一種豬肺特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動(dòng)物肺特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子，是下述a）或b）或c)的DNA片段：a）3′端至少含有序列表中序列1的第1001-3000位核苷酸序列，并且從序列1的第1001位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為2000bp至3000bp的任意一個(gè)DNA片段；所述DNA分子具有啟動(dòng)子功能；b）與a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段；c）在嚴(yán)格條件下與a）或b）限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段。本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子在肺來源的細(xì)胞中特異表達(dá)目的基因，這對(duì)于培育抗呼吸系統(tǒng)傳染病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有重要意義。
【專利說明】一種豬肺特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬肺特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別涉及一種來源于豬的肺泡表面活性蛋白B特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)期以來我國(guó)的豬群存欄與產(chǎn)量一直處于世界領(lǐng)先地位。隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大化、集約化，動(dòng)物飼養(yǎng)密度不斷增加，動(dòng)物疫病感染狀況日益復(fù)雜，動(dòng)物疫病的發(fā)生和流行嚴(yán)重制約著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展和壯大。當(dāng)前豬場(chǎng)傳染病發(fā)生日益嚴(yán)重，且發(fā)病面廣、傳染快、流行蔓延迅速、死亡率極高。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，自20世紀(jì)70年代以來新增加豬傳染病有21種，其中90年代以來新增加7種。豬的多種傳染病的發(fā)生和流行，嚴(yán)重打擊了農(nóng)民養(yǎng)豬的積極性，阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。通過呼吸系統(tǒng)傳播的疾病占絕大多數(shù)，包括豬氣喘病、豬副嗜血桿菌病、豬鏈球菌病，豬肺疫、豬傳染性胸膜肺炎、豬傳染性萎縮性鼻炎、豬沙門氏菌病、豬流感、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬圓環(huán)病毒病、豬附紅細(xì)胞體病、弓形蟲病等。如果能夠通過抗病育種的方法，培育抗呼吸系統(tǒng)傳染病的轉(zhuǎn)基因豬，減少呼吸系統(tǒng)傳染病的發(fā)生，將對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
[0003]轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵在于使外源目的基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定聞效的表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因表達(dá)所用的啟動(dòng)子起著非常重要的作用。啟動(dòng)子是一段能使基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的DNA序列，轉(zhuǎn)錄的RNA通過進(jìn)一步的翻譯和修飾形成功能蛋白質(zhì)。根據(jù)啟動(dòng)子作用的方式及功能不同，可以大致分為4類:組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織或發(fā)育階段特異型啟動(dòng)子和合成型啟動(dòng)子。外源基因在組織或發(fā)育階段特異型啟動(dòng)子的調(diào)控下，能夠在某些特定的組織器官中表達(dá)。如果采用呼吸道特異表達(dá)的啟動(dòng)子，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗病基因在豬呼吸道特異表達(dá)，培育出能夠抗呼吸系統(tǒng)傳播疾病的轉(zhuǎn)基因豬，將在豬的遺傳改良中具有重大意義。目前已有一些組織特異性啟動(dòng)子被應(yīng)用于植物的遺傳改良中，獲得了顯著的成效。然而豬組織特異性啟動(dòng)子的研究卻相對(duì)滯后，目前報(bào)道的豬組織特異性啟動(dòng)子寥寥無(wú)幾。
