誘導(dǎo)乳腺干細(xì)胞自我更新的方法
【專利摘要】誘導(dǎo)乳腺干細(xì)胞自我更新的方法。本發(fā)明公開了一種microRNA31的新用途。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，microRNA31過表達(dá)使乳腺干細(xì)胞的比例明顯上調(diào)，克隆形成能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)乳腺干細(xì)胞的自我更新。
【專利說明】誘導(dǎo)乳腺干細(xì)胞自我更新的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種小分子RNA，尤其涉及一種小分子RNA--miR-31在促進(jìn)乳腺干 細(xì)胞自我更新上的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因?qū)朐思?xì)胞或真核細(xì)胞來研究基因的表達(dá)調(diào)控與基 因的功能。但基因在離體單個(gè)細(xì)胞中的功能并不一定能代表基因在整體中的功能。從60 年代開始，生命科學(xué)研究人員就試圖找到一種恰當(dāng)?shù)姆椒?，將特定的基因?qū)氚l(fā)育中的哺 乳動(dòng)物體內(nèi)，以便研究基因的功能及調(diào)控規(guī)律。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指用實(shí)驗(yàn)的方法將外源基因 導(dǎo)入早期胚胎細(xì)胞，使之整合于細(xì)胞基因組中而建立的動(dòng)物品系。最早建立成功的轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因小鼠（transgenic mice)。由于轉(zhuǎn)基因小鼠的建立比其它大型轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng) 物的建立要省時(shí)、省力，因此轉(zhuǎn)基因小鼠作為生命科學(xué)研究的一個(gè)新體系已經(jīng)得到越來越 廣泛的應(yīng)用。
[0003] 1993年，Gu等應(yīng)用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了外源基因的時(shí)間特異性表達(dá)?，F(xiàn) 在已經(jīng)能夠從時(shí)間和空間的角度控制外源基因的表達(dá)并觀察其功能，實(shí)現(xiàn)導(dǎo)入的外源基因 在動(dòng)物發(fā)育階段上的可控表達(dá)。Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)是新近發(fā)展起來的高效，無 毒，具有嚴(yán)密開/關(guān)功能的基因表達(dá)系統(tǒng)。自推出以來，在很多方面得到了廣泛的應(yīng)用，尤 其是在基因的表達(dá)調(diào)控及基因治療上。
[0004] MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22-24個(gè)核苷酸的非編碼單 鏈RNA分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。1993年，研究人員在線蟲中發(fā)現(xiàn)第 一個(gè)microRNA，lin-4。2005年，發(fā)現(xiàn)miR-122與Ifepatitis C的生長(zhǎng)與增殖有關(guān)，第一次 把microRNA與疾病聯(lián)系起來。接著，人們發(fā)現(xiàn)microRNA調(diào)控許多生物學(xué)事件，如發(fā)育和癌 癥發(fā)生等。因此，microRNA的研究具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 乳腺是雌性哺乳動(dòng)物的重要器官，其產(chǎn)生的乳汁不僅有豐富的營(yíng)養(yǎng)，而且有免疫 保護(hù)功能。許多信號(hào)通路控制著乳腺上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞移動(dòng)、上皮細(xì)胞向基質(zhì)細(xì)胞的侵入 和上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的相互作用等過程。研究發(fā)現(xiàn)乳腺干細(xì)胞在小鼠乳腺發(fā)育、繁殖周 期和乳腺再生過程中可能起著必不可少的作用。StefanieAvril-Sassen等人利用小鼠乳 腺組織的microRNA芯片系統(tǒng)地研究了 microRNA在不同發(fā)育階段的表達(dá)譜。