因，選取12SrRNA基因?yàn)槟厦腊讓ξr特異基因；
[0045]②在NCBI網(wǎng)站中查找所挑選的基因序列；
[0046]③利用DNAMAN軟件對查到的各序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果表明12S rRNA基因具有一定的保守性；
[0047]①設(shè)計4套特異引物，即蝦LAMP引物12S rRNA_l，蝦LAMP引物12S rRNA-2,蝦LAMP引物12S rRNA-3，蝦LAMP引物12S rRNA_4，堿基序列如下:
[0048]蝦LAMP 引物 12S rRNA-1
[0049]F3 gatagaaacc gacctggc (SEQ ID N0.1)
[0050]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.2)
[0051]FIP(Flc+F2) gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQID N0.3)
[0052]BIP(Blc+B2) aggatacctt aattcaacat cgagacagcg taatcttctt tgagag (SEQID N0.4)
[0053]BLP gtcgcaaccc ttcctgtcg (SEQ ID N0.5)
[0054]蝦LAMP 引物 12S rRNA-2
[0055]F3 atagaaaccg acctggct (SEQ ID N0.6)
[0056]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.7)
[0057]FIP(Flc+F2) gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQID N0.8)
[0058]BIP(Blc+B2) aggatacctt aattcaacat cgaggcgtaa tcttctttga gagtccat(SEQ ID N0.9)
[0059]BLP tcgcaaccct tcctgtcg (SEQ ID N0.10)
[0060]蝦LAMP 引物 12S rRNA-3
[0061]F3 tagaaaccga cctggctc (SEQ ID N0.11)
[0062]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.12)
[0063]FIP(Flc+F2) gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQ IDN0.13)
[0064]BIP(Blc+B2) ccttaattca acatcgaggt cgcgcgtaat cttctttgag agtc (SEQ IDN0.14) [0065]BLP aacccttcct gtcgatatg (SEQ ID N0.15)
[0066]BLP cagcaggagg gtggctacca (SEQ ID N0.16)
[0067]蝦LAMP 引物 12S rRNA-4
[0068]F3 tagaaaccga cctggctc (SEQ ID N0.17)
[0069]B3 tcataagatt aagttacttt aggga (SEQ ID N0.18)[0070]FIP(Flc+F2)gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt (SEQ IDN0.19)
[0071]BIP(Blc+B2)ccttaattca acatcgaggt cgacagcgta atcttctttg agag (SEQ IDN0.20)
[0072](2 ) LAMP反應(yīng)體系的建立
[0073]①精提DNA的實(shí)驗(yàn)方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》(薩姆布魯克D.W拉塞爾著.科學(xué)出版社2002 [美]J.黃培堂等譯)。
[0074]精提DNA的濃度及純度的測定:
[0075]取5 μ L DNA溶液加ddH20梯度稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值。DNA的濃度按照以下公式計算獲得:
[0076]C=AXNX50/1000 式中:
[0077]C-DNA 濃度(μ g/ μ L)
[0078]A——260nm處的吸光值
[0079]N——核酸稀釋倍數(shù)
[0080]IOD260nm = 50 μ g/mL 雙鏈 DNA，當(dāng) 0D26(l/0D28(l 比值在 1.7 ~1.9 之間時，適宜于 LAMP檢測。
[0081]②按照步驟①的方法制備南美白對蝦DNA (lOOng/yL)，并將其作為陽性模板，ddH20 作為陰性對照，分別用各套引物(12S rRNA-ΙU2S rRNA-2U2S rRNA-3U2S rRNA-4)的內(nèi)外引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)體系如下: [0082]25 μ L的LAMP反應(yīng)體系，其成分包括:FIP和BIP各1.6 μ M，F(xiàn)3和/或83各0.2 μ M，F(xiàn)LP 和 / 或 BLP 各 0.8μΜ，20πιΜ Tris-HCl (pH8.8), IOmM KCl,6mM MgSO4, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20, IM 甜菜堿，1.6mM dNTP, 8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 μ 1SYT0-9, 2 μ I DNA模板。
