一種用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法及其應(yīng)用，選取MyoD1基因作為影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的候選基因，利用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)阿勒泰羊品種中MyoD1基因的遺傳結(jié)構(gòu)，分析和判斷其與綿羊產(chǎn)肉量的相關(guān)關(guān)系，通過綿羊MyoD1基因的DNA序列，自行設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)新疆阿勒泰羊MyoD1基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并與產(chǎn)肉性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，從而找出與阿勒泰羊產(chǎn)肉量顯著相關(guān)的分子標(biāo)記，本發(fā)明用以提高阿勒泰羊的產(chǎn)肉性能，從而大大加快提高恢復(fù)阿勒泰羊優(yōu)良產(chǎn)肉性能的速度，這對(duì)于提高農(nóng)牧民經(jīng)濟(jì)收入、加快新疆肉羊業(yè)的發(fā)展具有重要意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法及其應(yīng)用
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物分子遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的涉及利用分子生物技術(shù)尋找影響新疆阿勒泰羊產(chǎn)肉量性狀的有效分子標(biāo)記，進(jìn)而應(yīng)用于提高阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]新疆是我國(guó)主要牧區(qū)之一，具有豐富的綿羊品種資源，其中阿勒泰羊以體格大、肉脂生產(chǎn)性能高而著稱，具有耐粗飼、善跋涉、抗嚴(yán)寒、體質(zhì)堅(jiān)實(shí)、適宜放牧等特點(diǎn)，是新疆地方優(yōu)良肉羊品種。但新疆阿勒泰地區(qū)少數(shù)民族占絕大部分，冬季長(zhǎng)達(dá)近半年，且最冷可達(dá)-35--40°C，由于自然條件惡劣，許多優(yōu)良品種在這里無法生存。而阿勒泰羊就是在這樣一個(gè)特殊的條件下，通過長(zhǎng)期的自然和人工選擇而形成的，即適應(yīng)于當(dāng)?shù)貤l件，又有較高產(chǎn)肉性能的綿羊品種，其活重最高可達(dá)171千克，屠宰率達(dá)49-50%。此外，阿勒泰羊肉質(zhì)鮮美，且由于其放牧草場(chǎng)天然無污染，可通過阿勒泰羊生產(chǎn)有機(jī)羊肉，打入高端市場(chǎng)，以此來增加當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民的經(jīng)濟(jì)水平，進(jìn)而提高和改善生活水平?？梢?，阿勒泰羊是當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民主要的食用肉羊和養(yǎng)殖家畜，既是生活資料又是生產(chǎn)資料。由于新疆地區(qū)少數(shù)民族的傳統(tǒng)習(xí)慣和宗教信仰，對(duì)于羊肉的需求量極大，近年來羊肉價(jià)格居高不下。因此，具有優(yōu)良產(chǎn)肉性能且深受當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民喜愛的阿勒泰羊，對(duì)于解決新疆羊肉供不應(yīng)求、少數(shù)民族生活安定小康具有重要意義。
[0003]阿勒泰羊作為地方優(yōu)良品種，具有其獨(dú)特性，應(yīng)做好品種資源的有效保護(hù)，但由于近年來長(zhǎng)期未經(jīng)選育提高，其優(yōu)良產(chǎn)肉特性沒有得到合理的開發(fā)利用，極大地不利于當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)和新疆肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0004]目前，運(yùn)用先進(jìn)技術(shù)`手段，結(jié)合現(xiàn)代育種技術(shù)和傳統(tǒng)育種方法，發(fā)展新疆優(yōu)勢(shì)特色畜牧業(yè)，提高綿羊良種化程度，培育肉羊?qū)ｉT化品種，提高羊肉生產(chǎn)水平，是加快新疆綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的有效手段。
[0005]綿羊的產(chǎn)肉量屬于經(jīng)濟(jì)性狀?，F(xiàn)代育種技術(shù)中，利用候選基因策略，可大幅度提高重要經(jīng)濟(jì)性狀選育的效率。所謂候選基因策略就是從生理、生化角度考慮，把一些功能基因作為影響相應(yīng)生產(chǎn)性狀差異的候選基因，再在候選基因中尋找與性狀表型變異相關(guān)的DNA信息作為標(biāo)記，間接作為早期選種的依據(jù)，用于品種改良或新品種選育的方法。我國(guó)四川省皮肉兼用型山羊新品種南江黃羊就是采用分子育種方法，僅用了 8年時(shí)間就育成的品種。