他們檢測(cè)到有 102個(gè)microRNA在乳腺發(fā)育的不同時(shí)期具有不同的表達(dá)水平，意味著microRNA對(duì)乳腺發(fā)育 可能具有調(diào)控作用。隨后Gregory J. Hannon等研究小組又進(jìn)一步分選了乳腺祖細(xì)胞和非 乳腺祖細(xì)胞，然后分析在兩種細(xì)胞中microRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-31在乳腺干細(xì)胞表達(dá)水 平較高。miR-31不僅在乳腺干細(xì)胞中富集，在人類乳腺癌以及小鼠Her2腫瘤組織中表達(dá)水 平被上調(diào)，暗示其可能在乳腺癌發(fā)生過程中扮演著一定的角色。Scott Valastyan等人發(fā) 現(xiàn)miR-31通過靶向RDX、RhoA表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞遷移，但是，目前miR-31在乳腺 正常發(fā)育過程中的作用還一無所知。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是揭示microRNA31 (miR-31)促 進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制及作用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供miR-31在促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。 該發(fā)明可以用于保持和促進(jìn)奶牛乳腺健康持續(xù)分泌乳汁，從而提高中國奶牛產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)量。
[0008] 具體地，其是通過在乳腺肌上皮中特異性過表達(dá)miR-31，來促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我 更新。
[0009] 作為優(yōu)選，可在D0X誘導(dǎo)下，促進(jìn)miR-31在乳腺肌上皮中進(jìn)行特異性過表達(dá)。
[0010] 體內(nèi)誘導(dǎo)為通過Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)miR-31在C57BL/6遺傳背景下的小鼠 中過表達(dá)；
[0011] 具體步驟為：采用K5rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠和pTRE-miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，對(duì)經(jīng) PCR鑒定的雙陽鼠從出生之日起進(jìn)行濃度為2mg/mL的D0X誘導(dǎo)，使miR-31在乳腺肌上皮中 進(jìn)行特異性過表達(dá)。
[0012] 體外誘導(dǎo)為利用培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)乳腺干細(xì)胞進(jìn)行D0X誘導(dǎo)，microRNA31過表達(dá)使乳腺 干細(xì)胞的比例明顯上調(diào)，克隆形成能力增強(qiáng)；
[0013] 具體步驟為：
[0014] 1)采用膠原酶/透明質(zhì)酸酶對(duì)乳腺組織進(jìn)行消化，分離乳腺單個(gè)上皮細(xì)胞，并用 ⑶24、⑶29、⑶31、⑶45以及TER119等細(xì)胞表面標(biāo)記物對(duì)乳腺干細(xì)胞進(jìn)行流式分選；
[0015] 2)利用培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)分選的乳腺干細(xì)胞進(jìn)行體外D0X誘導(dǎo)下克隆形成能力分析；
[0016] 3 )利用Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠來標(biāo)記乳腺干細(xì)胞的方法來分析 miR-31促進(jìn)干細(xì)胞更新的能力。
