一種利用單核苷酸多態(tài)性檢測雞嫩度性狀的方法及引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用單核苷酸多態(tài)性檢測雞嫩度性狀的方法及引物，通過對雞CAPN1和CAST基因CDS區(qū)進行SNPs檢測，利用F1引物在CAPN1基因的外顯子6檢測到1個SNP位點，該SNP位點在GenBank序列(GenBank?NO:NC_006090.1)上具體為3535位由G→A；利用F2引物在CAST基因的外顯子11檢測到1個SNP位點，該SNP位點在GenBank序列(GenBank?NO:NC_006127.2)上具體為37752位由A→T；并在優(yōu)質(zhì)肉雞中分析單個位點不同基因型和嫩度性狀的關(guān)系。
【專利說明】—種利用單核苷酸多態(tài)性檢測雞嫩度性狀的方法及引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用分子生物學(xué)技術(shù)檢測雞嫩度性狀的方法及引物。本發(fā)明的目的是提供一種用分子生物學(xué)技術(shù)，即單核苷酸多態(tài)性來檢測雞嫩度性狀的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生活水平的不斷提高，人們對優(yōu)質(zhì)雞的需求日漸擴大，優(yōu)質(zhì)雞的生產(chǎn)由過去的家庭式副業(yè)生產(chǎn)逐漸轉(zhuǎn)向規(guī)模化大生產(chǎn)。優(yōu)質(zhì)雞主要強調(diào)的是肉質(zhì)，我國地方雞種一般都具有生長速度慢、肉質(zhì)好的特點。由于基因及其表達(dá)的差異是導(dǎo)致生物性狀多樣性的根本原因，肉質(zhì)性狀的差異根本上也是由于基因及其表達(dá)的差異所引起。另一方面，隨著肉雞育種理論和實踐的不斷充實和發(fā)展，使現(xiàn)代肉雞的生長速度達(dá)到很高的水平，但隨之產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)是腹脂的大量沉積，這造成了雞肉品質(zhì)的低劣，最明顯的是風(fēng)味的下降。雞肉的加工學(xué)性狀、組織學(xué)性狀，尤其是食用品質(zhì)(嫩度、風(fēng)味、多汁性、系水力等)都直接受到肌纖維組織學(xué)特性的影響。因此，研究調(diào)控雞肌纖維生長發(fā)育的相關(guān)基因作用機制十分有必要。
[0003]肉質(zhì)體系的評 價是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，一方面影響肌肉品質(zhì)的因素復(fù)雜，另一方面肉質(zhì)體系的評價指標(biāo)復(fù)雜。影響肉質(zhì)的因素復(fù)雜，主要受到基因和環(huán)境的影響，以及它們之間的互作，基因因素主要包括品種、性別、基因型等，環(huán)境因素主要有營養(yǎng)水平、飼養(yǎng)方式、宰前和宰后的處理方式?；蚝铜h(huán)境共同影響了肉的組織和結(jié)構(gòu)、宰前和宰后肉的化學(xué)組成，從而影響到肉的食用品(Harmegnies et al, 2006 ；Smulders et al, 2006)。肉質(zhì)評價體系就目前常見的指標(biāo)一般有客觀標(biāo)準(zhǔn)與主觀標(biāo)準(zhǔn)?？陀^標(biāo)準(zhǔn)是指肉質(zhì)的物理、化學(xué)和生物學(xué)等特性，以及衛(wèi)生檢驗指標(biāo)；主觀標(biāo)準(zhǔn)是指人的感官評定。雞肉品質(zhì)一般包括感官品質(zhì)、保存性、深加工品質(zhì)、營養(yǎng)價值和衛(wèi)生質(zhì)量。感官品質(zhì)是指顏色、肉的PH值、系水力、肉嫩度和肉的風(fēng)味。
[0004]嫩度反映了肉品的組織結(jié)構(gòu)，這一性狀用肌肉剪切力來測量。嫩度主要受肌肉纖維的組織學(xué)和生化特性的影響。紅肌纖維直徑小，肌紅蛋白豐富，適于有氧代謝；白肌纖維直徑大，糖原含量豐富但肌紅蛋白與脂肪酸較少，適于無氧代謝。肌肉中肌纖維的組成會影響到肉品的嫩度。纖維越細(xì)，肉質(zhì)越嫩，我國的地方雞種比同周齡的國外肉雞的纖維細(xì)(耿照玉等，2003)。
[0005]隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，動物育種工作也有了更為強有力的工具一分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)，有關(guān)雞肉質(zhì)性狀的候選基因也被進行了廣泛的研究。同時這些重要候選基因的基因型研究也為優(yōu)質(zhì)雞的定性工作提供了新的視野，甚至有可能以分子水平上的研究為基礎(chǔ)發(fā)展出更為客觀和準(zhǔn)確的測評體系。
