一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，屬于生物【技術(shù)領域】。本發(fā)明方法主要采用氦氣阻斷法與低溫誘導共同對川貝母有絲分裂進行同步化誘導，該誘導方法能有效地提高其后續(xù)的多倍體誘導率，克服了川貝母種植過程中出現(xiàn)品種退化的問題，能明顯縮短種植周期，進而提高川貝母的產(chǎn)量及藥用成分含量，該方法步驟簡單，工藝穩(wěn)定，適用于在工業(yè)化大生產(chǎn)。
【專利說明】—種提高川貝母細胞同步化的誘導方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種川貝母的生物技術(shù)方法，特別是涉及一種有效提高川貝母細胞同步化的誘導方法。 【背景技術(shù)】
[0002]川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，以鱗莖入藥，為名貴的川產(chǎn)道地藥材，堪稱藥中之寶。川貝母植株對生長環(huán)境要求苛刻，它喜冷陰氣候條件，具有耐寒、喜濕、喜蔭蔽、怕高溫的特性。氣溫達到30°C或地溫超過25°C，植株就會枯萎，在海拔低、氣溫高的地區(qū)不能生存，所以川貝母在海拔3500m~4500m的高度才能正常生長，這就使得川貝母野生資源十分稀缺，不能滿足市場的需要。
[0003]多倍體藥用植物一般具有根、莖、葉和花果的巨型性，抗逆性強，藥用成分含量高等特性，這正是川貝母藥材優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)育種所期望達到的目標。然而目前在植物多倍體的誘導過程中，常使用秋水仙素等藥物來誘導植物染色體加倍，但這些藥物都是采取阻斷處于分裂時期細胞的紡錘絲的形成，從而獲得多倍體細胞。眾所周知，細胞在進行有絲分裂，細胞在間期的時間大大的長于分裂期；因此，采用秋水仙素等藥物來誘導植物組織和器官產(chǎn)生多倍體時，都只能對分裂期的細胞有效，所以最終多倍體純合體的誘導率都比較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，該方法步驟簡單，工藝穩(wěn)定，適用于在工業(yè)化大生產(chǎn)中的廣泛應用。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
51:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，pH值為5.6~6.5，培養(yǎng)條件:溫度20~25°C，每天光照8~12h，光照強度為1000~18001x ；
52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按5~20g.1的接種量接入MS+KT 0.5~
1.0mg *L_1+2,4-D 0.5~2.0mg *L-1+鹿糖10~25g *L_1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng),pH值為5.5~6.0，培養(yǎng)條件:溫度18~22°C，每天光照6~10h，光照強度為600~ΙΟΟΟΙχ，搖床轉(zhuǎn)速為80~100r/min的條件下，進行20~30天繼代培養(yǎng)一次；
53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞10~18h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為50~80磅/英寸2，在20~25°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12~24h后放出氦氣；
54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.1~0.5mg.171+KT 0.1~0.5mg.171+蔗糖20~40g噸―1+甘油5~20%的液體培養(yǎng)基中，在I~5°C的低溫條件下培養(yǎng)12~24h后再放在溫度為18~22°C條件下恢復培養(yǎng)24~48h。[0006]優(yōu)選地，SI步驟所述的培養(yǎng)基為:MS+6-BA 0.1~0.5mg.L_1+NAA 0.1~
1.0mg.L:+2,4~D 1.0 ~4.0mg.L1+ 鹿糖 30 ~50g.L1+ 瓊脂 4.5 ~6.0g.L、
[0007]優(yōu)選地，SI步驟中培養(yǎng)條件:溫度20°C，每天光照12h，光照強度為16001x。
[0008]優(yōu)選地，S2步驟中培養(yǎng)條件:溫度20°C，每天光照8h，光照強度為8001x。
[0009]優(yōu)選地，S3步驟中向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為60磅/英寸2，在22°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20h后放出氦氣。
[0010]優(yōu)選地，S4步驟中培養(yǎng)條件:在30C的低溫條件下培養(yǎng)20h后再放在溫度為20°C條件下恢復培養(yǎng)48h。
[0011]優(yōu)選地，在經(jīng)過S4步驟處理后，取少量細胞用滴管吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微鏡觀察并計算出分裂指數(shù)。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明是通過對川貝母植物細胞進行同步化誘導處理，使川貝母細胞處于有絲分裂的相同分裂時期，從而有效地提高其后續(xù)的多倍體誘導率，進而提高川貝母的產(chǎn)量及藥用成分含量。本發(fā)明主要以氦氣阻斷法與低溫誘導共同對川貝母有絲分裂進行同步化誘導，從而建立一個同步化川貝母細胞系，該誘導方法克服了川貝母種植過程中出現(xiàn)品種退化的問題，能明顯縮短種植周期。該誘導方法顯著的提高了川貝母細胞的分裂指數(shù)，獲得了較高的同步化率，該方法步驟簡單，工藝穩(wěn)定，適用于在工業(yè)化大生產(chǎn)中的廣泛應用。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例對 本發(fā)明做進一步的描述，本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述:
實施例1:一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
51:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，pH值為5.6~6.5，培養(yǎng)條件:溫度20~25°C，每天光照8~12h，光照強度為1000~18001x ；
52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按5~20g.1-1的接種量接入MS+KT 0.5~
1.0mg *L_1+2,4-D 0.5~2.0mg *L-1+鹿糖10~25g *L_1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng),pH值為5.5~6.0，培養(yǎng)條件:溫度18~22°C，每天光照6~10h，光照強度為600~ΙΟΟΟΙχ，搖床轉(zhuǎn)速為80~100r/min的條件下，進行20~30天繼代培養(yǎng)一次；
