一種雙層平板及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙層平板及其制備方法。利用嗜酸酵母(Candida?digboiensisZBY)，保藏編號:CCTCC?NO:M2013311制作雙層平板中的底層培養(yǎng)基，篩選自養(yǎng)浸礦微生物。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明極大地提高了浸礦微生物分離篩選的效率，同時也為研究浸礦微生物遺傳和代謝提供了一條可行的途徑。
【專利說明】一種雙層平板及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于浸礦微生物篩選的產(chǎn)品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于浸礦微生物篩選的雙層平板及其制備方法，和菌株?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]生物冶金利用微生物氧化硫化礦等礦物中的鐵和硫，使結(jié)合在礦石中的有價金屬釋放到溶液中以利于進一步提取。浸礦微生物主要包括自養(yǎng)的鐵氧化菌和硫氧化菌，它們利用硫化礦中的Fe2 +或者還原型的硫化物(如黃鐵礦Fe2S)作為能源生長，產(chǎn)生硫酸促進硫化礦的浸出，因此，篩選出高效浸礦微生物是生物冶金的關(guān)鍵。
[0003]固體培養(yǎng)基通常用于浸礦微生物的分離和培養(yǎng)，然而浸礦微生物主要是自養(yǎng)菌，瓊脂等凝固劑中的有機物質(zhì)及其水解產(chǎn)物對浸礦微生物生長有抑制作用，酸性的固體培養(yǎng)基難以制作，所以浸礦微生物通常難以在固體平板上產(chǎn)生大量有特色的菌落供菌株篩選、選育及遺傳特性研究。因此，高活性的浸礦微生物菌種資源缺乏，浸礦機理不明，導(dǎo)致生物浸出技術(shù)浸出速率慢，限制其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。
[0004]為提高浸礦微生物檢出率并縮短培養(yǎng)周期，雙層平板方法發(fā)明并用于該類微生物的分離篩選。雙層平板中采用底層涂布嗜酸的(Candida digboiensis sp.)等異養(yǎng)菌以除去培養(yǎng)基中的有毒有機物質(zhì)，上層用于化能自養(yǎng)菌的篩選。雙層平板中的培養(yǎng)基成分也不斷改進，但目前該方法仍存在很大挑戰(zhàn)。
[0005]本發(fā)明篩選了一種嗜酸酵母，利用其設(shè)計了一種新型的分離純化極端浸礦菌的雙層平板，該酵母菌除去培養(yǎng)基中的有毒有機物質(zhì)的作用明顯，成功的實現(xiàn)了浸礦菌的固體平板培養(yǎng)及純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是通過篩選酸性浸礦體系中的嗜酸酵母，提供一種利用該菌建立的快速篩選浸礦微生物的雙層平板及其制備方法，以豐富浸礦微生物資源，成功的實現(xiàn)浸礦菌的固體平板培養(yǎng)及純化。
[0007]一種雙層平板，是在雙層培養(yǎng)基平板的底層平板中接種有嗜酸酵母(CandidadigboiensisZBY),所述的嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的保藏編號為:CCTCC NO:M2013311。
[0008]所述的雙層平板的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0009]I)挑選嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)單菌落置于含lwt%的葡萄糖和
0.025wt%的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)的5mL9k液體培養(yǎng)基中活化至菌液濃度達到IO9個/mL以上，取占體積比10%的活化好的培養(yǎng)液加入含1%葡萄糖的9K液體培養(yǎng)基中，得到酵母菌培養(yǎng)液；
[0010]2)分別配制以下三種溶液:(a)pH=2.0的2X9K液體培養(yǎng)基(即培養(yǎng)基中，每種成分的濃度均為2倍)，(b)pH=2.0的250mM的硫酸亞鐵溶液，其中含IOmM K2S4O6 ； (c)pH=4.5的3wt%瓊脂糖溶液；50°C時將(a) (b) (c)三種溶液按體積比4:1:5混合，制備成分離和純化用培養(yǎng)基2份；
[0011]3)其中1份立即接種步驟I)得到的酵母菌培養(yǎng)液，接種量為培養(yǎng)基體積比的1%，然后傾倒在無菌培養(yǎng)皿中形成凝膠，另一份保溫，當培養(yǎng)皿內(nèi)的凝膠凝固，再倒入第二份無酵母的培養(yǎng)基，制成雙層平板。