[0006]隨著對優(yōu)質(zhì)肉雞的選育，雞肉肌纖維有變粗、嫩度有下降的趨勢，改善嫩度勢在必行。目前嫩度測定還只能在屠宰后進行，若用傳統(tǒng)的方法進行選育，則不但加大選育成本，且遺傳進展緩慢。標(biāo)記輔助選擇(MAS)為解決這一問題提供了新的思路。選擇與數(shù)量性狀位點(QTL)相連鎖的分子遺傳標(biāo)記(基因或非基因標(biāo)記)，通過多基因型的識別，即可實現(xiàn)對個體的直接選擇，從而達(dá)到盡快提高生產(chǎn)性能的目的。各國研究人員的研究成果表明了鈣蛋白酶系統(tǒng)基因作為牛肉肉品質(zhì)嫩度性狀候選基因的潛力，同時指出鈣蛋白酶系統(tǒng)控制著肌纖維蛋白的降解，與肌肉增長和宰后嫩度的變化密切相關(guān)，這對研究雞肉肉質(zhì)有重要的借鑒意義。
[0007]PCR-SSCP分析法是一種發(fā)展很快并且己經(jīng)被廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)方法。SSCP是現(xiàn)今檢測SNP極其重要的技術(shù)之一。該方法在簡便性、重復(fù)性、檢測靈敏性等方面不斷有新的改進，從而使其更加完善。PCR-SSCP與測序技術(shù)相結(jié)合能夠準(zhǔn)確找到SNP位點。
[0008]鈣蛋白酶(calpain)廣泛存在于各組織，CAPN是細(xì)胞質(zhì)中主要的蛋白水解酶，在肌原纖維蛋白降解中起著重要的作用。肌肉增長和宰后嫩度的變化與蛋白質(zhì)水解程度密切相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用單核苷酸多態(tài)性檢測雞嫩度性狀的方法及引物。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0011]本發(fā)明以雞CAPNl和CAST基因作為影響嫩度的候選基因，通過對雞CAPNl和CAST基因CDS區(qū)進行SNPs (single nucleotide polymorphisms)檢測，并在優(yōu)質(zhì)肉雞中分析單個位點不同基因型和嫩度性狀的關(guān)系，目的在于尋找與嫩度高度相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為優(yōu)質(zhì)肉雞的分子育種提供理論依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖11%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA結(jié)果；
[0013]圖2CAPNl基因PCR-SSCP電泳與測序圖；
[0014]圖3CAST 基因PCR-SSCP電泳與測序圖；
【具體實施方式】
[0015]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
[0016]本試驗雞群主要來源于四川大恒家禽育種有限公司培育的8個優(yōu)質(zhì)肉雞新品系，分別為 5 個純系 S03、S02、S05、S01、D99 和 3 個配套系 S01XD99、S01XS10、S01XS05，純系已經(jīng)過3個世代的選育，每個群體各選公母15只，共240個個體作為試驗素材。飼養(yǎng)全階段由專人管理，單籠飼養(yǎng)，管理及營養(yǎng)水平一致，自由采食，達(dá)到適宜上市體重(2kg)時屠宰。血樣米樣方法為雞翅靜脈米血，所米血樣均為ImL/只、EDTA抗凝,血樣于_20°C冷凍保存。
[0017]最大剪切值:取胸肌中段，平整放入塑料袋中，在0?4°C條件下冷藏24h后升溫15min,然后80°C水浴加熱到樣品中心溫度70°C,4°C冷卻，順肌纖維方向用剪刀修成直徑為1.27cm，長度為3cm-5cm的肉樣，用品質(zhì)分析儀測定剪切值。
[0018]I)基因組DNA提取
[0019]雞血基因組DNA的提取參考從家禽血細(xì)胞中提取DNA方法，并參照孟祥軍改進的方法進行。試驗前先對所用器具，試劑，耗材進行高壓滅菌。具體步驟如下:
[0020]①冷凍血液在室溫融化以后，取IOii L移至離心管中，加入500 ii L STE緩沖液，IOuL SDS，加入IOii L蛋白酶K(濃度為1011§/111)，混合，上下充分搖動，371:搖床水浴2小時，然后55°C水浴過夜。