[0004]肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)是由肺泡II型細(xì)胞合成并分泌的一種脂蛋白復(fù)合物，具有降低肺泡表面張力、提高肺的順應(yīng)性、促進(jìn)肺氣體交換、參與肺的防御的生理功能。其主要成分是90%磷脂和8%~10%的肺表面活性蛋白(surfactantprotein, SP)。SP按其發(fā)現(xiàn)的先后順序，有SP-A，SP-B, SP-C和SP-D共4種，其中SP-A和SP-D是親水性蛋白，主要調(diào)節(jié)肺免疫功能，參與主動(dòng)防御過程；SP-B和SP-C是疏水性蛋白，在維持正常肺呼吸功能上起重要作用。SP-B是一種極其重要的疏水蛋白，其表達(dá)明顯受肺泡II型上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞調(diào)控。它能增強(qiáng)吸附作用，促進(jìn)磷脂分布，維持磷脂單層的穩(wěn)定。除了作為肺泡表面活性物質(zhì)的重要組成成分，SP-B還在天然免疫反應(yīng)中起重要作用，可能使其出現(xiàn)過度炎癥反應(yīng)。肺表面活性物質(zhì)蛋白B在胎肺發(fā)育16周時(shí)開始表達(dá)，定位于上皮細(xì)胞胞漿，早期表達(dá)于高柱狀未分化上皮細(xì)胞，隨著支氣管發(fā)育，逐漸由呼吸道近端向遠(yuǎn)端遷移，到原始肺泡期穩(wěn)定表達(dá)于肺泡2型上皮細(xì)胞極其前體細(xì)胞，然后表達(dá)趨于穩(wěn)定，生后肺內(nèi)表達(dá)有明顯增加。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種動(dòng)物肺特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明所提供的動(dòng)物特異性啟動(dòng)子來源于豬(Sus scrofa domastica L.),是下述a)或b)或c)的DNA片段:
[0007]a) 3'端至少含有序列表中序列I的第1001-3000位核苷酸序列，并且從序列I的第1001位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為2000bp至3000bp的任意一個(gè)DNA片段；所述DNA分子具有啟動(dòng)子功能；
[0008]b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段；
[0009]c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段。
[0010]所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC, 0.1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次15min。
[0011]所述啟動(dòng)子的最后一位核苷酸是序列I的第3000位。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子具體為下述al)_a3)中任一種:
[0013]al)核苷酸序列為 序列表中序列I的第1001-3000位核苷酸所示的DNA分子(SP-B2000)；
[0014]a2)核苷酸序列為序列表中序列I的第501-3000位核苷酸所示DNA分子(SP-B2500)；
[0015]a3)核苷酸序列為序列表中序列I所示DNA分子(SP-B3000)
[0016]序列表中序列I由3000個(gè)核苷酸組成，即為SP-B3000全長(zhǎng)啟動(dòng)子。而上述al)和a2)所述的啟動(dòng)子為所述SP-B3000全長(zhǎng)啟動(dòng)子的5,端截短啟動(dòng)子。
[0017]含有所述啟動(dòng)子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]所述重組載體中，由所述啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組載體具體為在pGL3-Basic載體的多克隆位點(diǎn)插入所述啟動(dòng)子得到的重組質(zhì)粒。所述多克隆位點(diǎn)具體為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)Kpn I和Hind III。所述目的基因具體為熒光素酶基因(luc)。
[0019]所述表達(dá)盒由所述啟動(dòng)子，由所述啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成；所述啟動(dòng)子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連接。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述目的基因具體為熒光素酶基因(luc)。
[0020]所述啟動(dòng)子在啟動(dòng)目的基因在動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021]在所述應(yīng)用中，所述動(dòng)物細(xì)胞可為呼吸道細(xì)胞.[0022]進(jìn)一步，所述呼吸道細(xì)胞可為肺來源的細(xì)胞。
[0023]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述動(dòng)物細(xì)胞具體為A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)、LTEP-a-2細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)。
[0024]在所述應(yīng)用中，所述表達(dá)具體為肺特異性表達(dá)。
[0025]所述肺特異性表達(dá)為在肺中的表達(dá)量顯著高于肺以外的其他部位。[0026]所述啟動(dòng)子在制備用于培育抗呼吸系統(tǒng)傳染病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述動(dòng)物可為豬等。
