一種維生素c混合菌的保藏方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種維生素C混合菌的保藏方法，該方法將大、小菌搭配培養(yǎng)的維生素C混合菌種之斜面，用體積濃度為50%的甘油制備成懸浮液，再封裝于無菌凍存管中，置于-70±2℃溫度下保存。采用本發(fā)明方法保藏的VC二步菌菌種，其菌種死亡率在1%以下，變異率為零，其菌種的特性和穩(wěn)定性可保持五年以上，且需用時操作方法簡單易行，活化后的二步菌發(fā)酵水平都基本保持在115-125mg/ml的水平，二步轉(zhuǎn)化率在94%以上，生產(chǎn)得到了穩(wěn)定，避免了因頻繁傳代帶來的風險。
【專利說明】一種維生素C混合菌的保藏方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種維生素C混合菌的保藏方法。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素C (VitanunC, Vc)是人體營養(yǎng)必需的維生素，其不僅作為重要的醫(yī)藥產(chǎn)品用于治療多種疾病，也廣泛用于食品、飼料及化妝品中。隨著維生素C應(yīng)用范圍的增加，市場需求量日益增大，使人們對VC生產(chǎn)技術(shù)不斷地進行研究、改進?，F(xiàn)行技術(shù)中維生素C的發(fā)酵生產(chǎn)通常采用的都是二步法，其中古龍酸的合成:采用巨大芽孢桿菌(俗稱大菌，大菌為革蘭氏陽性芽孢桿菌，可染噬菌體，較易分化，)和氧化葡萄糖酸桿菌(俗稱小菌，小菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，菌體呈短桿，近呈球體)兩者混合發(fā)酵，因為小菌適宜在中性條件下生長，可以氧化山梨糖成古龍酸，但小菌單獨培養(yǎng)生長欠佳，且產(chǎn)酸甚微，需與大菌混合培養(yǎng)，其與小菌共同發(fā)酵有明顯促進小菌產(chǎn)酸的作用，大菌為小菌的伴生菌，在整個發(fā)酵中小菌起到關(guān)鍵的作用，且需要掌握大小菌的合適比例。
[0003]原有古龍酸生產(chǎn)技術(shù)環(huán)節(jié)中，一般不進行常規(guī)的菌種保藏，其保藏方式是制備的種子液一部分進罐發(fā)酵生產(chǎn)，一部分經(jīng)過分離制備成斜面，再制備種子液，制備的種子液一部分進罐生產(chǎn)，一部分經(jīng)過分離制備成斜面，通過對產(chǎn)生菌采用反復(fù)循環(huán)、活化、傳代的方式為生產(chǎn)提供種子液。由于頻繁傳代、活化，菌種很容易出現(xiàn)大小菌比例失調(diào)，產(chǎn)酸能力下降，甚至因為反復(fù)移種、傳代極易造成大面積染菌現(xiàn)象，從而使生產(chǎn)的穩(wěn)定性不能得到有效的控制和保障，因為發(fā)酵生產(chǎn)水平的波動，給后工序生產(chǎn)同時帶來了技術(shù)難度，為產(chǎn)品的質(zhì)量問題也埋下了隱患。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于`克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種維生素C混合菌的保藏方法，利用該方法可保證菌種的相對穩(wěn)定性，防止因菌種質(zhì)量的不穩(wěn)定性給生產(chǎn)造成波動。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的所采取的技術(shù)方案為:
[0006]一種維生素C混合菌的保藏方法，其特征是:將大、小菌搭配培養(yǎng)的維生素C混合菌種之斜面，用體積濃度為50%的甘油制備成懸浮液，再封裝于無菌凍存管中，置于_70±2°C溫度下保存。
[0007]上述大、小菌搭配培養(yǎng)的過程為:
[0008]a.將經(jīng)過搖瓶篩選，且生產(chǎn)性能優(yōu)良的原始菌菌株的種子液分離于平板，涂布均勻，置29.5±1°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)60~72小時；
[0009]b.在無菌條件下挑外觀生長良好，半透明，分布均勻，無雜菌的小菌放入無菌水中，使小菌水呈乳白色，接種至茄形瓶斜面上，放入29.5±1°C恒溫室培養(yǎng)22~24小時，觀察無雜菌生長后，接入生長良好，大小適中，邊緣齊整的大菌，在同等溫度條件下繼續(xù)培養(yǎng)46~50小時。
[0010]上述冷凍的菌體經(jīng)過三代活化培養(yǎng)后用于大生產(chǎn)。[0011]本發(fā)明將優(yōu)質(zhì)的菌株增殖培養(yǎng)，用甘油制成懸浮液后進行批量的冷凍保藏，保證每個周期的菌種質(zhì)量都是一致的，且只使用一個生產(chǎn)周期，并且每個生產(chǎn)周期使用的菌種是獨立包裝保存的，生產(chǎn)過程不需常年依靠轉(zhuǎn)種的方式保留菌種，有效防止染菌或種液質(zhì)量退化現(xiàn)象，使發(fā)酵過程更趨于穩(wěn)定，為提煉工序打下良好基礎(chǔ)，產(chǎn)品質(zhì)量得到保障。
[0012]采用本發(fā)明方法保藏的VC 二步菌菌種，其菌種死亡率在1%以下，變異率為零，其菌種的特性和穩(wěn)定性可保持五年以上，且需用時操作方法簡單易行。
[0013]采用凍存管活化三代種液進罐生產(chǎn)以來，無論是從試驗罐到大生產(chǎn)，二步菌發(fā)酵水平都基本保持在115-125mg/ml的水平，二步轉(zhuǎn)化率在94%以上，生產(chǎn)得到了穩(wěn)定，也避免了因頻繁傳代帶來的風險。
[0014]按照此菌種保藏方法，經(jīng)過近四年的保藏，維生素C混合菌菌種的性能絲毫未減，生產(chǎn)各項指數(shù)穩(wěn)定，避免了反復(fù)傳代帶來的波動及染菌的風險對生產(chǎn)的影響。應(yīng)用本發(fā)明的方法，既簡化了操作工藝，又穩(wěn)定了生產(chǎn)，且在種子制備環(huán)節(jié)，減少了人員操作，降低了人工成本。
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種維生素C混合菌的保藏方法，其特征是:將大、小菌搭配培養(yǎng)的維生素C混合菌種之斜面，用體積濃度為50%的甘油制備成懸浮液，再封裝于無菌凍存管中，置于-70±2°c溫度下保存。
2.按照權(quán)利要求1所述的維生素C混合菌的保藏方法，其特征在于上述大、小菌搭配培養(yǎng)的過程為: a.將經(jīng)過搖瓶篩選，且生產(chǎn)性能優(yōu)良的原始菌菌株的種子液分離于平板，涂布均勻，置29.5±1°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48~72小時； b.在無菌條件下挑外觀生長良好,半透明，分布均勻，無雜菌的小菌放入無菌水中，使小菌水呈乳白色，接種至茄形瓶斜面上，放入29.5± I°C恒溫室培養(yǎng)22~24小時，觀察無雜菌生長后，接入生長良好，大小適中，邊緣齊整的大菌，在同等溫度條件下繼續(xù)培養(yǎng)46~50小時。
3.按照權(quán)利要求1所述的維生素C混合菌的保藏方法，其特征是:冷凍的菌體經(jīng)過三代活化培養(yǎng)后用于大生產(chǎn)。
【文檔編號】C12N1/04GK103497895SQ201310443256
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】李學(xué)兵, 于新燕, 胡繼紅, 陳惠琴 申請人:寧夏啟元藥業(yè)有限公司