一種紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的新型培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，其一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。本發(fā)明通過采用甘蔗糖蜜替代葡萄糖；啤酒酵母干渣和蚯蚓粉代替黃豆粉、蛋白胨、花生餅粉和玉米漿，優(yōu)化其培養(yǎng)基配方，從而解決了原輔料的成本問題，并且最大限度的降低原輔料來源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)紅霉素穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)。同時(shí)利用該培養(yǎng)基可提高發(fā)酵單位、縮短發(fā)酵周期、提高紅霉素A組分。
【專利說明】一種紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，抗菌譜與青霉素相似。
[0003]目前，國內(nèi)生產(chǎn)廠家使用紅色鏈霉素，采用三級發(fā)酵的模式生產(chǎn)紅霉素。其種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基主要采用淀粉和葡萄糖作為碳源；豆餅粉、花生餅粉、玉米漿或蛋白胨作為氮源，使用常規(guī)原輔料發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素存在的主要問題:
[0004]I發(fā)酵成本高。采用該配方，其原輔料的消耗占到生產(chǎn)成本的65%左右。
[0005]2增加企業(yè)的采購成本。紅霉素種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基氮源組成至少在3種以上，增加了企業(yè)的采購工作量和采購成本。
[0006]3 一級種子培養(yǎng)的接種量較大。國內(nèi)部分廠家的紅霉素生產(chǎn)規(guī)?？梢赃_(dá)到萬噸/年，其一級種子培養(yǎng)發(fā)酵罐的體積超過了 5m3，常規(guī)配方的一級種子培養(yǎng)接種量為1.5~2L/M3，增加了菌種研究人員的工作強(qiáng)度和工作量。
[0007]4種子培養(yǎng)的周期長。常規(guī)配方的紅霉素種子培養(yǎng)周期為35~40h。
[0008]5紅霉素發(fā)酵單 位較低。使用常規(guī)原輔料的培養(yǎng)基，紅霉素的發(fā)酵單位一般在8000 ~9000u/ml。
[0009]6常規(guī)培養(yǎng)基在滅菌過程中，部分葡萄糖在高溫狀態(tài)容易碳化，使種子液和發(fā)酵液的顏色變深，降低培養(yǎng)基質(zhì)量，影響種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的效果。
[0010]7紅霉素A組分偏低。使用常規(guī)原輔料的培養(yǎng)基，紅霉素A的組分一般控制在
62 ~68%ο
[0011 ] 8)發(fā)酵過程中，還需補(bǔ)入氨基酸。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液中的氨基酸含量降低，需要補(bǔ)入氨基酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種減少接種量，有效提高發(fā)酵單位，縮短發(fā)酵周期，同時(shí)最大限度的降低原輔料用量，降低生產(chǎn)成本，且原輔料來源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)紅霉素穩(wěn)定、高效地生產(chǎn)的培養(yǎng)基。
[0013]本發(fā)明的另一目的是提供利用上述培養(yǎng)基生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)方法。
[0014]為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為:
[0015]一種紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基，包括一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于上述一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。
[0016]所述一級種子培養(yǎng)基的組成為:甘蔗糖蜜15~20g/L、油5~10ml/L、啤酒酵母干渣20~25g/L、蚯蚓粉8~12g/L、硫酸銨0.03~0.05g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質(zhì)碳酸鈣(λ 2~0.4g/L、硅油消泡劑0.01~0.03g/L。
[0017]所述二級種子培養(yǎng)基的組成為:甘蔗糖蜜25~30g/L、油12~16ml/L、啤酒酵母干渣25~30g/L、蚯蚓粉11~17g/L、硫酸銨0.06~0.08g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質(zhì)碳酸鈣0.4~0.6g/L、硅油消泡劑0.02~0.04g/L。
[0018]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:甘蔗糖蜜25~35g/L、油10~15ml/L、啤酒酵母干渣30~35g/L、蚯蚓粉15~20g/L、硫酸銨0.07~0.09g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質(zhì)碳酸鈣0.4~0.6g/L、S-腺苷甲硫氨酸I~5g/L、氯化鈷0.006~0.008g/L硫酸鎂0.04~0.05g/L、硫酸鋅0.03~0.05g/L、硫酸銅0.06~0.08g/L、硅油消泡劑0.02~0.03g/L。
[0019]所述啤酒酵母干渣的質(zhì)量要求為:
[0020]蛋白質(zhì)含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分≥5% ;灰分≥5% ;碳水化合物≥12% ；干渣顆粒通過60目篩的數(shù)量≥80%。