[0006]肌肉的生長(zhǎng)需要成肌細(xì)胞的增殖和分化，因此動(dòng)物的產(chǎn)肉力與肌纖維細(xì)胞的數(shù)量和生長(zhǎng)密切相關(guān)。有研究表明，生肌決定因子(Myogenic Determination gene,MyoD)家族是肌肉生成過程中參與分子調(diào)節(jié)控制作用的一個(gè)重要基因家族，可啟動(dòng)和維持骨骼肌細(xì)胞分化發(fā)育和生長(zhǎng)、激活靜止?fàn)顟B(tài)的肌肉特有基因與肌肉特有的增強(qiáng)子結(jié)合共同促進(jìn)轉(zhuǎn)錄、促使某些細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞分化，與肌細(xì)胞的生成、動(dòng)物的產(chǎn)肉量密切相關(guān)?，F(xiàn)有技術(shù)記載了生肌決定因子(MyoD)包括 4 個(gè)基因:MyoDl (MyoD 或 myf3)、Myogenin (MyoG 或 Myf4)、Myf5> Myf-6(herculin 或 MRF4)。[0007]目前，在國(guó)內(nèi)外未見到利用候選基因策略對(duì)阿勒泰羊產(chǎn)肉性狀進(jìn)行選育提高的研究和報(bào)道，完全屬于空白。此外，對(duì)于將MyoDl基因作為影響家畜生產(chǎn)性能候選基因，開展相關(guān)研究的報(bào)道多見于山羊、牛及豬中，在綿羊中未見報(bào)道，在阿勒泰羊類中應(yīng)用研究完全未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中未見報(bào)道專門針對(duì)阿勒泰羊產(chǎn)肉量顯著相關(guān)的分子標(biāo)記研究的技術(shù)現(xiàn)狀。本發(fā)明旨在為了提供了一種利用分子標(biāo)記技術(shù)尋找影響新疆阿勒泰羊產(chǎn)肉量有效分子標(biāo)記的方法，用于選育提高阿勒泰羊產(chǎn)肉性能。[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案:采用候選基因策略，選取MyoDl基因作為影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的候選基因，利用分子標(biāo)記技術(shù)PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism,單鏈構(gòu)象多態(tài)性)檢測(cè)阿勒泰羊品種中MyoDl基因的遺傳結(jié)構(gòu)，從分子水平上，科學(xué)分析和判斷其與綿羊產(chǎn)肉量的相關(guān)關(guān)系，通過綿羊MyoDl基因的DNA序列(GenBank登錄號(hào):ΝΜ_001009390)，借助公知軟件Primer5.0自行設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)新疆阿勒泰羊MyoDl基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并與產(chǎn)肉性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，從而找出與阿勒泰羊產(chǎn)肉量顯著相關(guān)的分子標(biāo)記，用以提高阿勒泰羊的產(chǎn)肉性能，從而大大加快提高恢復(fù)阿勒泰羊優(yōu)良產(chǎn)肉性能的速度，這對(duì)于提高農(nóng)牧民經(jīng)濟(jì)收入、加快新疆肉羊業(yè)的發(fā)展具有重要意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0010]本發(fā)明提供了一種用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法，具體方法步驟如下:
[0011 ] (I)找出阿勒泰羊品種中MyoDl基因的突變堿基:根據(jù)綿羊MyoDl基因的DNA序列，自行設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，應(yīng)用PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism,單鏈構(gòu)象多態(tài)性)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide GelElectrophoresis, PAGE)技術(shù),檢測(cè)阿勒泰羊品種中MyoDl基因特異性擴(kuò)增片段的遺傳結(jié)構(gòu)和多態(tài)性，篩選出具有多態(tài)性的基因片段，即該基因片段存在多種基因型，并經(jīng)過DNA測(cè)序，找出導(dǎo)致基因擴(kuò)增片段出現(xiàn)多種基因型的突變堿基。
[0012](2)進(jìn)行突變堿基與阿勒泰羊產(chǎn)肉量的關(guān)聯(lián)分析，確定影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的DNA分子標(biāo)記并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，研究阿勒泰羊中多態(tài)基因不同基因型間產(chǎn)肉量的差異，由此判斷該基因能否作為影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的DNA分子標(biāo)記；經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，P < 0.01時(shí)差異極顯著；P < 0.05時(shí)差異顯著；P > 0.05時(shí)差異不顯著；若差異顯著或極顯著，則說明導(dǎo)致基因擴(kuò)增片段出現(xiàn)多種基因型的突變堿基是顯著影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的基因突變位點(diǎn)，該多態(tài)基因可作為影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的DNA分子標(biāo)記。