53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞10~18h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為50~80磅/英寸2，在20~25°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12~24h后放出氦氣；
54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.1~0.5mg.171+KT 0.1~0.5mg.171+蔗糖20~40g噸―1+甘油5~20%的液體培養(yǎng)基中，在I~5°C的低溫條件下培養(yǎng)12~24h后再放在溫度為18~22°C條件下恢復培養(yǎng)24~48h。
[0014]實施例2:—種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
S1:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基MS+6-BA 0.1 ~0.5mg *L_1+NAA 0.1 ~1.0mg *L_1+2,4-D 1.0 ~4.0mg.171+鹿糖30~50g.L—1+瓊脂4.5~6.0g.L—1中進行培養(yǎng)，pH值為5.6~6.5,培養(yǎng)條件:溫度20~25°C，每天光照8~12h，光照強度為1000~18001x ；
52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按5~20g1的接種量接入MS+KT 0.5~
1.0mg *L_1+2,4-D 0.5~2.0mg *L-1+鹿糖10~25g *L_1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng),pH值為5.5~6.0，培養(yǎng)條件:溫度18~22°C，每天光照6~10h，光照強度為600~ΙΟΟΟΙχ，搖床轉(zhuǎn)速為80~100r/min的條件下，進行20~30天繼代培養(yǎng)一次；
53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞10~18h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為50~80磅/英寸2，在20~25°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12~24h后放出氦氣；
54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.1~0.5mg.171+KT 0.1~0.5mg.171+蔗糖20~40g噸―1+甘油5~20%的液體培養(yǎng)基中，在I~5°C的低溫條件下培養(yǎng)12~24h后再放在溫度為18~22°C條件下恢復培養(yǎng)24~48h。
[0015]實施例3:—種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
51:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基 MS+6-BA 0.1mg.L、NAA 0.1mg.1^+2，4-D 1.0mg1+ 蔗糖 30g.1+ 瓊脂4.5g.1中進行培養(yǎng)，pH值為5.6~6.5，培養(yǎng)條件:溫度20°C，每天光照8h，光照強度為 IOOOlx ；
52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按5g.1的接種量接入MS+KT 0.5mg.L^+2,4-D
0.5mg.L-1+鹿糖IOg *L_1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng),pH值為5.5~6.0,培養(yǎng)條件:溫度18°C，每天光照6h，光照強度為6001x，搖床轉(zhuǎn)速為80r/min的條件下，進行20天繼代培
養(yǎng)一次;
53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加lmmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞10h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為50磅/英寸2，在20°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12h后放出氦氣；
54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.1mg.'+ΚΤ 0.1mg.L—1+蔗糖200g.1+甘油5%的液體培養(yǎng)基中，在1°C的低溫條件下培養(yǎng)12h后再放在溫度為18°C條件下恢復培養(yǎng)24h。
[0016]在經(jīng)過S4步驟處理后，取少量細胞用滴管吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微鏡觀察并計算出分裂指數(shù)。
[0017]實施例4:一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟 :
51:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基 MS+6-BA 0.5mg.L:+NAA 1.0mg.L:+2,4-D 4.0mg.L1+ 鹿糖 50g.L1+瓊脂6.0g.L-1中進行培養(yǎng)，pH值為6.5，培養(yǎng)條件:溫度25 V，每天光照12h，光照強度為18001x ；
52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按20g.1的接種量接入MS+KT 1.0mg.1^+2，4-D
2.0mg七1+蔗糖25g -1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，pH值為6.0,培養(yǎng)條件:溫度22°C，每天光照10h，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，搖床轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下，進行30天繼代培養(yǎng)一次；
53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加3mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞18h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為80磅/英寸2，在25°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h后放出氦氣；
