一種莢膜紅細菌hemA基因的胞內高活性表達方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種莢膜紅細菌hemA基因的胞內高活性表達方法，該方法以莢膜紅細菌（DSMNo.1710）基因組DNA為模板，擴增得到編碼ALA合成酶的含有較多大腸桿菌稀有密碼子的hemA基因，將其克隆到表達載體pET28a上，并利用E.coliRosetta(DE3)表達上述重組質粒，首次實現該莢膜紅細菌hemA基因在E.coliRosetta（DE3）胞內高活性表達。本發(fā)明工程菌有非常高的可溶ALA合成酶表達，獲得的ALA合成酶比活力高達198.2nmol-1?min-1?mgofprotein-1。將其應用于生產，所得胞外ALA產量高達8.61g/L，具有非常好的工業(yè)化前景。
【專利說明】—種莢膜紅細菌hemk基因的胞內高活性表達方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程領域，尤其涉及一種莢膜紅細菌基因的胞內高活性表達方法?！颈尘凹夹g】
[0002]5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)廣泛存在于生物體中，是生物體內四吡咯類化合物(如血紅素、葉啉和維生素B12等)的共同前體。5-氨基乙酰丙酸在農業(yè)上可用作光合作用促進劑、抗逆劑、落葉劑和除草劑等，用途廣泛、對人畜無毒性，是極具發(fā)展前途的無公害綠色農用化學品。在醫(yī)學領域，5-氨基乙酰丙酸作為新一代光動力學藥物，在腦瘤、皮膚癌、膀胱癌和結腸癌等疾病的診斷和治療方面有著極大的應用價值?；贏LA廣闊的應用前景，其合成已引起廣泛的重視。
[0003]ALA的生產主要有化學合成法和生物合成法。前者步驟繁瑣、副產物多且產率低；后者克服了前者的弊端，主要通過生物誘變法或基因工程法來實現。生物誘變法主要是優(yōu)化類球紅細菌iHhodobacter sphaeroides)突變株,但其培養(yǎng)周期長,成本較高；基因工程法主要是構建含有ALA合成酶基因的工程菌，至今報道的ALA合成酶基因來源主要有類球紅細菌{Rhodobacter、大豆根瘤菌 iBradyrhizobium應)、沼澤紅假單胞菌{Rhodopseudomonas palustris)等。
[0004]本發(fā)明利用萬.Rosetta(DE3)表達含有較多大腸桿菌稀有密碼子的莢膜紅細菌{Rhodobacter capsulatus) AewA基因，通過胞內高活性表達ALA合成酶,進一步提高5-氨基乙酰丙酸的產量。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種莢膜紅細菌基因的胞內高活性表達方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現的:本發(fā)明的莢膜紅細菌基因胞內高活性表達的方法是利用E.coli Rosetta (DE3)，表達含有較多大腸桿菌稀有密碼子的莢膜紅細菌基因。
[0007]上述莢膜紅細菌基因的胞內高活性表達方法，包括以下步驟:
(O從莢膜紅細菌的菌液中提取總基因組DNA ；
(2)PCR擴增ALA合成酶基因；
(3)采用雙酶切法，將擴增得到的ALA合成酶基因與質粒pET28a連接，并轉化至DH5α，篩選得到含有重組質粒pET28a-R.C.hemk的陽性克??；
(4)將重組質粒pET28a-R.C.A￡?A轉化至宿主菌Rosetta(DE3)中，篩選得到工程菌Rosetta (DE3) /pET28a-R.C.hemL.[0008](5)發(fā)酵培養(yǎng)工程菌Rosetta(DE3)/pET28a_R.C.hemk,使其胞內高活性表達莢膜紅細菌基因。[0009]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明將一種含有較多大腸桿菌稀有密碼子的莢膜紅細菌力6?A基因接入表達載體pET28a獲得的重組質粒轉化萬.coli Rosetta (DE3),在誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下，實現胞內高活性可溶表達ALA合成酶。表達的ALA合成酶比活力高達198.2 nmoF1Hiin^mg of proteirT1,比現已投入工業(yè)化生產的含放射形土壤桿菌基因的工程菌獲得的ALA合成酶(151.1 nmoF1Hiin-^g of proteirT1)提高31.2%。經初步優(yōu)化后，將其應用于生產，胞外ALA產量高達8.61 g/L，處于國際化領先水平。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是重組質粒pET28a-R.C.hemk的構建圖；圖中，R.C.hemk為莢膜紅細菌AeM基因，kana+為卡那霉素抗性基因，Hind III和NdeI為限制性內切酶位點。