[0013]具體的，本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)提供了一種用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法，其具體方法步驟如下:
[0014](I)阿勒泰羊基因組DNA提取:采集阿勒泰羊血樣5ml，提取DNA，在-20°C保存；
0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)溴化已錠染色后，于凝膠成像儀紫外燈下照射，觀察條帶的大小和亮度，判斷DNA的提取質(zhì)量。
[0015](2)阿勒泰羊MyoDl基因特異性引物設(shè)計(jì):利用綿羊MyoDl基因的DNA序列(GenBank登錄號(hào):ΝΜ_001009390)，自行人工設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，兩對(duì)特異性引物序列分別為:
[0016]引物1:
[0017]上游引物F:5' -CCGCTGTTTACTGTGGG-3'
[0018]下游引物R:5' -GCTGGTTTGGGTTGCT-3'
[0019]引物2:
[0020]上游引物F: 5' -AGCAACCCAAACCAGC-3'
[0021 ]下游引物 R: 5' ATGCCGTCGGAACAGT-3'
[0022](3)阿勒泰羊MyoDl基因的PCR擴(kuò)增:根據(jù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物，特異性擴(kuò)增阿勒泰羊MyoDl基因的兩個(gè)片段；PCR反應(yīng)體系為:Mi x 10.0 μ 1，上下游引物各0.4 μ 1，DNA模板
1.5 μ 1，加水至總體積20 μ I ;反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、退火溫度30s、72°C延伸lmin，循環(huán)31次，72°C延伸5mi n，4°C保存；特異性擴(kuò)增的兩個(gè)PCR產(chǎn)物均由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)溴化已錠染色后，于凝膠成像儀紫外燈下照射，觀察擴(kuò)增帶的大小和亮度，判斷PCR產(chǎn)物擴(kuò)增質(zhì)量。
[0023](4) SSCP檢測(cè):分別對(duì)阿勒泰羊MyoDl基因的兩個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)，篩選具有多態(tài)性的PCR擴(kuò)增片段；取3 μ I PCR產(chǎn)物與7 μ I的98%去離子甲酰胺的變性劑混合，98°C變性IOmin后冰浴lOmin，使之保持變性狀態(tài)；變性后PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯凝膠(polyacrylamide gel,PAG) 180V電泳20h,銀染顯色后，于凝膠成像儀白光下照射,觀察條帶的大小，判斷有無多態(tài)性，有多態(tài)的判斷基因型。
`[0024](5) DNA測(cè)序，找出阿勒泰羊MyoDl基因突變位點(diǎn)；對(duì)于SSCP檢測(cè)中具有多態(tài)性的基因，將其不同基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，用以判斷突變堿基和位點(diǎn)。
[0025](6)突變堿基與阿勒泰羊產(chǎn)肉量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確定影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的DNA分子標(biāo)記，并對(duì)阿勒泰羊中多態(tài)基因不同基因型間的個(gè)體體重進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，P < 0.01時(shí)差異極顯著；P < 0.05時(shí)差異顯著；P > 0.05時(shí)差異不顯著；若差異顯著或極顯著，則說明導(dǎo)致基因擴(kuò)增片段出現(xiàn)多種基因型的突變堿基是顯著影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的基因突變位點(diǎn)，該多態(tài)基因可作為影響決定阿勒泰羊產(chǎn)肉量的DNA分子標(biāo)記。
[0026]同時(shí)，本發(fā)明提供用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法在提高阿勒泰羊的產(chǎn)肉性能中的應(yīng)用，對(duì)于基因型為TT或TC的阿勒泰羊個(gè)體，可淘汰；對(duì)于基因型為CC的阿勒泰羊個(gè)體，可留用，以此來選育提高新疆阿勒泰羊的產(chǎn)肉量。