54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.5mg .L-1'+ΚΤ 0.5mg七1+蔗糖40g.L-1+甘油20%的液體培養(yǎng)基中，在5°C的低溫條件下培養(yǎng)24h后再放在溫度為22°C條件下恢復培養(yǎng)48h。
[0018]在經(jīng)過S4步驟處理后，取少量細胞用滴管吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微鏡觀察并計算出分裂指數(shù)。
[0019]實施例5:—種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
51:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基 MS+6-BA 0.3mg.L:+NAA 0.5mg.L:+2,4-D 2.0mg.L1+ 鹿糖 40g.L1+瓊脂5.0g.L-1中進行培養(yǎng)，pH值為6.0，培養(yǎng)條件:溫度20°C，每天光照12h，光照強度為16001x ；
52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按IOg.L-1的接種量接入MS+KT 0.8mg.1^+2，4-D
1.0mg七1+蔗糖15g.L-1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，pH值為6.0,培養(yǎng)條件:溫度20°C，每天光照8h，光照強度為8001x，搖床轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下，進行25天繼代培養(yǎng)一次；
53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加2mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞12h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為60磅/英寸2，在22°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20h后放出氦氣；
54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.3mg .L-1'+ΚΤ 0.3mg七1+蔗糖30g .L-1+甘油10%的液體培養(yǎng)基中，在:TC的低溫條件下培養(yǎng)20h后再放在溫度為20°C條件下恢復培養(yǎng)48h。
[0020]在經(jīng)過S4步驟處理后，取少量細胞用滴管吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微鏡觀察并計算出分裂指數(shù)。
[0021]實施例6:—種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
51:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基 MS+6-BA 0.3mg.L:+NAA 0.8mg.L:+2,4-D 2.0mg.L1+ 鹿糖 35g.L1+瓊脂5.0g.L-1中進行培養(yǎng)，pH值為6.0,培養(yǎng)條件:溫度23°C，每天光照9h，光照強度為12001x ；
52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按15g.L-1的接種量接入MS+KT 0.6mg.1^+2，4-D
1.5mg七1+蔗糖20g l-1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，pH值為5.6，培養(yǎng)條件:溫度21°C，每天光照6h，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，搖床轉(zhuǎn)速為80r/min的條件下，進行25天繼代培養(yǎng)一次；
53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞15h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為70磅/英寸2，在20~25°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18h后放出氦氣；
54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.3mg .l'+ΚΤ 0.4mg七1+蔗糖35g.171+甘油20%的液體培養(yǎng)基中，在4°C的低溫條件下培養(yǎng)18h后再放在溫度為22°C條件下恢復培養(yǎng)30h。
[0022]在經(jīng)過S4步驟處理后，取少量細胞用滴管吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微鏡觀察并計算出分裂指數(shù)。
[0023]實施例7:—種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
51:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，PH值為5.6，培養(yǎng)條件:溫度20°C，每天光照8h，光照強度為IOOOlx ；
52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按16g.L-1的接種量接入MS+KT 1.0mg.L-1+2,4-D
2.0mgL-1+蔗糖IOgL-1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，pH值為5.5，培養(yǎng)條件:溫度18°C，每天光照6h，光照強度為6001x，搖床轉(zhuǎn)速為80r/min的條件下，進行20天繼代培養(yǎng)一次；
53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加lmmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞10h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為50磅/英寸2，在20°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12h后放出氦氣；
54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.5mgL-1+ΚΤ 0.5mgL+1+蔗糖20g L-1+甘油5%的液體培養(yǎng)基中，在1°C的低溫條件下培養(yǎng)12h后再放在溫度為18°C條件下恢復培養(yǎng) 24h。
[0024]在經(jīng)過S4步驟處理后，取少量細胞用滴管吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微鏡觀察并計算出分裂指數(shù)。
[0025]實施例8:一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
S1:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，PH值為6.5，培養(yǎng)條件:溫度25°C，每天光照12h，光照強度為18001x ；