[0017] 本發(fā)明還提供了采用細(xì)胞表面標(biāo)記物和報(bào)告基因檢測(cè)miR-31過表達(dá)促進(jìn)乳腺干 細(xì)胞自我更新的方法，采用的細(xì)胞表面標(biāo)記物是CD24和CD29 ;報(bào)告基因是EGFP。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 本發(fā)明首次提供了 miR-31在促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新中的新用途。同時(shí)，首次提 供了體內(nèi)過表達(dá)miR-31促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新的方法，通過該方法使乳腺干細(xì)胞的比 例明顯上調(diào)，克隆形成能力增強(qiáng)。一方面提供了一種促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新的方法。另 一方面，miR-31有可能成為治療乳腺癌藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明real-time PCR結(jié)果。
[0021] 圖2為本發(fā)明miR-31過表達(dá)增加乳腺干細(xì)胞數(shù)量。
[0022] 圖3為本發(fā)明miR-31增強(qiáng)乳腺干細(xì)胞的克隆形成能力。
[0023] 圖4為本發(fā)明miR-31過表達(dá)促進(jìn)Lgr5陽性的乳腺干細(xì)胞擴(kuò)增效果。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0025] 實(shí)施例1乳腺干細(xì)胞分離
[0026] 1.取小鼠新鮮乳腺組織，去掉淋巴結(jié)，放入10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于冰上，用手術(shù) 刀和鑷子將乳腺組織盡可能的剪碎。
[0027] 2.將上述乳腺組織放入15mL離心管中，向其中加入適量膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化 液，置于37°C雜交爐中旋轉(zhuǎn)，消化6-8小時(shí)。
[0028] 3?待乳腺組織消化完全后，350xg離心5-10min，小心棄去上清液。
[0029] 4.在上述乳腺組織碎塊中加入2_3mL氯化銨溶液，以達(dá)到破壞乳腺組織中的紅細(xì) 胞。350xg離心5min，棄上清。
[0030] 5.添加l-2mL胰蛋白酶，用移液器上下混勻l-3min。隨即再向其中加入10mL預(yù) 冷的HBSS緩沖液，用以終止胰蛋白酶消化,350xg離心5min,盡可能的棄去上清，但是不要 將其中的粘稠的漂浮組織樣倒出。
[0031] 6.向上述離心管中加入2mL經(jīng)預(yù)熱的5mg/mL分散酶以及200 y Llmg/mL DNase I， 使用移液器充分混勻，直到上述粘稠的細(xì)胞團(tuán)塊分散，并且溶液變得均勻渾濁，如果不然， 可以補(bǔ)充加入1〇〇 yL DNase I。
[0032] 7.隨即加入10mL事先預(yù)冷的HBSS緩沖液，充分混勻后，過40 y m細(xì)胞篩，將細(xì)胞 制成單細(xì)胞懸液，隨后350xg離心5min，棄去上清后，如果發(fā)現(xiàn)離心管底細(xì)胞團(tuán)塊中仍然有 紅細(xì)胞，可向其中再次加入l -2mL氯化銨，破環(huán)紅細(xì)胞，350xg離心5min，棄上清，此時(shí)的細(xì) 胞可用于下游流式細(xì)胞儀分選。
[0033] 8.將上述分離制成的單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管中，向其中加入適量乳腺 干細(xì)胞染色緩沖液(用于流式細(xì)胞儀分選)，并添加相應(yīng)的標(biāo)記抗體，如CD24、CD29、CD31、 CD45 以及 TER119,置于 4°C，避光 20-30min?？贵w來源：0)24-印1^(3〇6巧讓1^11-〇77(?￡-Cy7,BD),CD29-fluorescein isothiocyanate(FITC, BD), annexin-V-APC(APC, BD), ant i-mouse CD45-allophycocyanin(APC, BD), anti-mouse CD31-APC(APC, BD), anti-mouse TER-119APC(APC, BD).
[0034] 9.待上述染色結(jié)束后，350xg離心5min，棄上清，使用PBS漂洗2次，每次5min。隨 后350xg離心5min，棄上清，再使用染色緩沖液或者PBS重懸細(xì)胞，混合均勻，立即用于流 式細(xì)胞儀分選，或者置于4°C避光，等待流式細(xì)胞儀分選。⑶31-⑶45-TER119-⑶24+-⑶29 high 的細(xì)胞是富含乳腺干細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0035] 實(shí)施例2Dox在K5rt-TA/TRE-miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺組織中誘導(dǎo)miR-31表達(dá)和 miR-31的檢測(cè)
