一種嗜熱毀絲霉的發(fā)酵物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種嗜熱毀絲霉的發(fā)酵物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種制備發(fā)酵物的方法，包括如下步驟：將嗜熱毀絲霉ACCC?No.30572接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，40-55℃、100-300r/min振蕩培養(yǎng)5-9天；發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方法制備：將碳源、氮源、硫酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、硫酸鎂、甘油、吐溫-80和水混合，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；碳源的濃度為25-60g/L，氮源的濃度為10-40g/L，硫酸銨的濃度為1-10g/L，磷酸二氫鉀的濃度為1-10g/L，碳酸鈣的濃度為1-4g/L，硫酸鎂的濃度為0.5-4g/L，甘油的濃度為1-4g/L，吐溫-80的濃度為0.5-3g/L。本發(fā)明的提供的發(fā)酵物具有纖維素酶的活性，具有良好的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，在高溫條件下具有較高的酶活，在較寬的pH范圍內(nèi)具有較高的酶活。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種嗜熱毀絲霉的發(fā)酵物及其制備方法和應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種嗜熱毀絲霉的發(fā)酵物及其制備方法和應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]纖維素酶(cellulase)是一種能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的復(fù)合酶系，包括:(I) 內(nèi)切葡聚糖酶(endo-β -1, 4-D-glucanase,EG, EC3.2.1.4),也稱(chēng)CMC酶；(2)外切葡聚糖酶 (exo-β -1, 4-glucanase, EC3.2.1.91)或纖維二糖水解酶(cello-biohydrolases, CBH)；[3]葡萄糖苷酶(β-1, 4-D-glucosidase, BG, EC3.2.1.21)，也叫水楊甙酶。以上三種酶中， 每一類(lèi)都有多個(gè)同工酶。內(nèi)切酶將長(zhǎng)鏈纖維素從內(nèi)部切斷，外切酶自纖維素鏈的還原端或非還原端切下二糖或寡糖，葡萄糖苷酶將纖維二糖或寡糖水解為葡萄糖。隨著纖維素酶在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用(如食品、飼料、釀造、造紙，特別是在紡織工業(yè)和生物能源上的應(yīng)用)，纖維素酶已經(jīng)成為最近十幾年酶工程研究的一個(gè)熱點(diǎn)。[0003]到目前為止，已發(fā)現(xiàn)了多種能夠產(chǎn)生纖維素酶的微生物，涵蓋了厭氧與好氧、原核與真核微生物。在產(chǎn)生纖維素酶的微生物中，不同菌株所產(chǎn)纖維素酶具有不同的作用方式與底物特異性。根據(jù)其酶學(xué)性質(zhì)與應(yīng)用環(huán)境，纖維素酶又被分為酸性纖維素酶、中性纖維素酶與堿性纖維素酶。酸性纖維素酶主要用于生物能源、紡織水洗等。中性纖維素酶主要用于紡織水洗工業(yè)。堿性纖維素酶則可用于洗滌劑中。[0004]工業(yè)生產(chǎn)上常用的產(chǎn)纖維素酶微生物是常溫、中溫絲狀真菌，它們能夠產(chǎn)生完整的纖維素酶系，可以將結(jié)晶纖維素完全降解為葡萄糖，如木霉(Trichoderma sp.)、青霉 (Penicillium sp.)、腐質(zhì)霉(Humicola sp.)等。上述菌株產(chǎn)生的纖維素酶大多需要在50°C 以下發(fā)揮較好的效能，而在較高的溫度下容易失活。高溫纖維素酶在生物能源領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種嗜熱毀絲霉的發(fā)酵物及其制備方法和應(yīng)用。[0006]本發(fā)明提供了一種制備發(fā)酵物的方法，包括如下步驟:將嗜熱毀絲霉 (Myceliophthora thermophila) ACCC N0.30572 接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，40_55°C、100_300r/ min振蕩培養(yǎng)5-9天；[0007]所述發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方法制備:將碳源、氮源、硫酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、 硫酸鎂、甘油、吐溫-80和水混合，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 25-60g/L (如 25g-33g、33g-40g、40g_50g、50g、60g、25g、33g、40g、50g 或 60g),所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10-40g/L，所述硫酸銨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 l-10g/L,所述磷酸二氫鉀在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l-10g/L，所述碳酸鈣在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l_4g/L，所述硫酸鎂在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0.5-4g/L，所述甘油在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l-4g/L，所述吐溫-80在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0.5-3g/L。[0008]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH可為4-6，具體可為5。[0009]所述碳源可為微晶纖維素、玉米芯或稻草粉。[0010]所述氮源可為玉米漿、玉米漿干粉、大豆胨、蛋白胨、酵母粉或胰蛋白胨。