利用rt-lamp快速檢測甘蔗花葉病毒的方法
【專利摘要】一種利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，包括如下步驟：根據(jù)NCBI上提供的甘蔗花葉病毒的序列設(shè)計(jì)4條LAMP特異引物F3、B3、FIP、BIP，樣品提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，通過對反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，在一個(gè)恒溫水浴鍋反應(yīng)1h可以完成擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過電泳或者熒光染料實(shí)現(xiàn)檢測，是一種操作簡單、快速、靈敏而經(jīng)濟(jì)的檢測方法。
【專利說明】利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，具體是一種利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法。
技術(shù)背景
[0002]甘鹿花葉病毒(Sorghum mosaic virus)是甘鹿的一種主要病毒病,屬于馬鈴薯Y病毒屬的甘蔗花葉病毒亞組成員。甘蔗花葉病的癥狀主要表現(xiàn)在葉片上。但染病蔗株可使整叢發(fā)病，病毒遍及全株。主要是葉綠素受到破壞或不正常發(fā)展而使葉部產(chǎn)生許多與葉脈平行的縱短條紋。其長短不一，有的淺黃色、有的淺綠色，與正常部分參差間隔成“花葉”。尤以新葉癥狀最為明顯。染病蔗株矮化，分蘗減少；宿根病蔗則發(fā)芽緩慢、生長不良。本病造成的損失主要是蔗種感病后，萌芽率低；病株生長差，汁液量減少。
[0003]環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是由Notomi T等在2000年發(fā)明的，是一種基于高靈敏鏈置換技術(shù)的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件^1_65°C左右)下保溫幾十分鐘，即可實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)果可通過反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的形成進(jìn)行肉眼觀察，或者通過濁度儀檢測焦磷酸鎂白色沉淀的混濁度來判定，也可在反應(yīng)管中加入熒光染色試劑目測判定，無需特殊的儀器PCR儀，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是一種快捷而有效的檢測方法。目前已廣泛的應(yīng)用于人類和動植物各種病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷。
[0004]目前鑒定植物病毒常用的方法有:生物學(xué)接種實(shí)驗(yàn)，血清學(xué)檢測，電鏡觀察及分子生物學(xué)檢測。其中分子生物學(xué)方法以PCR最為常見，但是PCR費(fèi)時(shí)且需要昂貴的儀器PCR儀；而血清學(xué)檢測方法中，較為常見的有ELISA及DIBA等，但是靈敏度不夠高，特異性易受到限制。目前尚未見到使用LAMP方法檢測甘蔗花葉病毒的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，能夠靈敏、特異的檢測出甘蔗花葉病毒。
[0006]為解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，包括如下步驟:
[0007]I)根據(jù)NCBI已報(bào)道的甘蔗花葉病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通過多序列比對選擇相對保守序列，通過在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件primerExplorer V4設(shè)計(jì)4條引物,其中包括2條外引物F3/B3和2條內(nèi)引物FIP/BIP ；
[0008]2)利用RNAiso Plus法提取甘蔗植株的總RNA ；
[0009]3 )利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶把提取的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA ；
[0010]4)設(shè)置不同的Mg2+濃度、dNTPs的濃度以及甜菜堿的濃度，確定最佳反應(yīng)體系；分別改變反應(yīng)的溫度進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，RT-LAMP反應(yīng)溫度為63°C，反應(yīng)時(shí)間為60_80min ；
[0011]5) RT-LAMP反應(yīng)體系為:外引物F3和B3各0.25 μ M，內(nèi)引物FIP和BIP各
1.5 μ M，Bst DNA 聚合酶(8U) I μ L, IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜堿 2 μ L，25mM MgS041 μ L,dNTPl.4mM，模版2μ L，DEPC處理的滅菌水加至25 μ L，63°C條件下反應(yīng)時(shí)間為60min，80°C滅活5min ;以未感染樣品作為陰性對照驗(yàn)證這一方法的特異性；
[0012]6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過肉眼判斷和利用1.5%的電泳檢測進(jìn)行驗(yàn)證或者熒光染料檢測可以檢測出甘蔗花葉病毒。
[0013]所述2條外引物F3/B3和2條內(nèi)引物FIP/BIP的序列為:
[0014]F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3
[0015]B3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3
[0016]FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTA
[0017]TTGAAAACG-3
[0018]BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTT
[0019]CGC-3。
[0020]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在 于:
[0021]利用LAMP方法既保證了檢測的靈敏性和特異性，同時(shí)又簡化了操作，并且也節(jié)省了成本，為甘蔗花葉病毒的檢測提供了一種靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)且簡單的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為不同溫度條件下RT-LAMP結(jié)果的電泳圖(M:標(biāo)準(zhǔn)分子量；1、61°C ;2、62°C ；
3、63°C ;4、64°C ;5、65°C ；6 陰性對照)。；
[0023]圖2為電泳檢測甘蔗花葉病毒的結(jié)果(Μ:標(biāo)準(zhǔn)分子量；1、甘蔗花葉病毒；2、陰性對照)【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1
[0025]本發(fā)明所述的利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，包括如下步驟:
[0026]甘蔗花葉病毒RT-LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0027]1、引物的設(shè)計(jì):
[0028]F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3
[0029]Β3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3
[0030]FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTATTGAA
[0031]AACG-3
[0032]BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTTCGC-3
[0033]甘蔗花葉病毒RT-LAMP的溫度梯度實(shí)驗(yàn)
[0034]RT-LAMP反應(yīng)體系為:外引物F3和Β3各0.25 μ Μ,內(nèi)引物FIP和BIP各1.5 μ M，BstDNA聚合酶(8U)1 μ L, IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜堿2 μ L，25mM MgS041 μ L, dNTPl.4mM，模版2μ L，DEPC處理的滅菌水加至25 μ L。混勻反應(yīng)物在61°C，62 °C, 63 °C，64°C，65°C五種條件下恒溫反應(yīng)lh，80°C反應(yīng)5min終止RT-LAMP反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后取10 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，在1.5%的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示在61 °C、62°C，63°C恒溫反應(yīng)條件下有階梯狀擴(kuò)增條帶，但是63°C條帶很清晰，而64°C、65°C恒溫反應(yīng)以及陰性對照無階梯狀擴(kuò)增條帶，如圖1所示，因此，本發(fā)明采用的RT-LAMP的反應(yīng)溫度為63°C。
[0035]實(shí)施例2
[0036]甘蔗花葉病毒RT-LAMP反應(yīng)的特異性試驗(yàn)
[0037]為了驗(yàn)證RT-LAMP的特異性，選擇未感染甘蔗花葉病毒的材料作為對照，結(jié)果顯示陰性對照沒有出現(xiàn)階梯狀擴(kuò)增條帶，而有甘蔗花葉病毒的樣本擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，如圖2所示，這表明該RT-LAMP反應(yīng)的特異性`較好。
【權(quán)利要求】
1.利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)根據(jù)NCBI已報(bào)道的甘蔗花葉病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通過多序列比對選擇相對保守序列，通過在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件primerExplorer V4設(shè)計(jì)4條引物,其中包括2條外引物F3/B3和2條內(nèi)引物FIP/BIP ； 2)利用RNAisoPlus法提取甘蔗植株的總RNA ； 3)利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶把提取的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA； 4)設(shè)置不同的Mg2+濃度、dNTPs的濃度以及甜菜堿的濃度，確定最佳反應(yīng)體系；分別改變反應(yīng)的溫度進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，RT-LAMP反應(yīng)溫度為63°C，反應(yīng)時(shí)間為60_80min ； 5)RT-LAMP反應(yīng)體系為:外引物F3和B3各0.25 μ M,內(nèi)引物FIP和BIP各1.5 μ M，BstDNA 聚合酶(8U) I μ L，IOXBst buffer2.5 μ L，甜菜堿 2 μ L，25mM MgS041 μ L，dNTPl.4mM,模版2μ L，DEPC處理的滅菌水加至25μ L，63°C條件下反應(yīng)時(shí)間為60min，80°C滅活5min ；以未感染樣品作為陰性對照驗(yàn)證這一方法的特異性； 6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過肉眼判斷和利用1.5%的電泳檢測進(jìn)行驗(yàn)證或者熒光染料檢測可以檢測出甘蔗花葉病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用RT-LAMP快速檢測甘蔗花葉病毒的方法，其特征在于，所述2條外引物F3/B3和2條內(nèi)引物FIP/BIP的序列為:
F3:5-TGGAYGGAGATGAACAAAGA-3
B3:5-AATGCATACCGCGCTAAG-3
FIP:5-GCTGCATCACTGAAATGATGCATTA-CCRTTAAAACCAGTTA
TTGAAAACG-3
BIP:5-TCGAGTAYAGAAACTCTACAGAGCG-TATAGTCGGTGAGATTT
CGC-3。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484569SQ201310438344
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】溫榮輝, 陳保善, 司慧娟, 呂榜麗, 周龍武, 徐正贏, 袁小寧, 唐瑤 申請人:廣西大學(xué)