[0027]本發(fā)明中，在確定影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的DNA分子標(biāo)記中，利用公知生物學(xué)分析軟件SPSS17.0，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。
[0028]本發(fā)明中，應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism,單鏈構(gòu)象多態(tài)性)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide GelElectrophoresis, PAGE)技術(shù)都為本領(lǐng)域公知技術(shù)手段,為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員采用的常見技術(shù)手段。
[0029]本發(fā)明中，阿勒泰羊MyoDl基因特異性引物設(shè)計(jì)中，通過國(guó)際分子生物信息網(wǎng)站 NCBI (National Center for Biotechnology),檢索得到綿羊 MyoDl 基因的 DNA 序列(GenBank登錄號(hào):NM_001009390)，借助公知軟件Pr imer5.0,自行人工設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，引物序列自行送相關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)行合成。
[0030]通過實(shí)施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下有益效果:[0031](I)本發(fā)明中，雖然如上所述，在構(gòu)建一種用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法中，采用的技術(shù)步驟中涉及到利用公知生物學(xué)分析軟件SPSS17.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù) PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism,單鏈構(gòu)象多態(tài)性)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)技術(shù),借助公知軟件Pr imer5.0中，這些技術(shù)手段盡管都是本領(lǐng)域可見的技術(shù)手段，但是對(duì)于選用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行一優(yōu)化組合設(shè)計(jì)，在利用候選基因策略對(duì)阿勒泰羊產(chǎn)肉性狀進(jìn)行選育提高的研究國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，采用現(xiàn)有技術(shù)中MyoDl基因作為影響家畜生產(chǎn)性能候選基因，對(duì)于適用綿羊，特別是適用阿勒泰羊類肉性狀進(jìn)行選育提高方面的技術(shù)未見報(bào)道，由于阿勒泰羊種地處常年低溫，冬季長(zhǎng)達(dá)近半年，且最冷可達(dá)-35--40°C，由于自然條件惡劣，許多優(yōu)良品種在這里無法生存，而阿勒泰羊就是在這樣一個(gè)特殊的條件下，通過長(zhǎng)期的自然和人工選擇而形成的，可見，本發(fā)明提供的用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法，對(duì)于選育提高阿勒泰羊產(chǎn)肉性能具有重大而深遠(yuǎn)的技術(shù)貢獻(xiàn)和現(xiàn)實(shí)作用。
[0032](2)本發(fā)明通過具體提供一種用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法及其應(yīng)用，利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)新疆阿勒泰羊MyoDl基因的兩個(gè)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并與產(chǎn)肉性狀(體重)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而找出與阿勒泰羊產(chǎn)肉量顯著相關(guān)的DNA分子標(biāo)記，確定淘汰基因型為TT或TC的阿勒泰羊個(gè)體，留用基因型為CC的阿勒泰羊個(gè)體，用以提高阿勒泰羊的產(chǎn)肉性能，以此來選育提高新疆阿勒泰羊的產(chǎn)肉量，這不僅填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外這一研究領(lǐng)域的技術(shù)空白，而且對(duì)于保護(hù)阿勒泰羊這一優(yōu)良品種資源、提高農(nóng)牧民經(jīng)濟(jì)收入、加快新疆肉羊業(yè)發(fā)展具有重要意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，圖a、b中，M為DL2000DNA Ma rke r,泳道1-10為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0034]圖2為8 %聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，圖中，泳道2、3、5、6、8、9判定為TT基因型，泳道1、7判定為TC基因型，泳道4判定為CC基因型。