[0011]所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為50g/L，所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為27g/L，所述硫酸銨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為5g/L，所述磷酸二氫鉀在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為6g/L，所述碳酸鈣在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為2.5g/L，所述硫酸鎂在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為lg/L，所述甘油在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為2.5g/L，所述吐溫-80在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體可為2g/L。[0012]所述振蕩培養(yǎng)具體可三角瓶中進(jìn)行，所述發(fā)酵培養(yǎng)基在單個(gè)三角瓶中的裝液量可為 40-70ml (如 40ml、50ml、60ml 或 70ml)。[0013]所述振蕩培養(yǎng)的條件具體可為:45°C、180r/min振蕩培養(yǎng)5天。[0014]所述方法還可包括如下步驟:完成所述振蕩培養(yǎng)后，5000g離心20min，收集上清液。[0015]所述接種的實(shí)現(xiàn)方法具體如下:將嗜熱毀絲霉接種到PDA斜面上，45°C培養(yǎng)5d后挖塊(具體大小可為0.5X I厘米)并進(jìn)行所述接種。[0016]以上任一所述方法制備得到的發(fā)酵物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0017]本發(fā)明還保護(hù)所述發(fā)酵物在制備纖維素酶中的應(yīng)用。[0018]本發(fā)明還保護(hù)所述發(fā)酵物作為纖維素酶的應(yīng)用。應(yīng)用所述發(fā)酵物時(shí)，反應(yīng)的溫度可為40-60°C，優(yōu)選為60°C。應(yīng)用所述發(fā)酵物時(shí)，反應(yīng)的pH為3-6，優(yōu)選為5。[0019]本發(fā)明的提供了一種發(fā)酵物，該發(fā)酵物具有纖維素酶的活性，具有良好的溫度穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性，在高溫條件下具有較高的酶活，在較寬的pH范圍內(nèi)具有較高的酶活?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為實(shí)施例2的步驟一的結(jié)果。[0021]圖2為實(shí)施例2的步驟二的結(jié)果。[0022]圖3為實(shí)施例2的步驟三的結(jié)果。[0023]圖4為實(shí)施例2的步驟四的結(jié)果。[0024]圖5為實(shí)施例3的步驟一的結(jié)果。[0025]圖6為實(shí)施例3的步驟二的結(jié)果。[0026]圖7為實(shí)施例3的步驟三的結(jié)果。[0027]圖8為實(shí)施例3的步驟四的結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】[0028]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。[0029]實(shí)施例中所用的嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)獲自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(英文全稱(chēng)為“Agricultural Culture Collection of China”,英文縮寫(xiě)為“ACCC”，網(wǎng)址為“http: //www.accc.0rg.cn/”), ATCC編號(hào)為30572，所以又稱(chēng)嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila) ACCC N0.30572。[0030]微晶纖維素:河北省鹿泉市焊條粉劑廠。玉米芯:陽(yáng)谷金友農(nóng)副產(chǎn)品深加工廠。稻草粉:毫州市保華藥業(yè)有限公司。玉米漿:河北康欣制藥有限公司。玉米漿干粉:山東鄆城康源生物科技有限公司。大豆胨:北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。蛋白胨:北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。酵母粉:北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。胰蛋白胨:北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。新華I號(hào)濾紙:杭州沃華濾紙有限公司。[0031]酶活力單位的定義:每小時(shí)水解濾紙產(chǎn)生Img還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位 (IU)。[0032]實(shí)施例1、嗜熱毀絲霉在生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用[0033]一、種子培養(yǎng)[0034]將嗜熱毀絲霉接種到PDA斜面上，45°C培養(yǎng)5d。[0035]二、發(fā)酵[0036]采用250ml三角瓶，每個(gè)三角瓶中裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基。[0037]將種子斜面挖塊(大小約為0.5X1厘米)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，45°C、180r/min振蕩 (半徑13mm)培養(yǎng)5天,然后5000g離心20min,收集上清液。[0038]發(fā)酵培養(yǎng)基(pH=5):取微晶纖維素50g、玉米漿27g、硫酸銨5g、磷酸二氫鉀6g、碳酸鈣2.5g、硫酸鎂lg、甘油2.5g和吐溫_802g，溶于水并用水定容至1L。[0039]三、酶活力的測(cè)定[0040]酶活力的測(cè)定(反應(yīng)溫度為50°C，反應(yīng)pH為4.8):以50mg濾紙(新華I號(hào))為底物，加入Iml pH4.8,0.05M磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在50°C水浴中預(yù)熱3min ;然后加入步驟二得到的上清液的稀釋液(用pH4.8,0.05M磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進(jìn)行稀釋)0.5ml，50°C水浴60min ;然后加入3ml DNS溶液以終止反應(yīng)，混勻，沸水浴IOmin顯色； 冷卻后，加入IOml水，搖勻，采用721分光光度計(jì)檢測(cè)540nm處的吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程(用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=(1.898x+0.139)X2XN, x為吸光值，N為稀釋倍數(shù)，y為酶活力、單位為U/ml)得到上清液的酶活力。