S2:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按20g.L-1的接種量接入MS+KT 0.5mg.L-1+2，4-D
2.0mg七1+蔗糖IOg -L-1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，pH值為6.0,培養(yǎng)條件:溫度22°C，每天光照10h，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，搖床轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下，進行30天繼代培養(yǎng)一次；
S3:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加3mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞18h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為80磅/英寸2，在25°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h后放出氦氣；
S4:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.1mg L-1+ΚΤ 0.1mg七1+蔗糖40g L-1+甘油20%的液體培養(yǎng)基中，在5°C的低溫條件下培養(yǎng)24h后再放在溫度為22°C條件下恢復培養(yǎng)48h。
[0026]在經(jīng)過S4步驟處理后，取少量細胞用滴管吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微鏡觀察并計算出分裂指數(shù)。
[0027]實施例9:一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
51:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，PH值為6.0，培養(yǎng)條件:溫度22°C，每天光照10h，光照強度為16001x ；
52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按20g.L-1的接種量接入MS+KT 1.0mg.1^+2，4-D2.0mg噸―1+蔗糖25g.L-1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，pH值為6.0,培養(yǎng)條件:溫度20°C，每天光照8h，光照強度為8001x，搖床轉(zhuǎn)速為90r/min的條件下，進行25天繼代培養(yǎng)一次；
53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加2mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞16h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為60磅/英寸2，在22°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18h后放出氦氣；
54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.5mg.L-1+KT 0.5mg.L-1+蔗糖240g.L—1+甘油20%的液體培養(yǎng)基中，在3°C的低溫條件下培養(yǎng)20h后再放在溫度為20°C條件下恢復培養(yǎng)36h。
[0028]實施例10:—種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，它包括以下步驟:
S1:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成Icm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基 MS+6-BA 0.3mg *L 1 +NAA 0.5 mg *L:+2,4-D 2.0mg.L1+ 鹿糖 30 ~50g *L k 瓊脂5g.L-1中進行培養(yǎng)，在pH值為6.0，培養(yǎng)溫度21 °C，每天光照IOh和光照強度為12001x的條件下培養(yǎng)。
[0029]S2:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按15g .L-1的接種量接入MS+KT 0.5mg -L^+2,4-D 1.0mg.L-1+蔗糖20g.L-1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，在pH值為5.8，培養(yǎng)溫度20°C、每天光照8h和光照強度為8001x，搖床轉(zhuǎn)速為90r/min的條件下，以25天繼代培養(yǎng)一次。
[0030]S3:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加2mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞14h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著采取緩慢向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為60磅/英寸2，在22°C的條件下培養(yǎng)18h后，放出氦氣。
[0031]S4:將在S3步驟處理完畢的細胞，轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.3mg -L+KT 0.3mg.L-1+蔗糖30g.L-1+甘油15%的液體培養(yǎng)基中，在3°C的低溫條件下培養(yǎng)18h后，再放在為溫度20°C條件下恢復培養(yǎng)36h。
[0032]在經(jīng)過S4步驟處理后，取少量細胞用滴管吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微鏡觀察并計算出分裂指數(shù)。
[0033]下面通過實驗進一步說明本發(fā)明的效果:
實驗一:本發(fā)明細胞分裂指數(shù)測定