[0036] 1.利用含有2克/升Dox的水去飼喂3周齡的K5rt-TA / TRE-miR-31雙陽小鼠， 同時(shí)飼喂K5rt-TA或TRE-miR-31單陽小鼠作對(duì)照。在12周時(shí)殺死小鼠取樣。
[0037] 2.采用脫臼法處死小鼠后，用去RNase酶的手術(shù)剪刀以及手術(shù)鑷將淋巴結(jié)去 除后，取乳腺組織放于經(jīng)DEPC處理的1.5mL離心管中，向其中加入lmL Lysis Binding Buffer，放入勻漿儀勻漿10-15min，直到組織完全裂解后，再向上述勻漿液中添加100 y L HomegenateAdditive，輕輕振蕩幾次，置于冰上10min。
[0038] 3.向上述混合液中添加lmL酚仿抽提液，輕輕振蕩lmin，10, 000g離心5min，直到 分層。
[0039] 4.將上清液轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，向其中添加1. 25倍體積的無水乙醇，充分混勻 后，室溫放置。
[0040] 5.將上述混合液加入到柱子中（每個(gè)柱子每次最多只能加入700iiL)，10000g離 心15s，棄濾液，重復(fù)本次操作，直到濾過所有上述混合液。
[0041] 6.向柱子中添加 700ii L miRNA Wash Solution I，離心 15s(10, 000g)，棄去濾出 液，并再次向其中加入500 ii L Wash Solution2/3, lOOOOg離心15s，重復(fù)該操作一次后，空 柱再次離心一次，去除殘留液體。
[0042] 7.將柱子轉(zhuǎn)移到2mL Collection Tube中，向其中加入50-100 iiL經(jīng)95°C預(yù)熱的 Elution Solution, 10, 000離心30s，棄去柱子。使用Nanodrop測(cè)離心管底部溶液濃度和 純度，-80°C保存待用。
[0043] 8.反轉(zhuǎn)錄miR-31，按下列反應(yīng)體系加樣（15ii L)，包括：引物，3. Oil L ; dNTP,0.15u L;Mautiscribe RT enzyme,1.0u L;lOx RT Buffer1. 5u L;RNase inhibitor, 0? 19ii L;RNA 樣品，5. Oil L(l-10ng) ;DEPC 水，4. 16ii L?反應(yīng)條件：16°C，30min ; 42°C，30min;85°C，5min;最后保持在 4°C。
[0044] 9. miR-31定量PCR，按照下列反應(yīng)體系加樣（20 ii L)，包括：TaqMan Small RNA Assay, 1. 0u L;Product from RT Reaction, 1. 33u L;TaqMan Universal PCR Master Mix，10.0iiL;DEPC 水，7.67iiL?反應(yīng)條件如下：第一步，95°C，10min;第二步， 95°C，15s;60°C，lmin;重復(fù) 40 次。第三步，4°C，30min。
[0045] real-time PCR結(jié)果如圖1所不，圖1顯不Dox誘導(dǎo)miR-31在K5_rtTA和 TRE-miR-31雙陽小鼠的乳腺上皮的⑶24+⑶29 high細(xì)胞顯著上調(diào)。
[0046] miR-31過表達(dá)增加乳腺干細(xì)胞數(shù)量如圖2所示，（A)流式細(xì)胞結(jié)果顯示 CD24+CD29 high 細(xì)胞在 K5-rtTA 和 TRE-miR-31 雙陽小鼠比 TRE-miR-31 或 K5-rtTA 單陽小鼠相 比顯著增加。（B)4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示CD24+CD29high細(xì)胞在K5-rtTA和TRE-miR-31 雙陽小鼠中增加4倍。
[0047] 實(shí)施例3miR_31對(duì)乳腺干細(xì)胞體外克隆形成能力的影響
[0048] 1.按實(shí)施例一中的方法分選得到的LinTD24+⑶29high細(xì)胞群均等分成3份，每份 含有1〇 5細(xì)胞。
[0049] 2.使用電轉(zhuǎn)的方法使其中2份細(xì)胞電轉(zhuǎn)入4 iig Scramble RNA，另外1份細(xì)胞 電轉(zhuǎn)入 g miR-31 抑制劑（5, -CAGCUAUGCCAGCAUCUUGCCU-3' ；Shanghai GenePharma Co.，Ltd)。