[0011]圖2是工程菌Rosetta(DE3)/pET28a_R.C.hemk發(fā)酵、誘導表達、純化得到的ALA合成酶的電泳圖。
【具體實施方式】
[0012]以下結合實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將更加明顯。
[0013]實施例1:構建本發(fā)明的工程菌，包括以下步驟:
1.從莢膜紅細菌的菌液中提取總基因組DNA，該步驟由以下子步驟來實現:
1.1、將莢膜紅細菌培養(yǎng)至菌液0D_大于1，收集備用；
1.2、按AxyPrep細菌基因組DNA小量試劑盒的標準步驟，提取基因組DNA ；
可以取5 μ?提取得到的基因組DNA,加I μι 6X loading buffer,用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0014]2.PCR擴增得到ALA合成酶基因，該步驟由以下子步驟來實現:
2.1、設計引物 Primerl (SEQ ID N0.1:5，-GGGAATTCCATATGGACTACAATCT CGCGCTC-3，)和 Primer2 (SEQ ID N0.2:5，-CCCAAGCTTAGGCCTCGGCGCGATT CAC-3’)，合成，兩種引物分別溶于不含RNase (核糖核酸酶,Ribonuclease)的水中，配制成兩個濃度均為10 μΜ的溶液；
2.2、取2 μ?步驟I提取的基因組DNA至PCR管，加入步驟2.1配制的兩種引物各2μ1、10 μ? 的 5Χ PrimeSTAR GXL Buffer,4 μ? 的 dNTP Mixture (2.5 mM each)U μ? 的PrimeSTAR GXL DNA Polymerase,最后用滅菌蒸懼水補足至50 Ml，得反應液；
2.3、將上述50 μ?反應液放入PCR儀中，反應條件為:首先98°C預變性10 min，然后98°C變性10 s，58°C退火15 s，72°C延伸1.2 min，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10 min，得PCR擴增產物；
2.4、在上述PCR擴增產物中加入5 μ?的10Χ loading buffer,混勻，經1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定出一條約1.2kb的條帶。
[0015]2.5、用SanPr印柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)回收上述條帶，即得到ALA合成酶基因henA。
[0016]2.6、對上述ALA合成酶AeM基因進行DNA測序，得到SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。該序列含有較多的大腸桿菌稀有密碼子，見附表1 ;
表13.采用雙酶切法，將擴增得到的ALA合成酶基因hemk與質粒pET28a連接，并轉化至DH5 α，篩選得到含有重組質粒pET28a-R.C.hemk的陽性克隆，該步驟由以下子步驟來實現:
3.1、取上述ALA合成酶基因和pET28a質粒各24 μ?，分別加入限制性內切酶HindIII和NdeI (TaKaRa)各 1.5 μ?, IOXK buffer 3 μ? ；
3.2、將上述兩個雙酶切反應體系置于37°C水浴中反應3 h，加入3 μ? IOXloadingbuffer停止反應,經1%瓊脂糖凝膠電泳，并用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)回收，分別得到ALA合成酶和pET28a質粒的雙酶切產物；
3.3、根據電泳條帶的亮度以及片段的大小，確定連接時目的片段與載體的體積比為2:3。分別取上述ALA合成酶和pET28a的酶切產物2 μ?和3 μ?，與5 μ? Solution I(TaKaRa)混勻；
3.4、將上述10 μ?連接體系置于16°C，連接過夜，得到的連接產物轉化感受態(tài)細胞DH5a ；
3.5、經卡那霉素抗性平板篩選出陽性克隆，挑取6個單菌落進行培養(yǎng)，并用AxyPrep質粒小量制備試劑盒提取重組質粒；
3.6、將上述6個重組質粒雙酶切(Hind III和NdeI )，其中5個分別在5kb和1.2kb處有條帶，認為連接成功，命名為重組質粒pET28a-R.C.hemk ;另外一個只有在5kb處有條帶，說明目的基因沒有連接上；
4.將重組質粒pET28a-R.C.A￡?A轉化至宿主菌Rosetta(DE3)中，篩選得到含有上述重組質粒的工程菌，命名為Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.AemA,即為本發(fā)明的工程菌。
[0017]實施例2:莢膜紅細菌基因的胞內高活性表達