[0021]②將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，輕搖離心管20分鐘，直至兩相混合形成乳濁液，4°C，12000r/min離心10分鐘。
[0022]③取上清，再加入等體積苯酚，輕搖離心管10分鐘，4°C，12000r/min離心10分鐘。
[0023]④取上清，加入等體積酚:氯仿:異戊醇混合液(24:23:1)，緩慢顛倒離心管10分鐘，4°C，12000r/min 離心 10 分鐘。
[0024]⑤取上清,加入等體積氯仿,緩慢顛倒離心管10分鐘，4°C, 12000r/min離心10分鐘。
[0025]⑥取上清，加入2倍體積的預(yù)冷_20°C冰乙醇沉淀DNA，緩慢的轉(zhuǎn)動離心管，可見白色DNA沉淀。
[0026]⑦4°C，12000r/min離心10分鐘，去上清，然后加4°C預(yù)冷的70%乙醇快速沖洗兩次，12000r/min離心10分鐘,去上清。
[0027]⑧將DNA置于室溫下自然風(fēng)干干燥(注意不能太干燥)，根據(jù)沉淀的量加入適量(100-200 U L) TE (pH8.0 )緩沖液溶解，置4 °C冰箱溶解過夜；溶解后的DNA可貯于4°C、-20°C、-70°C 中備用。
[0028]注意在抽吸上清液時，盡量小心勿將中間的蛋白質(zhì)層抽出。
[0029]DNA濃度和純度的檢測
[0030]用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測總DNA，并用DNA定量儀定量其濃度及純度。要求DNA純度(0D值)在1.3以上，如若不純可使用飽和酚，酚氯仿重新抽提。
[0031]①瓊脂糖凝膠電泳檢測:取5 y L待測DNA溶液和I y L溴酚藍(lán)置入一微量離心管中混勻，上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.05%GoIdView染料)，75V電泳5小時，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察各樣品電泳條帶的亮度和分布情況，參照Marker確定各DNA樣品需要稀釋的倍數(shù)，最后照相并保存圖象。觀察電泳條帶，無明顯拖尾，條帶集中明亮則符合實驗要求。
[0032]②分光光度法測定:取6 ii L待測DNA溶液稀釋500倍至3mL，分別在紫外分光光度計260nm和280nm處測定OD值。
[0033]DNA 濃度(ii L/ml) =OD260 X 稀釋倍數(shù) X 50
[0034]DNA 純度=OD260/OD280
[0035]純DNA樣品的0D26Q/0D28Q比值為1.8，質(zhì)量好的DNA其0D26(l/0D28(l比值應(yīng)在1.6-1.8之間。若大于1.8說明RNA尚未除凈,考慮用RNAse處理；若小于1.6則說明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚，可再用苯酚/氯仿或乙醚處理；若在270nm處存在高吸收表明有酚的干擾，當(dāng)然也會存在既有蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液其比值也為1.8，若有必要結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測一起鑒定DNA的純度。
[0036]2) PCR-SSCP 分析
[0037]2.1PCR 擴增
[0038]PCR 擴增體系(IOii L):2 X Taq PCR MasterMix5 ii L、ddH203.4 ii L、引物(IOpmol/ii L)各 0.L、模板 DNA (50ng/mL) 0.8u L0 PCR 擴增參數(shù):94°C 4min，[94°C 30s, 58 °C(根據(jù)所設(shè)計引物而確定溫度)30s, 72°C lmin]35cycles,72°C 8min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，UVP凝膠成像系統(tǒng)照相保存。[0039]2.2聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳
[0040]以濃度12%，體積30mL的非變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳為例，步驟如下:
[0041]a清洗玻板、膠條，烘干，用0.5%瓊脂糖封閉玻璃板和膠條間的縫隙。