[0012]所述的酵母菌為嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY),保藏編號為:CCTCC NO:M2013311。保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期:2013年7月2日。
[0013]本發(fā)明篩選了一種嗜酸酵母，利用其設(shè)計了一種新型的分離純化極端浸礦菌的雙層平板，該酵母菌除去培養(yǎng)基中的有毒有機物質(zhì)的作用明顯，成功的實現(xiàn)了浸礦菌的固體平板培養(yǎng)及純化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1 為酵母(Candida digboiensisZBY)顯微形態(tài)；
[0015]圖2為本發(fā)明利用酵母(Candida digboiensisZBY)制作的雙層平板；
[0016]圖3為本發(fā)明雙 層平板篩選的浸礦微生物菌落形態(tài)和掃描電子顯微鏡照片(SEM)圖像；
[0017](a)底層接種酵母，上層接種浸礦微生物的雙層平板；
[0018](b) Zl 菌的 SEM 圖像；
[0019](c) Z2 菌的 SEM 圖像。
【具體實施方式】
[0020]以下結(jié)合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0021]實施例1嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的分離篩選和鑒定:
[0022]采集酸性礦坑水10mL，用含1%葡萄糖的9K液體培養(yǎng)基90mL富集培養(yǎng)，9K培養(yǎng)基成分為(g/L): (NH4)2S043.0, KC10.1, K2HPO40.5，MgSO4.7Η200.5，Ca(NO3)20.01，H2OlOOOmL,ρΗ=2.5，培養(yǎng)溫度35°C，轉(zhuǎn)速200rpm。2天后，當菌液濃度達到IO9個/mL時，取IOmL培養(yǎng)液于90mL新鮮的9K液體培養(yǎng)基(含1%葡萄糖)中富集培養(yǎng)，此過程重復(fù)四次。
[0023]酸性浸礦體系中異養(yǎng)微生物分離純化采用單層平板。將pH=2.0的2X9K液體培養(yǎng)基和pH=4.5的3%瓊脂糖溶液在121°C高溫滅菌30min后按1:1混合，加入過濾滅菌的1%葡萄糖和0.025%TSB，調(diào)pH值為2.5，冷卻至50°C后倒入無菌培養(yǎng)皿中；將上述富集的培養(yǎng)液稀釋涂布平板，35°C中培養(yǎng)；挑取單菌落在同樣的瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)。此過程重復(fù)四次，得到酵母的純培養(yǎng)。
[0024]含1%葡萄糖的9K平板上生長的酵母(Candida digboiensisZBY)，菌落乳白色，菌落平整，表面與邊緣平整；用普通光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)分離物細胞呈卵圓形，出芽生殖，有子囊孢子形成(圖1)。提取嗜酸酵母基因組DNA，擴增18S rDNA序列，結(jié)合形態(tài)特征、18SrDNA基因序列鑒定為酵母(Candida digboiensisZBY)。菌種由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號:CCTCC N0:M2013311。
[0025]實施例2利用嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)制作雙層平板[0026]挑選酵母單菌落于5mL含葡萄糖(1%)和TSB (0.025%)的9k液體培養(yǎng)基中活化至菌液濃度達到IO9個/mL時，取5mL培養(yǎng)液于45mL新鮮的9K液體培養(yǎng)基(含1%葡萄糖)中，使其具有良好的活性。[0027]分別配制以下三種溶液用于雙層平板的制作:(a)pH=2.0的2X9K培養(yǎng)基，121°C高溫滅菌30分鐘；(b)pH=2.0的250mM硫酸亞鐵溶液(含K2S4O6IOmM), 0.2 μ m的尼龍膜過濾；(c)pH=4.5的3%瓊脂糖溶液，121°C高溫滅菌30分鐘。50°C時將(a) (b) (c)三種溶液按體積比4:1:5混合，制備分離和純化用固體培養(yǎng)基2份，其中1份立即接種活化好的酵母(接種量1%)，然后傾倒在無菌培養(yǎng)皿中形成薄的凝膠；另一份50°C保溫，當培養(yǎng)皿內(nèi)的凝膠凝固，再倒入第二份無酵母的培養(yǎng)液，待其凝固。制成雙層平板(如圖2所示)。