[0027]本發(fā)明利用相關(guān)生物信息學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在豬的全基因組中找到了 SP-B的基因序列，從杜X長(zhǎng)X大豬的基因組中克隆了豬SP-B的啟動(dòng)子序列，將該啟動(dòng)子序列連入pGL3-Basic載體中，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞系，通過檢測(cè)啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因的活性確定了豬SP-B啟動(dòng)子是肺特異性啟動(dòng)子。
[0028]本發(fā)明所提供的豬肺特異性表達(dá)啟動(dòng)子具有如下特點(diǎn):
[0029]1、本發(fā)明啟動(dòng)子序列來源于豬基因組，在多個(gè)真核細(xì)胞中驗(yàn)證了其組織表達(dá)特異性，確定了其只在肺來源細(xì)胞中特異性表達(dá)外源基因。
[0030]2、啟動(dòng)子SP-B2000已去掉了非功能區(qū)，只保留了核心啟動(dòng)子區(qū)，可直接應(yīng)用到豬轉(zhuǎn)基因工程和分子育種。
[0031]本發(fā)明對(duì)培育抗 呼吸系統(tǒng)傳染病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為豬SP-B3000啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(NP5000);泳道I為PCR產(chǎn)物。
[0033]圖2為重組表達(dá)載體pGL3-SP-B3000和pGL3-SP_B2000的酶切鑒定電泳圖。其中，泳道M為DNA size DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(NP5000);泳道I為Kpn I/Hind III雙酶切PGL3-SP-B3000 產(chǎn)物；泳道 2 為 Kpn I/Hind III 雙酶切 pGL3-SP_B2000 產(chǎn)物。
[0034]圖3為驗(yàn)證豬SP-B3000啟動(dòng)子區(qū)不同截短體的啟動(dòng)子活性(不同載體的突光素酶相對(duì)活性的測(cè)定結(jié)果)。直方圖表示熒光素酶相對(duì)活性，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)示，重復(fù)數(shù)為4。其中，basic 表不 pGL3-Basic 載體；control 表不 pGL3_control 載體；_500 至-3000 依次表示 pGL3-SP-B500 至 pGL3-SP_B3000 —系列 pGL3_SP_B 載體。
[0035]圖4為驗(yàn)證豬SP-B2000啟動(dòng)子在不同來源的細(xì)胞上的啟動(dòng)子活性(不同細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性的測(cè)定結(jié)果)。直方圖表示熒光素酶相對(duì)活性，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)示，重復(fù)數(shù)為 4。其中，SP-B2000 即表示 pGL3-SP-B2000。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038]弓丨物由北京博邁德生物科技有限公司合成，2XPfuPCR MasterMix (10212-01)，NP5000 核酸 Marker (20211-01)，pTP-BSl 克隆載體(30222-01)，定點(diǎn)突變?cè)噭┖?80111-01)購(gòu)自北京諾派生物科技有限公司，血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司(DP304-02)，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，pGL3-Control 載體(E1741)，pGL3_Basic 載體(E1751 )，PRL-TK 質(zhì)粒(E2241 )，熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(E1910)購(gòu)自美國(guó)Promega公司，lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)invitrogen 公司(11668-019)，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) GIBICO 公司(12100-046)，1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBICO公司(31800-022)，A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)、LTEP-a-2細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)、Hela細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)、Caco-2細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)、HepG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)和CNE2細(xì)胞(人鼻咽癌細(xì)胞)均購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。杜X長(zhǎng)X大豬購(gòu)自北京市大興區(qū)種豬場(chǎng)。
[0039]實(shí)施例1、豬SP-B3000啟動(dòng)子的克隆及序列測(cè)定
[0040]一、引物設(shè)計(jì)