[0041]步驟二得到的上清液作為纖維素酶的酶活力為9.7U/mL。[0042]實(shí)施例2、嗜熱毀絲霉的發(fā)酵條件的優(yōu)化[0043]一、不同碳源對(duì)產(chǎn)纖維 素酶的影響[0044]1、種子培養(yǎng) [0045]將嗜熱毀絲霉接種到PDA斜面上，45°C培養(yǎng)5d。[0046]2、發(fā)酵[0047]采用250ml三角瓶，每個(gè)三角瓶中裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基。[0048]將種子斜面挖塊(大小約為0.5X1厘米)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，45°C、180r/min振蕩 (半徑13mm)培養(yǎng)5天,然后5000g離心20min,收集上清液。[0049]發(fā)酵培養(yǎng)基(pH=5):取碳源(微晶纖維素、玉米芯或稻草粉)50g、玉米漿27g、硫酸銨5g、磷酸二氫鉀6g、碳酸|丐2.5g、硫酸鎂lg、甘油2.5g和吐溫_802g,溶于水并用水定容至IL0[0050]3、酶活力的測(cè)定[0051]將步驟2得到的上清液按照實(shí)施例1的步驟三中的方法檢測(cè)酶活力。[0052]步驟2得到的上清液的結(jié)果見(jiàn)圖1 (縱坐標(biāo)的單位為U/mL)。以微晶纖維素作為碳源時(shí)具有最高酶活。[0053]二、不同氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響[0054]1、種子培養(yǎng)[0055]將嗜熱毀絲霉接種到PDA斜面上，45°C培養(yǎng)5d。[0056]2、發(fā)酵[0057]采用250ml三角瓶，每個(gè)三角瓶中裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基。[0058]將種子斜面挖塊(大小約為0.5X1厘米)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，45°C、180r/min振蕩 (半徑13mm)培養(yǎng)5天,然后5000g離心20min,收集上清液。[0059]發(fā)酵培養(yǎng)基(pH=5):取微晶纖維素50g、氮源(玉米漿、玉米漿干粉、大豆胨、蛋白胨、酵母粉或胰蛋白胨)27g、硫酸銨5g、磷酸二氫鉀6g、碳酸鈣2.5g、硫酸鎂lg、甘油2.5g 和吐溫-802g，溶于水并用水定容至1L。[0060]3、酶活力的測(cè)定[0061]將步驟2得到的上清液按照實(shí)施例1的步驟三中的方法檢測(cè)酶活力。[0062]步驟2得到的上清液的結(jié)果見(jiàn)圖2 (縱坐標(biāo)的單位為U/mL)。以玉米漿干粉作為氮源時(shí)具有最高酶活。[0063]三、微晶纖維素濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響[0064]1、種子培養(yǎng)[0065]將嗜熱毀絲霉接種到PDA斜面上，45°C培養(yǎng)5d。[0066]2、發(fā)酵[0067]采用250ml三角瓶，每個(gè)三角瓶中裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基。[0068]將種子斜面挖塊(大小約為0.5X1厘米)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，45°C、180r/min振蕩 (半徑13mm)培養(yǎng)5天,然后5000g離心20min,收集上清液。[0069]發(fā)酵培養(yǎng)基(pH=5):取微晶纖維素(25g、33g、40g、50g或60g)、玉米漿27g、硫酸銨 5g、磷酸二氫鉀6g、碳酸|丐2.5g、硫酸鎂lg、甘油2.5g和吐溫-802g,溶于水并用水定容至 IL0[0070]3、酶活力的測(cè)定[0071]將步驟2得到的上清液按照實(shí)施`例1的步驟三中的方法檢測(cè)酶活力。[0072]步驟2得到的上清液的結(jié)果見(jiàn)圖3 (縱坐標(biāo)的單位為U/mL)。微晶纖維素濃度為 50g/L時(shí)具有最高酶活。[0073]四、通氣量對(duì)產(chǎn)酶的影響[0074]1、種子培養(yǎng)[0075]將嗜熱毀絲霉接種到PDA斜面上，45°C培養(yǎng)5d。[0076]2、發(fā)酵[0077]采用250ml三角瓶，每個(gè)三角瓶中裝有40ml、50ml、60ml或70ml發(fā)酵培養(yǎng)基。[0078]將種子斜面挖塊(大小約為0.5X1厘米)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，45°C、180r/min振蕩 (半徑13mm)培養(yǎng)5天,然后5000g離心20min,收集上清液。[0079]3、酶活力的測(cè)定[0080]將步驟2得到的上清液用pH4.8,0.05M磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋至1.5倍體積，得到稀釋液，然后按照實(shí)施例1的步驟三中的方法檢測(cè)酶活力。[0081]稀釋液的結(jié)果見(jiàn)圖4 (縱坐標(biāo)的單位為U/mL)。發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為40ml時(shí)具有最聞酶活。[0082]實(shí)施例3、纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)[0083]一、最適反應(yīng)溫度[0084]取實(shí)施例1的步驟二得到上清液，參照實(shí)施例1的步驟三的酶活力測(cè)定方法檢測(cè)酶活力，差異僅在于分別采用如下反應(yīng)溫度:30°C、40°C、50°C、6(rC和70°C。[0085]上清液的結(jié)果見(jiàn)圖5 (縱坐標(biāo)的單位為U/mL)。在60°C時(shí)具有最高酶活。[0086]二、最適反應(yīng)pH[0087]取實(shí)施例1的步驟二得到上清液，參照實(shí)施例1的步驟三的酶活力測(cè)定方法檢測(cè)酶活力，差異僅在于分別采用如下緩沖液替換“pH4.8,0.05M磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液緩沖液”:pH為3.0、4.0、5.0或6.0的0.05M磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。