[0083]具體操作時先在冰上準(zhǔn)備LAMP反應(yīng)混合液，擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:12.5 μ L反應(yīng)液RM，8 μ L超純水DW，I μ L引物PM，I μ L Bst酶，0.5 μ I SYT0-9以及2 μ L模板。將除模板外其他試劑配備成混合液混勻后，每管分裝23 μ L，再分別加入2 μ L模板DNA或陰陽性對照模板，參照熒光PCR儀使用說明書，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?保溫階段為63°C 30s，I個循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s，60個循環(huán)，于63°C 45s處收集熒光信號，根據(jù)出峰時間及陰陽性符合率初步篩選引物，結(jié)果如圖2~5所示:
[0084]設(shè)計的4套引物中，圖2中的12S rRNA-1引物有出峰，圖3中的12S rRNA-2引物有出峰，圖4中的12S rRNA-3引物有出峰，圖5中的12S rRNA-4引物約27min出峰可用，可以初步將反應(yīng)時間定在60min進(jìn)行特異性和靈敏度等實(shí)驗(yàn)。
[0085]實(shí)施例2RT-4引物靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0086]按照實(shí)施例1所述方法分別精提扇貝和南美白對蝦(購自農(nóng)貿(mào)市場)的DNA:
[0087]將南美白對蝦DNA用扇貝DNA分別稀釋到質(zhì)量比為10%，5%，1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%,0.01%幾個梯度，每個稀釋度分別取2 μ I進(jìn)行LAMP實(shí)驗(yàn)，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以12S rRNA-4作為LAMP引物，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，參照熒光PCR儀使用說明書，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?保溫階段為63°C 30s，I個循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s,45個循環(huán)，于63°C 45s處收集熒光信號，以確定LAMP反應(yīng)的靈敏度。[0088]以確定LAMP反應(yīng)的靈敏度，同時根據(jù)最低靈敏度出峰時間及假陽性最早出峰時間，確定反應(yīng)時間。反應(yīng)結(jié)果如下圖6所示:
[0089]從圖6中可以看出，將南美白對蝦DNA稀釋至不同濃度梯度，12S rRNA_4作為LAMP引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，出峰時間和濃度梯度呈明顯梯度變化，檢測靈敏度可達(dá)0.5%，最低檢出限出峰時間約在32min，可以將反應(yīng)時間確定在60min。
[0090]由于附圖中原彩色的曲線擴(kuò)增圖，轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎咨?，無法明確指示各樣品的擴(kuò)增情況，因此以文字描述其圖片內(nèi)容，具體信息如下:
[0091]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴(kuò)增，說明本發(fā)明沒有假陰性結(jié)果；
[0092]②南美白對蝦DNA用扇貝DNA分別稀釋到質(zhì)量比為0.1%，0.05%的時候，為平直的線，沒有擴(kuò)增峰出現(xiàn)，引物12S rRNA-4無法檢測。
[0093]③南美白對蝦DNA用扇貝DNA分別稀釋到質(zhì)量比為5%，2%，1%，0.5%幾個梯度時候，分別擴(kuò)增出實(shí)線的峰，出峰時間和濃度梯度呈明顯梯度變化；證明引物12S rRNA-4能夠檢測模板為濃度為0.5%以上的(含DNA濃度為0.5ng/ μ L)，約36min出峰。
[0094]因此，確定LAMP弓丨物12S rRNA-4的模板檢測靈敏度為0.5% (0.5ng/ μ L)。
[0095]實(shí)施例3LAMP弓丨物特異性實(shí)驗(yàn)
[0096]按照實(shí)施例1所述方法分別精提下述樣品的DNA:
[0097]南美白對蝦、青蝦、基圍蝦、草蝦、沙蝦、瀨尿蝦、黃花魚、扇貝、黃金鰈魚、蝦夷貝、
南美鱈魚、狹鱈魚、柳葉魚、牛眼`蛤、沙丁魚、白艦子、雜色蛤、鱈蟹、庸鰈魚、文蛤、真鱈魚、蛇鲅魚、貽貝、金槍魚、章魚、鮐鲅魚、牡蠣、鰈魚、馬哈魚、海蟹、河蟹