[0041]從GENBANK上檢索到豬的SP-B基因序列(GENBANK:AM779476.1 )，通過BLAST軟件對(duì)豬全基因組進(jìn)行同源性分析，尋找到豬基因組中的SP-B基因序列位置，選取豬SP-B基因上游5’側(cè)翼3000bp設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)的引物序列如下，引物引入Kpn I和Hind III限制性酶切位點(diǎn)，人工合成:
[0042]Fl (引物 1):5’ -CGGGGTACCATCTGATGTTGCTATGGCTGT-3’ (下劃線處為 Kpn I 的識(shí)別序列，其后的序列為序列I的第1-21位)
[0043]Rl (引物 2):5’ -CCCAAGCTTCCGCAGCCTGGACACCCT-3’ (下劃線處為 Hind III 的識(shí)別序列，該序列的第9-27為序列I的第2982-3000位的反向互補(bǔ)序列)
[0044]二、豬全基因組的提取
[0045]取新鮮健康的杜X長(zhǎng)X大豬的肝臟組織約200mg，迅速剪碎后轉(zhuǎn)移到玻璃研磨器中，采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取組織全基因組DNA，具體操作參照試劑盒說明書。
[0046]三、PCR擴(kuò)增豬SP-B3000啟動(dòng)子區(qū)
[0047]以步驟二提取的豬基因組DNA為模板，在引物Fl和引物Rl的引導(dǎo)下，利用2XPfu PCR MasterMix并參照試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:首先94°C 5min ;其次94°C 30sec,60°C 30sec, 72°C 3min,共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 5min。將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。
[0048]四、測(cè)序及序列分析
[0049]將PCR擴(kuò)增的大小約3000bp左右的目的DNA亞克隆入平端載體pTP_BSl中，經(jīng)篩選后挑取單克隆測(cè)序，將經(jīng)測(cè)序后表明含有序列表中序列I所示DNA片段(SP-B3000)的重組質(zhì)粒命名為PTP-SP-B3000。序列I由3000個(gè)核苷酸組成。
[0050]實(shí)施例2、豬SP-B3000啟動(dòng)子功能鑒定
[0051]一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0052]將實(shí)施例1中獲得的重組質(zhì)粒PTP-SP-B3000用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Hind III雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的pGL3_Basic載體的骨架片段相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性重組菌，將經(jīng)PCR檢測(cè)(圖1)和酶切鑒定(圖2中泳道I)含有大小約為3000bp目的條帶的的重組載體送樣測(cè)序，將測(cè)序表明含有SP-B3000啟動(dòng)子(序列I)的重組載體命名為PGL3-SP-B3000，將含有該重組載體的重組菌命名為DH5 a -pGL3-SP_B3000。
[0053]利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，?duì)已構(gòu)建的PGL3-SP-B3000質(zhì)粒進(jìn)行截短突變，具體操作參照說明書。依次從SP-B3000的5 ’端進(jìn)行截短，突變成pGL3-SP-B2500(在pGL3_Basic載體的 Kpn I 和 Hind III 之間插入序列 I 的第 501-3000 位)、pGL3-SP_B2000(在 pGL3_Basic 載體的 Kpn I 和 Hind III 之間插入序列 I 的第 1001-3000 位)、pGL3-SP_B1500(在pGL3_Basic載體的Kpn I和Hind III之間插入序列I的第1501-3000位)、pGL3-SP-B1000 (在pGL3-Basic 載體的 Kpn I 和 Hind III 之間插入序列 I 的第 2001-3000 位)、pGL3-SP_B500(在pGL3-Basic載體的Kpn I和Hind III之間插入序列I的第2501-3000位)，共5個(gè)截短質(zhì)粒。對(duì)5個(gè)截短質(zhì)粒均進(jìn)行Kpn I和Hind III雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定，證實(shí)其準(zhǔn)確性。其中pGL3-SP-B2000經(jīng)Kpn I和Hind III雙酶切的鑒定結(jié)果如圖2 (泳道2)所示。將含有這5個(gè)截短質(zhì)粒的重組菌，依次命名為DH5 a -pGL3-SP-B2500、DH5 a -pGL3-SP_B2000、DH5 a -pGL3-SP-B1500、DH5 α -pGL3-SP_B1000、DH5 α -pGL3-SP_B500。將上述所構(gòu)建的 5 個(gè)截短質(zhì)粒中攜帶的外源DNA片段按照外源DNA片段由小到大的順序依次命名為:SP-B500、SP-B1000、SP-B1500,SP-B2000、SP-B2500。
[0054]二、質(zhì)粒提取與鑒定