[0088]上清液的結(jié)果見(jiàn)圖6 (縱坐標(biāo)的單位為U/ml)。在pH5.0時(shí)具有最高酶活。[0089]三、熱穩(wěn)定性[0090]將實(shí)施例1的步驟二得到上清液分別于40°C、50°C、60°C或70°C放置一定時(shí)間(Ih 或2h)，然后按照實(shí)施例1的步驟三的酶活力測(cè)定方法檢測(cè)，以未放置的上清液(Oh)的酶活作為100%，計(jì)算在不同溫度孵育不同時(shí)間后的上清液的相對(duì)酶活。[0091]結(jié)果見(jiàn)圖7 (縱坐標(biāo)的單位為％)。在50_60°C熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。[0092]四、pH穩(wěn)定性[0093]將實(shí)施例1的步驟二得到上清液分別用3.0,4.0,5.0,6.0,7.0或8.0的0.05M磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋至2倍體積，室溫放置10小時(shí)，得到各個(gè)稀釋液。將用水稀釋相同倍數(shù)的稀釋液作為對(duì)照。[0094]取各個(gè)稀釋液，按照實(shí)施例1的步驟三的酶活力測(cè)定方法檢測(cè)，以對(duì)照的酶活力作為100%，計(jì)算在不同pH條件下孵育后的相對(duì)酶活。[0095]結(jié)果見(jiàn)圖8 (縱坐標(biāo)的單位為％)。除采用ρΗ4.0的緩沖液孵育后酶活力稍有下降， 其余PH條件時(shí)的酶活力均有所上升，表明由嗜熱毀絲霉產(chǎn)生的纖維素酶有極強(qiáng)的pH穩(wěn)`定性。
【權(quán)利要求】
1.一種制備發(fā)酵物的方法，包括如下步驟:將嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)ACCC N0.30572 接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，40_55°C、100_300r/min 振蕩培養(yǎng) 5-9 天；所述發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方法制備:將碳源、氮源、硫酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、硫酸鎂、甘油、吐溫-80和水混合，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 25-60g/L，所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10-40g/L，所述硫酸銨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l-10g/L，所述磷酸二氫鉀在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l-10g/L，所述碳酸鈣在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l_4g/L，所述硫酸鎂在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0.5-4g/L，所述甘油在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l_4g/L，所述吐溫-80在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0.5-3g/L。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述碳源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 50g/L，所述氮源在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為27g/L，所述硫酸銨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，所述磷酸二氫鉀在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為6g/L，所述碳酸鈣在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2.5g/L，所述硫酸鎂在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為lg/L，所述甘油在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2.5g/L，所述吐溫-80在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2g/L。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述振蕩培養(yǎng)是在三角瓶中進(jìn)行的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基在單個(gè)三角瓶中的裝液量為40-70ml。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述振蕩培養(yǎng)的條件為:45°C、 180r/min振蕩培養(yǎng)5天。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述方法還包括如下步驟:完成所述振蕩培養(yǎng)后，5000g離心20min，收集上清液。
6.權(quán)利要求1至5中任一所述方法制備得到的發(fā)酵物。
7.權(quán)利要求6所述發(fā)酵物在制備纖維素酶中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求6所述發(fā) 酵物作為纖維素酶的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用所述發(fā)酵物時(shí)，反應(yīng)的溫度為40-60°C， 優(yōu)選為60°C。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用所述發(fā)酵物時(shí)，反應(yīng)的pH為3-6，優(yōu)選為5。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103497942SQ201310445941
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】楊敬, 鈔亞鵬, 錢(qián)世鈞, 陳樹(shù)林, 馬延和, 張國(guó)青, 石家驥 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所