[0021]所述蚯蚓粉的質(zhì)量要求:蛋白質(zhì)含量≥60% ;水分≤10% ;粒度能通過80目篩。
[0022]所述甘蔗糖蜜在使用前進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理過程為:
[0023]I)甘蔗糖蜜中加入飲用水，使其粘度控制在IOOcp以下；
[0024]2 )加熱升溫至30~35 °C，
[0025]3)超濾，超濾膜材料為醋酸纖維素或聚氧乙烯，超濾過程中，物料的流量控制在4~5L/min，超濾壓力控制在0.2MPa
[0026]4)加入蔗糖轉(zhuǎn)化酶，蔗糖轉(zhuǎn)化酶用量(g)=蔗糖甜蜜重量(kg) X0.35。
[0027]—種紅霉素鏈霉菌利用上述一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)方法，其特征在于其工藝步驟為:首先將已經(jīng)培養(yǎng)好的紅霉素鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照0.8~lL/m3接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進(jìn)行一級種子培養(yǎng)，至菌體濃度35~40%、pH值7~8、培養(yǎng)周期為20~25h時(shí)轉(zhuǎn)移到二級種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度35~40%、pH值7~8、培養(yǎng)周期為22~27h時(shí)轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至發(fā)酵單位在11000u/ml以上且每6~8h檢測的發(fā)酵單位相差300u/ml以內(nèi)、菌體濃度35~40%、發(fā)酵周期為150~160h、pH值6~8、氨基氮5~10mg/100ml、總糖O~5g/100ml時(shí)終止發(fā)酵。
[0028]所述一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在使用前首先進(jìn)行滅菌，其中
[0029]滅菌后的一級種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>50ug/ml、總糖 30 ~40g/100ml、ρΗ6.5 ~7.5 ;
[0030]滅菌后的二級種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮60~70mg/100ml、溶磷>50ug/ml、總糖 30 ~40g/100ml、pH:6.5 ~7.5 ;
[0031]滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>60ug/ml、總糖40 ~50g/100ml、pH:6 ~7。
[0032]所述一級種子培養(yǎng)條件為:
[0033]1)罐壓:控制在 0.04 ~0.06MPa,
[0034]2)罐溫:發(fā)酵前5h，罐溫控制在31~32°C ；6h至一級種子培養(yǎng)結(jié)束，罐溫控制在33 ~34°C，
[0035]3)空氣流量:0~5h，100~150m3/h ；6h至一級種子培養(yǎng)結(jié)束:200~250m3/h，[0036]4) pH:控制在 7 ~8，
[0037]5)攪拌轉(zhuǎn)速:0~5h,采用氣流攪拌；6h至一級種子培養(yǎng)結(jié)束:采用機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速控制在110r/min。
[0038]所述二級種子培養(yǎng)條件為:
[0039]1)罐壓:控制在 0.04 ~0.06MPa,
[0040]2)罐溫:發(fā)酵前5h，罐溫控制在31~32°C ；6h至二級種子培養(yǎng)結(jié)束，罐溫控制在33 ~34°C，
[0041]3)空氣流量:0~5h，300~350m3/h ；6h至二級種子培養(yǎng)結(jié)束:350~400m3/h，
[0042]4) pH:控制在 7 ~8，
[0043]5)攪拌轉(zhuǎn)速:0~5h,采用氣流攪拌；6h至一級種子培養(yǎng)結(jié)束:采用機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速控制在100r/min。
[0044]所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
[0045]I) pH控制:控制在6~8 ;
[0046]2)無菌檢查:發(fā)酵過程中進(jìn)行菌檢，要求無其它雜菌；
[0047]3)空氣流量:0 ~15h: 1000mVh ；16h ~發(fā)酵結(jié)束:800m3/h ；
[0048]4)溶氧控制:
[0049]O~30h:溶氧濃度不得低于60% ；
[0050]31~120h:溶氧濃度控制在30~50% ；
[0051]12 Ih~放罐:溶氧濃度控制在40%以上；
[0052]5)攪拌轉(zhuǎn)速:
[0053]O ~30h:攬祥轉(zhuǎn)速 80 ~90r/min ；
[0054]31 ~120h:攪拌轉(zhuǎn)速 100 ~110r/min ；
[0055]12 Ih~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速70~80r/min ；
[0056]6)培養(yǎng)溫度:
[0057]O ~30h:34 ~35.(TC ；
[0058]31 ~IOOh:32 ~33°C ；
[0059]IOlh ~放罐:30 ~31?。
[0060]7)罐壓:罐壓控制在0.04~0.06MPa。
[0061]在發(fā)酵過程中進(jìn)行補(bǔ)料，包括補(bǔ)糖、補(bǔ)水、補(bǔ)入正丙醇和補(bǔ)油，其中
[0062]I)補(bǔ)糖控制:當(dāng)pH > 7.3時(shí)，采用流加法，補(bǔ)入粘度在500~600cp的甘蔗糖蜜溶液，當(dāng)pH達(dá)到6.9時(shí)，停止補(bǔ)料；