[0098]分別以精提的上述各樣品DNA (提取后，樣品DNA的濃度均為IOOng/μ L)作為LAMP反應(yīng)的模板，用12S rRNA-4作為LAMP引物，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，其反應(yīng)體系同實(shí)施例2，參照熒光PCR儀使用說明書，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?保溫階段為63°C 30s, I個循環(huán)；循環(huán)階段為630C 15s，63°C 45s，45個循環(huán)，于63°C 45s處收集熒光信號，驗(yàn)證LAMP反應(yīng)的特異性，利用熒光定量PCR儀觀察反應(yīng)結(jié)果。
[0099]圖7中由于附圖中原彩色的曲線擴(kuò)增圖，轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎咨螅瑹o法明確指示各樣品的擴(kuò)增情況，因此以文字描述其圖片內(nèi)容，具體信息如下:
[0100]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴(kuò)增，說明本發(fā)明沒有假陰性結(jié)果；
[0101]②南美白對蝦DNA檢測的時候，擴(kuò)增出實(shí)線的峰，證明引物12S rRNA-4能夠檢測模板為南美白對蝦的陽性樣品，且對青蝦、基圍蝦、草蝦、沙蝦、瀨尿蝦樣品也能特異性檢出，特異性較好。
[0102]③黃花魚、扇貝、黃金鰈魚、蝦夷貝、南美鱈魚、狹鱈魚、柳葉魚、牛眼蛤、沙丁魚、白艦子、雜色蛤、鱈蟹、庸鰈魚、文蛤、真鱈魚、蛇鲅魚、貽貝、金槍魚、章魚、鮐鲅魚、牡蠣、鰈魚、馬哈魚、海蟹、河蟹DNA樣品擴(kuò)增曲線為平直的線，沒有擴(kuò)增峰出現(xiàn)，引物12S rRNA-4無法檢測。
[0103]因此，確定LAMP引物12S rRNA_4只對南美白對蝦、青蝦、基圍蝦、草蝦、沙蝦、瀨尿蝦特異性檢出，特異性較好；用其繼續(xù)進(jìn)行下述的精密度實(shí)驗(yàn)。
[0104]實(shí)施例4精密度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0105](一)5%精密度實(shí)驗(yàn)
[0106]將南美白對蝦DNA用扇貝DNA稀釋到5% (5ng/yL)作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以南美白對蝦DNA( IOOng/ μ L)作為陽性對照，以12S rRNA-4作為LAMP引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，參照熒光PCR儀使用說明書，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?保溫階段為63°C 30s,I個循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s, 45個循環(huán)，于63°C 45s處收集熒光信號，20個平行樣品觀察5%精密度LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性。20份平行樣品檢測結(jié)果如圖8:[0107]圖8中由于附圖中原彩色的曲線擴(kuò)增圖，轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎咨?，無法明確指示各樣品的擴(kuò)增情況，因此以文字描述其圖片內(nèi)容，具體信息如下:
[0108]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴(kuò)增，說明本發(fā)明沒有假陰性結(jié)果；
[0109]②將南美白對蝦DNA用扇貝DNA稀釋到5% (5ng/yL)作為模板，進(jìn)行檢測的時候，20份樣品均擴(kuò)增出實(shí)線的峰，證明引物12S rRNA-4能夠檢測模板為5ng/μ L的南美白對蝦樣品。
[0110]上述結(jié)果顯示出5% (5ng/yL)精密度的穩(wěn)定性良好。
[0111](二)1%精密度實(shí)驗(yàn)
[0112]將南美白對蝦DNA用扇貝DNA稀釋到1% (Ing/ μ L)作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以南美白對蝦DNA( IOOng/ μ L)作為陽性對照，以12S rRNA-4作為LAMP引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，參照熒光PCR儀使用說明書，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?保溫階段為63°C 30s,I個循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s, 45個循環(huán)，于63°C 45s處收集熒光信號，20個平行樣品觀察1%精密度LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性。檢測結(jié)果如圖9:
[0113]圖9中由于附圖中原彩色的曲線擴(kuò)增圖，轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎咨?，無法明確指示各樣品的擴(kuò)增情況，因此以文字描述其圖片內(nèi)容，具體信息如下:
[0114]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴(kuò)增，說明本發(fā)明沒有假陰性結(jié)果；
[0115]②將南美白對蝦DNA用扇貝DNA稀釋到1% (Ing/ μ L)作為模板，進(jìn)行檢測的時候，20份樣品均擴(kuò)增出實(shí)線的峰，證明引物12S rRNA-4能夠檢測模板為Ing/μ L的南美白對蝦樣品。
[0116]上述結(jié)果顯示出1% (lng/μ L)精密度的穩(wěn)定性良好。
[0117](三)0.5%精密度實(shí)驗(yàn)
[0118]將南美白對蝦DNA用扇貝DNA稀釋到0.5% (0.5ng/yL)作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以南美白對蝦DNA (IOOng/ μ L)作為陽性對照，以12S rRNA-4作為LAMP引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，參照熒光PCR儀使用說明書，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?保溫階段為630C 30s，I個循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s，45個循環(huán)，于63°C 45s處收集熒光信號，20個平行樣品觀察0.5%精密度LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性。
[0119]圖10中由于附圖中原彩色的曲線擴(kuò)增圖，轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎咨?，無法明確指示各樣品的擴(kuò)增情況，因此以文字描述其圖片內(nèi)容，具體信息如下:
[0120]①模板為ddH20的陰性對照為平直的線，沒有擴(kuò)增，說明本發(fā)明沒有假陰性結(jié)果；
[0121]②將南美白對蝦DNA用扇貝DNA稀釋到0.5% (0.5ng/μ L)作為模板，進(jìn)行檢測的時候，20份樣品均擴(kuò)增出實(shí)線的峰，證明引物12S rRNA-4能夠檢測模板為0.5ng/ μ L的南美白對蝦樣品。
[0122]上述結(jié)果顯示出0.5% (0.5ng/yL)精密度的穩(wěn)定性良好。
[0123](四)陰性精密度實(shí)驗(yàn)
[0124]以ddH20代替DNA模板作為0%精密度和陰性對照模板，以南美白對蝦DNA( IOOng/μ L)作為陽性對照，以12S rRNA-4作為LAMP引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，參照熒光PCR儀使用說明書，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?保溫階段為63°C 30s, I個循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s, 45個循環(huán)，于63°C 45s處收集熒光信號，20個平行樣品觀察0%精密度LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性。檢測結(jié)果如圖11:
[0125]圖11中由于附圖中原彩色的曲線擴(kuò)增圖，轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎咨?，無法明確指示各樣品的擴(kuò)增情況，因此以文字描述其圖片內(nèi)容，具體信息如下:
[0126]①20份模板為ddH20的陰性樣品均為平直的線，沒有擴(kuò)增，說明本發(fā)明沒有假陰性結(jié)果;
[0127]②將提取的南美白對蝦DNA (lOOng/μ L)作為陽性對照，進(jìn)行檢測的時候，擴(kuò)增出實(shí)線的峰，證明引物12S rRNA-4能夠檢測南美白對蝦樣品，引物有效。
[0128]上述結(jié)果顯示出0%精密度的穩(wěn)定性良好。
[0129]實(shí)施例5實(shí)際樣品實(shí)驗(yàn)
[0130]以熟蝦醬、蜢子蝦醬、芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻醬、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水餃、豬肉芹菜水餃的DNA作為模板，以ddH20代替DNA模板作為陰性對照，以南美白對蝦DNA (IOOng/μ L)作為陽性對照，以12S rRNA-4作為LAMP引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)體系按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行，參照熒光PCR儀使用說明書，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?保溫階段為63°C 30s，I個循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s，45個循環(huán)，于63°C 45s處收集熒光信號，觀察實(shí)際樣品檢測情況。