[0055]將上述重組菌DH5 a-pGL3-SP_B3000、DH5 a-pGL3-SP_B2500、DH5 a-pGL3-SP-B2000、DH5a-pGL3-SP-B1500、DH5 a -pGL3-SP-B I OO O、DH5 a -pGL3-SP-B500分別接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C條件下，200轉(zhuǎn)/分(旋轉(zhuǎn)半徑為13mm)搖床上振蕩培養(yǎng)至0D_值為1，采用質(zhì)粒小提試劑盒抽提重組菌的質(zhì)粒，即步驟一構(gòu)建的6個(gè)重組表達(dá)載體，具體操作參照試劑盒說明書。
[0056]三、細(xì)胞培養(yǎng)
[0057]將A549細(xì)胞、Hela細(xì)胞、Caco-2細(xì)胞，HepG2細(xì)胞、293T細(xì)胞、LTEP-a-2細(xì)胞和CNE2 細(xì)胞在 10% (v/v)新生牛血清的含雙抗 DMEM (Dulbecco，s Modified Eagle’sMedium)培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)條件為37°C，濃度為5%的C02。當(dāng)細(xì)胞完全鋪板時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，操作如下:用洗滌液快速洗滌細(xì)胞一次，加入2mL胰酶，37°C消化約為2分鐘，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞已成球狀后立即棄去胰酶，向培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并用吸管吹打細(xì)胞使盡量以單個(gè)細(xì)胞的形式存在。將獲得的細(xì)胞懸液一部分留在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，另一部分等體積分裝到24孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于轉(zhuǎn)染。
[0058]四、轉(zhuǎn)染
`[0059]當(dāng)24孔板中細(xì)胞達(dá)到60%_70%的匯合率時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。首先吸去培養(yǎng)液，加入無(wú)血清無(wú)雙抗的optiMEM換液培養(yǎng)。其次將步驟一構(gòu)建的6個(gè)重組表達(dá)載體、作為陰性對(duì)照的pGL3-Basic載體(沒有啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光素酶基因的表達(dá))、作為陽(yáng)性對(duì)照的pGL3-Control載體(SV40啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光素酶基因的表達(dá))分別用optiMEM稀釋成IOOng/μ 1，將作為內(nèi)參照的載體PRL-TK (Τ7啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光素酶基因的表達(dá))稀釋成50ng/l.! 1，按Iyg質(zhì)粒需0.75μ I的lipofectamine2000計(jì)算所需的轉(zhuǎn)染試劑的量。按說明書要求用optiMEM稀釋lipofectamine2000，輕輕混勻，室溫下靜置5分鐘后將轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)?；旌暇鶆颍偈覝仂o置20分鐘。取轉(zhuǎn)染液100 μ I滴加到24孔板的其中一個(gè)孔中，這樣每個(gè)重組表達(dá)載體可保證4次重復(fù)。轉(zhuǎn)染過程需在換液后2h內(nèi)完成。轉(zhuǎn)染完成后放入培養(yǎng)箱中溫育，6小時(shí)后棄凈24孔板里液體，PBS清洗一次后加入10% (v/v)新生牛血的無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24-48小時(shí)后收集細(xì)胞。
[0060]五、熒光素酶相對(duì)活性測(cè)定與分析
[0061]使用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒對(duì)步驟四轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行活性測(cè)定，測(cè)定前，準(zhǔn)備以下試劑:(I) IX磷酸裂解緩沖液(PLB)，用購(gòu)自美國(guó)Promega公司試劑盒提供的5XPLB與滅菌水按體積比1:4比例混合，每次使用前配置；(2) LARII (Luciferase AssayReangentII突光分析劑)，將美國(guó)Promega公司試劑合提供的凍干突光分析底物重懸于IOml的LARII中，混勻，分裝后做上標(biāo)記置于_70°C保存?zhèn)溆茫?3)Stop Glo Reagent，每次使用前配置，將50 X Stop & Glo Substrate (終止劑)與Stop Glo Buffer (終止緩沖劑)按體積比1:50混合，試劑配置完畢后進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定，操作步驟如下:
[0062]I)將上述24孔板中轉(zhuǎn)染有目的DNA的貼壁細(xì)胞用I XPBS洗滌一次，棄去殘液，加Λ 100 μ I新鮮配制的1XPLB，室溫下，置于冰上15分鐘，然后_80°C凍融一次；
[0063]2)用移液器吹吸兩次后將裂解液收集到1.5ml離心管做好標(biāo)記，待用；
[0064]3)取若干個(gè)1.5ml離心管，均加入50 μ I的LLARII溶液(_70°C取出，室溫下融化)，備用;