[0063]2)補(bǔ)水:
[0064]120h之前，當(dāng)菌體濃度超過40%，采用流加法補(bǔ)入飲用水，控制其菌體濃度在35~40%,
[0065]120h至發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)菌體濃度超過35%，補(bǔ)入飲用水，控制其菌體濃度在30~35% ；
[0066]3)補(bǔ)入正丙醇:發(fā)酵周期在30h、50h、90h、110h、130h分別加入已滅菌的正丙醇，其加入量為發(fā)酵液體積的0.1~0.2%;
[0067]4)補(bǔ)油:采用流加法補(bǔ)油，發(fā)酵至15h開始補(bǔ)豆油，具體控制如下:[0068]10 ~80h:15 ~20L/h ；
[0069]81 ~120h:30 ~35L/h ；
[0070]121h~放罐:不補(bǔ)油。
[0071]上述油可以是豆油、玉米油或菜籽油。
[0072]本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢為:
[0073]I)發(fā)酵成本低。首先啤酒酵母干渣、蚯蚓粉由于產(chǎn)量較大，市場價(jià)格較低，便于采購，其次使用啤酒酵母干渣、蚯蚓粉代替了常規(guī)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，減少了氮源的用量，降低了采購和生產(chǎn)成本，減少因原料質(zhì)量影響種子液和發(fā)酵液質(zhì)量的不利因素。
[0074]2)蛋白質(zhì)和氨基酸含量較高，本發(fā)明培養(yǎng)基中的的總生物素含量高于常規(guī)培養(yǎng)基。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，紅霉素發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)和氨基酸對其產(chǎn)量和組分影響較大，本發(fā)明培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量達(dá)到55%以上，氨基酸含量明顯高于常規(guī)種子培養(yǎng)基配方，有利于改善紅霉素鏈霉菌菌絲形態(tài)；提高種子培養(yǎng)的質(zhì)量。
[0075]不同原輔料的氨基氮含量對比表
[0076]
【權(quán)利要求】
1.一種紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基，包括一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于上述一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。
2.按照權(quán)利要求1所述的紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基，其特征在于所述一級種子培養(yǎng)基的組成為:甘鹿糖蜜15~20g/L、油5~10ml/L、啤酒酵母干洛20~25g/L、蚯蚓粉8~12g/L、硫酸銨0.03~0.05g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質(zhì)碳酸鈣0.2~0.4g/L、硅油消泡劑0.01~0.03g/L。
3.按照權(quán)利要求1所述的紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基，其特征在于所述二級種子培養(yǎng)基的組成為:甘鹿糖蜜25~30g/L、油12~16ml/L、啤酒酵母干洛25~30g/L、蚯蚓粉11~17g/L、硫酸銨0.06~0.08g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質(zhì)碳酸鈣0.4~0.6g/L、硅油消泡劑0.02~0.04g/L。
4.按照權(quán)利要求1所述的紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:甘鹿糖蜜25~35g/L、油10~15ml/L、啤酒酵母干洛30~35g/L、蟲丘蚓粉15~20g/L、硫酸銨0.07~0.09g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質(zhì)碳酸鈣0.4~0.6g/L、S-腺苷甲硫氨酸I~5g/L、氯化鈷0.006~0.008g/L 硫酸鎂0.04~0.05g/L、硫酸鋅0.03 ~0.05g/L、硫酸銅 0.06 ~0.08g/L、硅油消泡劑 0.02 ~0.03g/L。
5.按照權(quán)利要求1、2、3或4所述的紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基，其特征在于所述啤酒酵母干渣的質(zhì)量要求為: 蛋白質(zhì)含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分≤ 5% ;灰分≤5% ;碳水化合物≥12% ;干渣顆粒通過60目篩的數(shù)量> 80%ο
6.按照權(quán)利要求1、2、3或4所述的紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基，其特征在于所述蚯蚓粉的質(zhì)量要求:蛋白質(zhì)含量> 60% ;水分< 10% ;粒度能通過80目篩。
7.按照權(quán)利要求1、2、3或4所述的紅霉素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)基，其特征在于所述甘蔗糖蜜在使用前進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理過程為: O甘蔗糖蜜中加入飲用水，使其粘度控制在IOOcp以下； 2)加熱升溫至30~35°C， 3)超濾，超濾膜材料為醋酸纖維素或聚氧乙烯，超濾過程中，物料的流量控制在4~5L/min，超濾壓力控制在0.2MPa 4)加入蔗糖轉(zhuǎn)化酶，蔗糖轉(zhuǎn)化酶用量(g)=蔗糖甜蜜重量(kg)X0.35。