[0028]實施例3利用雙層平板篩選浸礦微生物:
[0029]取IOmL酸性礦坑水至90ml含有250mM硫酸亞鐵的9K培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，選取待分離菌種的最適的pH值和溫度,置于轉(zhuǎn)速為200rpm/min的搖床上培養(yǎng)。當溶液變紅，取IOml的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到90ml新鮮的上述同種培養(yǎng)基中繼續(xù)富集培養(yǎng)，此過程重復(fù)四次。將富集培養(yǎng)液稀釋，并涂布于實施例2制備的雙層平板上,置于適宜的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑選菌落在瓊脂平板上劃線分離，適宜條件下再培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)。
[0030]在未接種的培養(yǎng)皿中，只有酵母菌菌落在底層培養(yǎng)基中出現(xiàn)。在上層接種富集物的培養(yǎng)皿中，出現(xiàn)了酵母菌和鐵氧化菌的菌落(圖3a所示)。根據(jù)微生物的形態(tài)特征，在上層分離和純化出兩種浸礦細菌，分別命名為Zl和Z2。在雙層瓊脂平板中兩種菌落都在一周內(nèi)出現(xiàn)，它們覆蓋上層培養(yǎng)基的表面，使培養(yǎng)皿變紅，Zl鐵氧化的速度較Z2快。Zl菌在雙層平板上檢出的時間比單層平板提早5d，檢出菌落數(shù)約800個，檢出率比單層平板提高25倍，比現(xiàn)有雙層平板提高2倍。
[0031]通過SEM (掃描電子顯微鏡)觀察到新菌株的形態(tài)(圖3所示)。Zl為桿狀細菌，直徑為0.40-0.70 μ m，長1.00-2.50 μ m ;而Z2細胞呈弧形，直徑為0.25-0.50 μ m，長
0.80-2.15 μ m。光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)，Z2運動性較Zl強。Zl和Z2的形態(tài)特征與氧化亞鐵硫桿菌和鉤端螺旋菌屬相似。16S rDNA序列分析表明，Zl和Z2分別屬于氧化亞鐵硫桿菌和鉤端螺旋菌屬。
【權(quán)利要求】
1.一種雙層平板，其特征在于，是在雙層培養(yǎng)基平板的底層平板中接種有嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY),所述的嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的保藏編號為:CCTCC NO:M2013311o
2.權(quán)利要求1所述的雙層平板的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)挑選嗜酸酵母(CandidadigboiensisZBY)單菌落置于含lwt%的葡萄糖和0.025wt%的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基的5mL9k液體培養(yǎng)基中活化至菌液濃度達到IO9個/mL以上，取占體積比10%的活化好的培養(yǎng)液加入含1%葡萄糖的9K液體培養(yǎng)基中，得到酵母菌培養(yǎng)液； 2)分別配制以下三種溶液:(a)pH=2.0的2X9K液體培養(yǎng)基，(b)pH=2.0的250mM的硫酸亞鐵溶液，其中含IOmM K2S4O6 ； (c)pH=4.5的3wt%瓊脂糖溶液;50°C時將(a) (b) (c)三種溶液按體積比4:1:5混合，制備成分離和純化用培養(yǎng)基2份； 3)其中1份立即接種步驟I)得到的酵母菌培養(yǎng)液，接種量為培養(yǎng)基體積比的1%，然后傾倒在無菌培養(yǎng)皿中形成凝膠，另一份保溫，當培養(yǎng)皿內(nèi)的凝膠凝固，再倒入第二份無酵母的培養(yǎng)基，制成雙層平板。
3.—種酵母菌,其特征在于,所述的酵母菌為嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY),保藏編號為:CCTCC NO :M2013311o
【文檔編號】C12N1/16GK103540519SQ201310441319
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】劉學(xué)端, 梁伊麗, 尹華群, 恩剛姆, 胡琪, 馬麗媛, 肖云花, 邱冠周 申請人:中南大學(xué)