[0042]b在IOOmL小燒杯內(nèi)加入相應(yīng)30%聚丙烯酰胺12mL，10XTBE3mL, 50%過硫酸胺40 u L，TEMED20 u L，加ddH20至30mL，混勻后迅速灌膠。
[0043]c當(dāng)膠灌至離玻璃板上沿0.1cm時停止灌膠，插入梳子，室溫聚合，多余的丙烯酰胺4°C保存，隨時觀察凝膠聚合情況并補加聚丙烯酰胺。
[0044]d膠聚合后，向電泳槽加入1XTBE，用注射器沖洗點樣孔預(yù)電泳lOmin。
[0045]e取2.0ii L PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加3 ii L變性Buffer，離心混勻，98°C變性IOmin后迅速冰浴IOmin,點樣。
[0046]flOO 伏電泳 12h。
[0047]注:聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%、12%、14%分別加入10mL、12mL、14mL30%的丙烯酰胺。
[0048]2.3 銀染
[0049]a電泳結(jié)束后關(guān)閉電泳儀，放出電泳液，取出凝膠置于10%的乙醇溶液中固定10-15分鐘一去離子水洗膠一0.l%AgN03染色液染色30分鐘一去離子水漂洗凝膠3次。
[0050]b用顯色液進行顯 影，當(dāng)凝膠上顯出清晰的DNA條帶時，適時倒掉顯色液，用去離子水漂洗凝膠2次。加入4%的冰醋酸溶液，終止顯色反應(yīng)。
[0051]c用去離子水漂洗凝膠2次，保鮮膜封好，用凝膠成像系統(tǒng)儀觀察電泳結(jié)果并拍照、保存。
[0052]注:染色液和硝酸都可以重復(fù)利用。
[0053]3)多態(tài)性位點的遺傳效應(yīng)統(tǒng)計分析模型
[0054]用SAS Version8.0軟件包GLM程序計算CAPNl、CAPN3和CAST基因多態(tài)位點對雞屠宰性狀和肉質(zhì)性狀遺傳效應(yīng)分析，分析結(jié)果用最小二乘均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤表示。固定模型如下:
[0055]Y=U +B+S+G+bX+e
[0056]其中，Y:個體屠宰性狀的觀測值；U:屠宰及肉質(zhì)性狀的群體均值；B:品種或品系效應(yīng)；S:性別效應(yīng)；G:基因型效應(yīng)；b:影響屠體重的回歸系數(shù)；X:屠體重(協(xié)變量，只用于屠宰性狀)。e:隨機殘差效應(yīng)。
[0057]實驗結(jié)果
[0058]1、基因組DNA提取結(jié)果
[0059]采用常規(guī)酚-氯仿法從實驗雞血液中提取基因組DNA，用1.0%瓊脂糖電泳檢測，可以看到DNA條帶清晰、明亮、無雜帶，完全符合后續(xù)PCR實驗的要求(圖1)。
[0060]2、SNP位點檢測
[0061]I)利用Fl引物在CAPNl基因的外顯子6檢測至IJ I個SNP位點(見表I與圖2)，該SNP 位點在 GenBank 序列(GenBank N0:NC_006090.1)上具體為 3535 位由 G — A。
[0062]表ICAPNl基因SNP掃描所用引物詳細(xì)信息
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種利用單核苷酸多態(tài)性檢測雞嫩度性狀的方法，其特征在于，通過對雞CAPNl和CAST基因⑶S區(qū)進行SNPs檢測，利用Fl引物在CAPNl基因的外顯子6檢測到I個SNP位點，該 SNP 位點在 GenBank 序列(GenBank N0:NC_006090.1)上具體為 3535 位由 G — A ;利用F2引物在CAST基因的外顯子11檢測至IJ I個SNP位點，該SNP位點在GenBank序列(GenBank N0:NC_006127.2)上具體為37752位由A — T ;并在優(yōu)質(zhì)肉雞中分析單個位點不同基因型和嫩度性狀的關(guān)系。
2.權(quán)利要求1所述的方法中采用的引物，其特征在于，包括Fl和F2;F1序列為:F:AGGGGT AGG GTA ATA GAA CTA ；R:ACC GCC AGC CAT CAA AT ；F2 序列為:F:AAA CGA GAA GGTAGC C；R:CTG GTA ·TCT TTG GAA GAC ATA。
【文檔編號】C12Q1/68GK103436632SQ201310437042
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】張增榮, 蔣小松, 杜華銳, 楊朝武, 李晴云, 李雯, 邱莫寒, 宋小燕, 胡陳明, 夏波 申請人:四川省畜牧科學(xué)研究院