[0050] 3.將這些細(xì)胞用EpiCult-B培養(yǎng)液重懸后，放入細(xì)胞培養(yǎng)支架上（Millipore Cor.，Billerica, USA)培養(yǎng)。培養(yǎng)液是EpiCult-B培養(yǎng)液加入生長(zhǎng)促進(jìn)因子，包含 lOng/mL recombinant human Epidermal Growth Factor(rhEGF;Catalog#02633, Stem Cell Technologies),lOng/mL recombinant human Basic Fibroblast Growth F actor(rh-bFGF;Catalog#02634,Stem Cell Technologies), 4ug/mL(0. 0004%) Heparin(Catalog#07980, Stem Cell Technologies), lOOU/mL Penicillin and100 u g/mL of Streptomycin (Sigma), andl0%FCS (Hyclone)。每隔 24h，換新鮮培養(yǎng)液一次。
[0051] 4. 2 份 miR_31Scramble RNA 處理的細(xì)胞中，一份加入 200ng/mL Dox 誘導(dǎo) miR-31 表達(dá)作為miR過表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組，另一份則不加入Dox作為陰性對(duì)照。
[0052] 5.培養(yǎng)8天后，對(duì)形成的克隆數(shù)量和大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0053] 6.使用0. 25%胰蛋白酶-EDTA在37°C培養(yǎng)箱中完全消化3-5min后，經(jīng)離心、重懸 后得到單個(gè)細(xì)胞。
[0054] 7.miR-31抑制劑處理的細(xì)胞再次電轉(zhuǎn)4u g miR-31抑制劑，其他兩分再次電轉(zhuǎn) 4 u g scramble RNA〇
[0055] 8.重新將這些細(xì)胞放回新一個(gè)培養(yǎng)支架中培養(yǎng)，那Dox處理的細(xì)胞再次加入 200ng/mL Dox，對(duì)照的細(xì)胞不用加入。
[0056] 9.繼續(xù)培養(yǎng)8天后，再次測(cè)量和統(tǒng)計(jì)克隆的數(shù)量和大小。接下來3-6代培養(yǎng)重復(fù) 以上程序。
[0057] miR-31增強(qiáng)乳腺干細(xì)胞的克隆形成能力如圖3所示，圖3中，左邊圖片顯示Dox可 以增加體外乳腺干細(xì)胞培養(yǎng)的克隆數(shù)量。相反，anti-miR-31可以抑制乳腺干細(xì)胞的克隆 形成能力。右邊圖表顯示在乳腺干細(xì)胞連續(xù)6代的培養(yǎng)過程中，Dox可以促進(jìn)乳腺干細(xì)胞 的自我更新。相反，miR-31抑制劑可以抑制乳腺干細(xì)胞的自我更新。通過體外培養(yǎng)技術(shù)評(píng) 估m(xù)iR-31對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響，發(fā)現(xiàn)D0X誘導(dǎo)下乳腺干細(xì)胞克隆形成的數(shù)量也顯著 增加，說明過表達(dá)miR-31可以顯著促進(jìn)乳腺干細(xì)胞的自我更新能力。
[0058] 實(shí)施例4利用Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠來標(biāo)記乳腺干細(xì)胞的方法檢測(cè) miR-31對(duì)乳腺干細(xì)胞的自我更新的影響
[0059] 1?將 Lgr5-EGFP-CreERT 的基因敲入小鼠與 K5-rtTA 和 TRE-miR-31 轉(zhuǎn)基因 小鼠雜交得到Lgr5-EGFP-CreERT，K5-rtTA和TRE-miR-31三陽性小鼠。用K5-rtTA和 Lgr5-EGFP-CreERT雙陽鼠和野生型作對(duì)照。
[0060] 2.在小鼠出生3周后開始喂含有2mg/ml Dox的水，用于誘導(dǎo)miR-31表達(dá)。
[0061] 3?在12周時(shí)，取乳腺組織，固定在zinc-formalin里。
[0062] 4.利用GFP的抗體（Abeam)進(jìn)行常規(guī)的免疫熒光染色。GFP陽性的細(xì)胞是乳腺干 細(xì)胞。
[0063] miR-31過表達(dá)促進(jìn)Lgr5陽性的乳腺干細(xì)胞擴(kuò)增如圖4所示，Lgr5陽性乳腺上皮 細(xì)胞已經(jīng)被鑒定為乳腺干細(xì)胞。通過Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠來檢測(cè)miR-31對(duì) 乳腺干細(xì)胞中的影響的檢測(cè)中，顯示Lgr5陽性細(xì)胞在miR-31過表達(dá)的小鼠中顯著增加。