[0131]圖12中由于附圖中原彩色的曲線擴(kuò)增圖，轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎咨螅瑹o法明確指示各樣品的擴(kuò)增情況，因此以文字描述其圖片內(nèi)容，具體信息如下:
[0132]①模板為ddH20的陰性樣品均為平直的線，沒有擴(kuò)增，說明本發(fā)明沒有假陰性結(jié)果;
[0133]②將提取的南美白對蝦DNA (lOOng/μ L)作為陽性對照，進(jìn)行檢測的時候，擴(kuò)增出實(shí)線的峰，證明引物有效。
[0134]③將提取的lOOng/μ L熟蝦醬、蜢子蝦醬作為模板，進(jìn)行檢測的時候，擴(kuò)增出實(shí)線的峰，引物12S rRNA-4對熟蝦醬、蜢子蝦醬實(shí)際樣品有檢出，與實(shí)際結(jié)果相符。
[0135]④將提取的IOOng/μ L非南美白對蝦DNA(芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻醬、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水餃、豬肉芹菜水餃)作為模板，進(jìn)行檢測的時候，擴(kuò)增出平滑的直線，無擴(kuò)增曲線，證明引物12S rRNA-4對芝麻沙拉汁、芥末沙拉汁、芝麻醬、香酥麻糖、芥末青豆、青芥辣、辣根、芥末粉、牛肉芹菜水餃、豬肉芹菜水餃實(shí)際樣品無檢出，與實(shí)際結(jié)果相符。
[0136通過反復(fù)試驗(yàn)，以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明研制的蝦成分的LAMP檢測方法(反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如實(shí)施例2)，適用于蝦成分的檢測，定性檢測低限為0.5%，檢測的穩(wěn)定性達(dá)到100%，靈敏度達(dá)到0.5%，特異性達(dá)到100%，均符合推廣應(yīng)用的實(shí)際要求。能夠應(yīng)用于實(shí)際工作，尤其適用于大量樣品快速初篩和品質(zhì)監(jiān)控，適合作為行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用推廣。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測蝦成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物，其特征在于，堿基序列為SEQ ID N0.17~20。
2.一種檢測蝦成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測引物:SEQID N0.17 ~20。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測蝦成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測試劑盒，其特征在于，在檢測試劑盒中: 每 25 μ L 的 LAMP 反應(yīng)體系包括:SEQ ID NO:19 ~20 各 L 6 μ Μ, SEQ ID NO:17 ~18各 0.2μΜ，20πιΜ ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgSO4, IOmM (NH4)2SO4,0.l%Tween20, IM甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst 大片斷 DNA 聚合酶，0.5 μ I SYT0-9,2y I DNA 模板。
4.利用權(quán)利要求2所述試劑盒檢測蝦成分的方法，其特征在于，檢測步驟包括: ①提取待測樣品的基因組DNA； ②以步驟①提取的DNA作為模板，利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測: 每 25 μ L 的 LAMP 反應(yīng)體系包括:SEQ ID NO:19 ~20 各 L 6 μ Μ, SEQ ID NO:17 ~18各 0.2μΜ，20πιΜ ρΗ8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgSO4, IOmM (NH4)2SO4,0.l%Tween20, IM甜菜堿，1.6mM dNTP，8U Bst大片斷DNA聚合酶，0.5 μ I SYT0-9,2y I DNA模板、蒸餾水:余量; 反應(yīng)條件為:保溫階段為63°C 30s, I個循環(huán)；循環(huán)階段為63°C 15s，63°C 45s,45個循環(huán)。
5.如權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物在檢測蝦成分方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK103468816SQ201310433789
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】徐君怡, 曹際娟, 徐楊, 史媛媛 申請人:徐君怡, 曹際娟, 徐楊, 史媛媛