8.—種紅霉素鏈霉菌利用權(quán)利要求2-4任意一項(xiàng)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的培養(yǎng)方法，其特征在于其工藝步驟為:首先將已經(jīng)培養(yǎng)好的紅霉素鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照0.8~IL/m3接種量接入一級種子培養(yǎng)基中進(jìn)行一級種子培養(yǎng)，至菌體濃度35~40%、pH值7~8、培養(yǎng)周期為20~25h時(shí)轉(zhuǎn)移到二級種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二級種子培養(yǎng)，至菌體濃度35~40%、pH值7~8、培養(yǎng)周期為22~27h時(shí)轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至發(fā)酵單位在11000u/ml以上且每6~8h檢測的發(fā)酵單位相差300u/ml以內(nèi)、菌體濃度35~40%、發(fā)酵周期為150~160h時(shí)終止發(fā)酵。
9.按照權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在使用前首先進(jìn)行滅菌，其中 滅菌后的一級種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷> 50ug/ml、總糖.30 ~40g/100ml、pH6.5 ~7.5 ; 滅菌后的二級種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮60~70mg/100ml、溶磷> 50ug/ml、總糖.30 ~40g/100ml、pH:6.5 ~7.5 ; 滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷> 60ug/ml、總糖.40 ~50g/100ml、pH:6 ~7。
10.按照權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述一級種子培養(yǎng)條件為: 1)罐壓:控制在0.04~0.06MPa, 2)罐溫:發(fā)酵前5h，罐溫控制在31~32°C；6h至一級種子培養(yǎng)結(jié)束，罐溫控制在33~.34℃， .3)空氣流量:0~5h，100~150m3/h；6h至一級種子培養(yǎng)結(jié)束:200~250m3/h， .4)pH:控制在7~8， 5)攪拌轉(zhuǎn)速:0~5h,采用氣流攪拌；6h至一級種子培養(yǎng)結(jié)束:采用機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速控制在 110r/min。
11.按照權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述二級種子培養(yǎng)條件為: . 1)罐壓:控制在0.04~0.06MPa, .2)罐溫:發(fā)酵前5h，罐溫控制在31~32°C；6h至二級種子培養(yǎng)結(jié)束，罐溫控制在33~34℃， .3)空氣流量:0~5h，300~350m3/h；6 h至二級種子培養(yǎng)結(jié)束:350~400m3/h， . 4)pH:控制在7~8，. 5)攪拌轉(zhuǎn)速:0~5h,采用氣流攪拌；6h至一級種子培養(yǎng)結(jié)束:采用機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速控制在 100r/min。
12.按照權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為: .1)pH控制:控制在6~8 ; . 2)無菌檢查:發(fā)酵過程中進(jìn)行菌檢，要求無其它雜菌； .3)空氣流量:0~15h: 1000mVh ；16h~發(fā)酵結(jié)束:800m3/h ； .4)溶氧控制: . O~30h:溶氧濃度不得低于60% ； . 31~120h:溶氧濃度控制在30~50% ； . 12 Ih~放罐:溶氧濃度控制在40%以上； 攪拌轉(zhuǎn)速: O~30h:攪拌轉(zhuǎn)速80~90r/min ； 31 ~120h:攪拌轉(zhuǎn)速 100 ~110r/min ； 121h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速70~80r/min ； 6)培養(yǎng)溫度:
O ~30h:34 ~35.0°C ；
31 ~IOOh:32 ~33°C ； IOlh~放罐:30~31°C ； 7)罐壓:罐壓控制在0.04~0.06MPa。
13.按照權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于在發(fā)酵過程中進(jìn)行補(bǔ)料，包括補(bǔ)糖、補(bǔ)水、補(bǔ)入正丙醇和補(bǔ)油，其中 1)補(bǔ)糖控制:當(dāng)pH> 7.3時(shí)，采用流加法，補(bǔ)入粘度在500~600cp的甘蔗糖蜜溶液，當(dāng)pH達(dá)到6.9時(shí)，停止補(bǔ)料； 2)補(bǔ)水: 120h之前，當(dāng)菌體濃度超過40%，采用流加法補(bǔ)入飲用水，控制其菌體濃度在35~40% ； ，120h至發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)菌體濃度超過35%，補(bǔ)入飲用水，控制其菌體濃度在30~35% ； 3)補(bǔ)入正丙醇:發(fā)酵周期在30h、50h、90h、110h、130h分別加入已滅菌的正丙醇，其加入量為發(fā)酵液體積的0.1~0.2%; 4)補(bǔ)油:采用流加法補(bǔ)油，發(fā)酵至15h開始補(bǔ)豆油，具體控制如下:
，15 ~80h:15 ~20L/h ；
，81 ~120h:30 ~35L/h ；
，121h~放罐:不補(bǔ)油。
【文檔編號】C12R1/465GK103484515SQ201310441432
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】任勇, 奇乃, 王忠中 申請人:寧夏泰瑞制藥股份有限公司