[0065]打開Luminometer20/20照度計(jì)(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)電源開關(guān),進(jìn)入“HOME”主菜單，按下“Protocol”設(shè)定工作模式中各種參數(shù),包括:Display顯示,3S ；integrate time(整合時(shí)間)IOS ；repeat (重復(fù))；靈敏度選用默認(rèn)值；設(shè)定好后返回“HOME” ；
[0066]4)在“HOME”狀態(tài)下，在含50 μ I LARII溶液的1.5mL離心管中加入上述步驟
2)制備好的樣品?ομ 1，用吸頭混合后，放入樣品檢測(cè)池中，按“Measure”，儀器自動(dòng)處理，計(jì)算出螢火蟲熒光酶素(6個(gè)重組表達(dá)載體、陰性對(duì)照pGL3-Basic載體以及陽(yáng)性對(duì)照pGL3-Control載體中的突光素酶基因所表達(dá))活力，顯示加入Stop & Glo Substrate頁(yè)面，此時(shí)取出1.5mL離心管，再加入50 μ I新鮮配置的Stop Glo Reagent，混勻后，放回樣品檢測(cè)池中，按“0K”儀器便會(huì)現(xiàn)計(jì)算出海腎熒光素酶活力(內(nèi)參照載體PRL-TK中的熒光素酶基因所表達(dá))，并計(jì)算出兩種熒光素酶活力比值，即熒光素酶相對(duì)活力，記錄結(jié)果，然后，繪制直方圖。
[0067]對(duì)不同載體熒光素酶活性的檢測(cè)結(jié)果如圖3 (A549細(xì)胞)所示，所構(gòu)建的PGL3-SP-B系列質(zhì)粒(步驟一構(gòu)建的6個(gè)重組表達(dá)載體)的熒光素酶活性與陰性對(duì)照(pGL3-Basic載體)相比均達(dá) 到顯著差異(P < 0.05)，表明重組表達(dá)載體中各自在多克隆位點(diǎn)Kpn I和Hind III之間的外源DNA片段均具有啟動(dòng)子活性；與陽(yáng)性對(duì)照(pGL3-Control載體)相比，PGL3-SP-B 系列質(zhì)粒中的 pGL3-SP-B3000、pGL3-SP-B2500、pGL3-SP-B2000 這 3個(gè)重組表達(dá)載體的熒光素酶活性高很多或者至少齊平，表明這3個(gè)重組表達(dá)載體中所插入的外源DNA片段的啟動(dòng)子活性很高。其中，以重組表達(dá)載體PGL3-SP-B2000的熒光素酶活性最高，PGL3-SP-B2500次之。綜上所述，SP-B啟動(dòng)子的核心區(qū)在SP-B2000 (序列I的第1001-3000 位)區(qū)域。
[0068]對(duì)不同組織來源的7種細(xì)胞檢測(cè)pGL3-SP-B2000的啟動(dòng)子活性，證明了其只在肺(A549細(xì)胞和LTEP-a-2細(xì)胞)具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，證明了該啟動(dòng)子是肺特異性啟動(dòng)子，結(jié)果如圖4所示。
【權(quán)利要求】
1.DNA分子，是下述a)或b)或C)的DNA片段: a)3'端至少含有序列表中序列I的第1001-3000位核苷酸序列，并且從序列I的第1001位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長(zhǎng)，得到長(zhǎng)度為2000bp至3000bp的任意一個(gè)DNA片段；所述DNA分子具有啟動(dòng)子功能； b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段； c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動(dòng)子功能的DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列I的第3000位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子為下述al)-a3)中任一種: al)核苷酸序列為序列表中序列I的第1001-3000位核苷酸所示的DNA分子； a2)核苷酸序列為序列表中序列I的第501-3000位核苷酸所示DNA分子； a3)核苷酸序列為序列表中序列I所示DNA分子。
4.含有權(quán)利要求1-3中任一所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體中，由權(quán)利要求1-3中任一所述DNA分子啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。
6.權(quán)利要求1-3中任一所述DNA分子在制備啟動(dòng)目的基因在動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述動(dòng)物細(xì)胞為呼吸道細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述呼吸道細(xì)胞為肺來源的細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述表達(dá)為肺特異性表達(dá)。
10.權(quán)利要求1-3中任一所述的DNA分子在制備用于培育抗呼吸系統(tǒng)傳染病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103525817SQ201310447351
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】劉文軍, 楊利敏, 李晶, 畢玉海, 賈曉娟, 曹帥 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所