1、將本發(fā)明工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemk接種至含50 ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶，置于37°C、200 rpm搖床，培養(yǎng)2 h后降溫至28°C，用25 μ? 0.1M異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。
[0018]2、取2 ml菌液至離心管,4°C、12000 rpm離心I min,棄上清液;
3、用I ml 50 mM Tris-HCl (ρΗ7.5)重懸,4°C、12000 rpm 離心 I min,棄上清液；
4、用Iml 50mM Tris-HCl (ρΗ7.5)重懸后進行超聲破胞，其條件為:200 W，工作5 s,間歇7 S，重復10次；
5、4°C、12000rpm離心10 min，取上清液進行10%SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳；
6、根據電泳結果，在47kDa附近有蛋白條帶(見圖2)，此蛋白即為5-氨基乙酰丙酸合成酶融合蛋白。[0019]實施例3:5-氨基乙酰丙酸合成酶的純化和比活力測定
1、將實施例2中的菌液破胞，離心后得到的上清液即為ALA合成酶的粗酶；
2、將上述粗酶通過QIAGENN1-NTA親和層析和S印hadex G-25凝膠過濾層析，純化得到ALA合成酶的純酶；
3、用BCAProtein Assay Kit測定上述純酶的蛋白濃度；
4、將上述純酶稀釋至蛋白濃度為0.1 mg/ml，加入終濃度為50 mM的Tris-HCl(pH7.5)、0.1 M的甘氨酸、0.27 mM的磷酸吡哆醛、0.2 mM的琥珀酰輔酶A，配成500 μ?反應體系，于37°C振蕩反應10 min，加入150 μ? 10%三氯乙酸終止反應；
5、取300μ?上述反應液與400 μ? I M乙酸鹽緩沖液(ρΗ4.6)和35 μ?乙酰丙酮混勻，沸水浴反應15 min ；
6、待其冷卻后取200μ?，加入200 μ?新配制的Ehrlich試劑，顯色30 min，用紫外分光光度計測量其在554 nm處的吸光度，ALA的濃度(mg/L) =14.251 XOD554-0.2808(R2=0.9998)；
7、計算得到5-氨基乙酰丙酸合成酶純酶的比活力為198.2 nmoF1Hiin^mg ofprotein^1 (一個酶活力單位定義為在37°C條件下，每分鐘產生I nmol 5-氨基乙酰丙酸所需的酶量；比活力為每毫克蛋白所含的酶單位)。
[0020]8、按照上述步驟1-7，用CN101063105所述的工程菌代替本發(fā)明的工程菌，進行5-氨基乙酰丙酸合成酶的純化和比活力測定，得到CN101063105所述的工程菌表達的5-氨基乙酰丙酸合成酶比活力為 151.1 nmoF1Hiin^mg of protein—1。
[0021]該實施例說明本發(fā)明的工程菌能高活性表達ALA合成酶，其比活力比CN101063105所述的工程菌(已投入工業(yè)化生產)提高31.2%。
[0022]實施例4:工程菌發(fā)酵生產5-氨基乙酰丙酸
按照CN101063105所述的方法，利用本發(fā)明的工程菌Rosetta(DE3)/pET28a_R.C.hemk發(fā)酵生產5-氨基乙酰丙酸。經過28.5 h的發(fā)酵，5-氨基乙酰丙酸的產量高達8.61 g/L。
[0023]上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權利要求的保護范圍內，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種莢膜紅細菌基因的胞內高活性表達方法，其特征在于，該方法利用萬.coliRosetta (DE3)表達含有較多大腸桿菌稀有密碼子的莢膜紅細菌基因。
2.根據權利要求1所述的莢膜紅細菌基因的胞內高活性表達，其特征在于，該方法包括以下步驟: (O從莢膜紅細菌的菌液中提取總基因組DNA ； (2)PCR擴增ALA合成酶基因hetnk ； (3)采用雙酶切法，將擴增得到的ALA合成酶基因與質粒pET28a連接，并轉化至DH5α，篩選得到含有重組質粒pET28a-R.C.hemk的陽性克??； (4)將重組質粒pET28a-R.C.A￡?A轉化至宿主菌Rosetta(DE3)中，篩選得到工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemk ; (5)發(fā)酵培養(yǎng)工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.使其胞內高活性表達莢膜紅細菌hemk基因。
【文檔編號】C12N15/54GK103468736SQ201310449211
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權日:2013年9月27日
【發(fā)明者】林建平, 漏佳偉, 朱力, 吳綿斌, 楊立榮, 岑沛霖 申請人:浙江大學