[0064] 綜上所述，利用我們的方法，Dox可以顯著在K5-rtTA/TRE-miR-31雙陽小鼠和乳 腺干細(xì)胞中誘導(dǎo)miR-31過表達(dá)。
[0065] 利用以上的方法分別對(duì)K5-rtTA/TRE-miR-31雙陽小鼠和K5-rtTA，RE-miR-31 單陽小鼠中LirTCD24 +⑶29high乳腺干細(xì)胞群細(xì)胞數(shù)量的比例進(jìn)行分析。經(jīng)Dox誘導(dǎo)后， K5-rtTA/TRE-miR-31雙陽小鼠LirTCD24 +CD29high乳腺干細(xì)胞群細(xì)胞的比例比K5-rtTA和 TRE-miR-31單陽小鼠上調(diào)4倍。顯示miR-31可以促進(jìn)乳腺干細(xì)胞的自我更新。
[0066] 通過體外培養(yǎng)技術(shù)評(píng)估m(xù)iR-31對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響，發(fā)現(xiàn)D0X誘導(dǎo)下乳腺 干細(xì)胞克隆形成的數(shù)量也顯著增加，說明過表達(dá)miR-31可以顯著促進(jìn)乳腺干細(xì)胞的自我 更新能力。
[0067] Lgr5陽性乳腺上皮細(xì)胞已經(jīng)被鑒定為乳腺干細(xì)胞。通過Lgr5-EGFP-CreERT的基 因敲入小鼠來檢測(cè)miR-31對(duì)乳腺干細(xì)胞中的影響的檢測(cè)中，顯示Lgr5陽性細(xì)胞在miR-31 過表達(dá)的小鼠中顯著增加。
[0068] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. micr〇RNA31在促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，其是通過在乳腺肌上皮中特異性過表達(dá) microRNA31，來促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，在DOX誘導(dǎo)下，使micr〇RNA31在乳腺肌上 皮中進(jìn)行特異性過表達(dá)，促進(jìn)乳腺干細(xì)胞自我更新。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)microRNA31在 C57BL/6遺傳背景下的小鼠中過表達(dá)； 具體步驟為：采用K5rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠和pTRE-miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，對(duì)經(jīng)PCR 鑒定的雙陽鼠從出生3周齡起進(jìn)行濃度為2mg/mL的D0X誘導(dǎo)，使micr〇RNA31在乳腺肌上 皮中進(jìn)行特異性過表達(dá)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，利用培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)乳腺干細(xì)胞進(jìn)行D0X誘 導(dǎo)，micr〇RNA31過表達(dá)使乳腺干細(xì)胞的比例明顯上調(diào)，克隆形成能力增強(qiáng)； 具體步驟為： 1) 采用膠原酶/透明質(zhì)酸酶對(duì)乳腺組織進(jìn)行消化，分離乳腺單個(gè)上皮細(xì)胞，并用CD24、 ⑶29、⑶31、⑶45以及TER119等細(xì)胞表面標(biāo)記物對(duì)乳腺干細(xì)胞進(jìn)行流式分選； 2) 利用培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)分選的乳腺干細(xì)胞進(jìn)行體外D0X誘導(dǎo)下克隆形成能力分析； 3) 利用Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠來標(biāo)記乳腺干細(xì)胞的方法來分析miR-31促 進(jìn)干細(xì)胞更新的能力。
6. -種microRNA31過表達(dá)的檢測(cè)方法，其特征在于，米用細(xì)胞表面標(biāo)記物和報(bào)告基因 檢測(cè)，所述細(xì)胞表面標(biāo)記物是CD24和CD29 ;所述報(bào)告基因是EGFP。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450603SQ201310447607
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】于政權(quán), 李豐銀, 李想, 王珊, 孟慶勇 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)