SI步驟:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成Icm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基 MS+6-BA 0.3mg.I/1 +NAA 0.5 mg.L_1+2,4-D 2.0mg.L-1+ 蔗糖 30 ~50g.L-1+瓊脂5 g.L—1中進行培養(yǎng)，在pH值為6.0，培養(yǎng)溫度21°C，每天光照IOh和光照強度為12001x的條件下培養(yǎng)。S2步驟:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按15g.L-1的接種量接入MS+KT 0.5mg.L^+2,4-D 1.0mg.L-1+蔗糖20g.L-1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，在PH值為5.8，培養(yǎng)溫度20°C、每天光照8h和光照強度為8001x，搖床轉(zhuǎn)速為90r/min的條件下，以25天繼代培養(yǎng)一次。S3步驟:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加2mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞14h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著采取緩慢向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為60磅/英寸2，在220C的條件下培養(yǎng)18h后，放出氦氣。S4步驟:將在S3步驟處理完畢的細胞，轉(zhuǎn)接入MS+NAA
0.3mg.r+KT 0.3mg.L-1+蔗糖30g.L-1+甘油15%的液體培養(yǎng)基中，在3°C的低溫條件下培養(yǎng)18h后，再放在為溫度20 V條件下恢復培養(yǎng)36h。在完成上述步驟后，取出細胞進行細胞分裂指數(shù)測定。取少量細胞，用滴管反復吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微觀察每個樣本，得其分裂指數(shù)為92.3%。
[0034]實驗二:在實驗一 S3步驟中改加入1.0mmoI/L腺嘌呤核苷處理川貝母細胞，其他步驟同實驗一，其測得的川貝母細胞分裂指數(shù)為82.8%。
[0035]實驗三:在實驗一 S4步驟中的15%的甘油改為5%，其他步驟同實驗一，其測得的川貝母細胞分裂指數(shù)為79.5%。
[0036]實驗四:在實驗一 S4步驟的低溫處理溫度改為5°C，其他步驟同實驗一，其測得的川貝母細胞分裂指數(shù)為75.6%。[0037]實驗五:在實驗一 S4步驟中培養(yǎng)的細胞，放在5°C的低溫條件下培養(yǎng)12h后，再放在為溫度22°C條件下恢復培養(yǎng)24h，其他步驟同實驗一，其測得的川貝母細胞分裂指數(shù)為63.3%。
[0038]實驗六:取消實驗一 S3步驟中用2.0mmoL/L的腺嘌呤核苷處理環(huán)節(jié)，其他步驟同實驗一，其測得的川貝母細胞分裂指數(shù)為36.7%。
[0039]實驗七:將實驗一 S3步驟全部取消，其他步驟同實驗一，其測得的川貝母細胞分裂指數(shù)為6.2%。
[0040]實驗八:將實驗一 S3步驟全部取消，其他步驟同實驗一，其測得的川貝母細胞分裂指數(shù)為38.1%。
[0041]通過實驗表明，本發(fā)明誘導方法能有效提高川貝母細胞同步化，能顯著的提高川貝母細胞的分裂指數(shù)，能有效地提高其后續(xù)的多倍體誘導率，進而能有效提高川貝母的產(chǎn)量及藥用成分含量。
【權(quán)利要求】
1.一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，其特征在于:它包括以下步驟: 51:將由川貝母鱗片葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織切成0.5~2cm2的大小轉(zhuǎn)接到產(chǎn)生疏松愈傷組織的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，pH值為5.6~6.5，培養(yǎng)條件:溫度20~25°C，每天光照8~12h，光照強度為1000~18001x ； 52:將SI步驟獲得的疏松愈傷組織按5~20g.L-1的接種量接入MS+KT 0.5~1.0mg *L_1+2,4-D 0.5~2.0mg *L-1+鹿糖10~25g *L_1的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng),pH值為5.5~6.0，培養(yǎng)條件:溫度18~22°C，每天光照6~10h，光照強度為600~ΙΟΟΟΙχ，搖床轉(zhuǎn)速為80~100r/min的條件下，進行20~30天繼代培養(yǎng)I次； 53:在S2步驟的懸浮培養(yǎng)過程中，選取在第三次繼代培養(yǎng)基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培養(yǎng)處理細胞10~18h，再更換在不加腺嘌呤核苷的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)I周；接著向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為50~80磅/英寸2，在20~25°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12~24h后放出氦氣； 54:將S3步驟處理完畢的細胞轉(zhuǎn)接入MS+NAA 0.1~0.5mg.171+KT 0.1~0.5mg.171+蔗糖20~40g噸―1+甘油5~20%的液體培養(yǎng)基中，在I~5°C的低溫條件下培養(yǎng)12~24h后再放在溫度為18~22°C條件下恢復培養(yǎng)24~48h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，其特征在于:S1步驟中所述的培養(yǎng)基為:MS+6-BA 0.1 ~0.5mg.L-1+NAA 0.1 ~1.0mg.1^+2Α~?> 1.0 ~4.0mg.L1+ 鹿糖 30 ~50g.L1+ 瓊脂 4.5 ~6.0g.L 工。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，其特征在于:S1步驟中培養(yǎng)條件:溫度20°C，每天光照12h，光照強度為16001x。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，其特征在于:S2步驟中培養(yǎng)條件:溫度20°C，每天光照8h，光照強度為8001x。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，其特征在于:S3步驟中向培養(yǎng)基中通入氦氣并保持壓力為60磅/英寸2，在22°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20h后放出氦氣。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，其特征在于:S4步驟中培養(yǎng)條件:在3°C的低溫條件下培養(yǎng)20h后再放在溫度為20°C條件下恢復培養(yǎng)48h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高川貝母細胞同步化的誘導方法，其特征在于:在經(jīng)過S4步驟處理后，取已處理過的細胞用滴管吹吸，將細胞打散混勻，滴I滴細胞懸液于冷凍干燥后的載玻片上，用席夫式染液染色制片，經(jīng)顯微鏡觀察并計算出分裂指數(shù)。
【文檔編號】C12N5/04GK103468633SQ201310436772
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】薛剛, 王躍華, 余強, 王曉蓉 申請人:薛剛