[0035]圖3為DNA測(cè)序結(jié)果對(duì)比圖，圖中，阿勒泰羊MyoDI基因存在一個(gè)堿基突變T706C。【具體實(shí)施方式】
[0036]下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明中的設(shè)備和材料有:
[0037]采用的主要原材料及相關(guān)試劑等:三羥甲基氨基甲烷(即Tris-base)由莊盟生物(BG05S)提供；2XTaq PCR MasterMix 由博邁德生物(PC0912)提供；DL2000DNA Marker 由莊盟生物(ZM404-1)提供；EB由新疆寶信提供。
[0038]主要儀器設(shè)備:TG16_W微量高速離心機(jī)產(chǎn)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYCZ-24F型電泳槽和DYY-6C型電泳儀產(chǎn)自北京市六一儀器廠；AL204_IC電子天平產(chǎn)自梅特勒-托勒多儀器廠(上海)有限公司JY04S凝膠成像儀產(chǎn)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；恒溫箱恒溫水浴振蕩器產(chǎn)自北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所。
[0039]本發(fā)明中選用的所有原輔材料、試劑和儀器、設(shè)備都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。
[0040]實(shí)施例一:篩選與阿勒泰羊產(chǎn)肉量顯著相關(guān)DNA分子標(biāo)記的方法
[0041]用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法，利用PCR-SSCP技術(shù)篩選與阿勒泰羊產(chǎn)肉量顯著相關(guān)DNA分子標(biāo)記的方法，主要的發(fā)明點(diǎn)如下:
[0042]一、基因組DNA提取
[0043]采集待測(cè)阿勒泰羊頸靜脈血液5ml，枸櫞酸鈉抗凝，-20°C保存；
[0044]參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，-20°C保存。
[0045]配制0.8%瓊脂糖凝膠:瓊脂糖0.8g，溶于100ml0.5 X TBE，微波爐加熱至充分溶解，待降至室溫后倒入插有梳子的膠槽內(nèi)，冷卻凝固后待用。
[0046]利用配制的0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電壓100V，電流50mA，電泳30分鐘。經(jīng)溴化已錠染色15分鐘后，于凝膠成像儀紫外燈下照射，觀察條帶的大小和亮度，判斷DNA的提取質(zhì)量。
[0047]二、PCR 擴(kuò)增
[0048](I)引物設(shè)計(jì)及合成
[0049]根據(jù)綿羊MyoDl基因的DNA序列(GenBank登錄號(hào):NM001009390)，利用軟件Primerf.0獨(dú)立設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，特異性擴(kuò)增MyoDl基因，設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物的序列分別為:
[0050]引物I的上游引物序列F:5, -CCGCTGTTTACTGTGGG-3/，引物I的下游引物序列R:5/ -GCTGGTTTGGGTTGCT-3';擴(kuò)增片段大小為 155bp。
[0051]弓丨物2的上游引物序列F-.51 -AGCAACCCAAACCAGC-3'，引物2的下游引物序列R:5' -ATGCCGTCGGAACAGT-3'，擴(kuò)增片段大小為 218bp。
[0052]⑵PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序優(yōu)化
[0053]根據(jù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物，特異性擴(kuò)增阿勒泰羊MyoDl基因的兩個(gè)片段。PCR反應(yīng)體系為:Mixl0.0 μ I,上下游引物各0.4 μ I, DNA模板1.5 μ I,加水至總體積20 μ I ;反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、退火溫度30s、72°C延伸lmin，循環(huán)31次，72°C延伸5min，4°C 保存。
[0054]對(duì)兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。在其他反應(yīng)條件不變的情況下，在PCR儀上對(duì)退火溫度設(shè)置梯度，梯度范圍為50°C -60°C，即平均每個(gè)板孔變化溫度為1°C。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察擴(kuò)增條帶的亮度和純度，最終確定引物I的最適退火溫度為52°C，引物2的最適退火溫度為54°C。
[0055]特異性擴(kuò)增的兩組PCR產(chǎn)物均由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓100V，電泳30min,經(jīng)溴化已錠EB染色15min后，于Bio-RAD凝膠成像儀紫外燈下照射,觀察擴(kuò)增條帶的大小和亮度，判斷PCR產(chǎn)物擴(kuò)增質(zhì)量。結(jié)果參見附圖1，附圖1由圖a、b組成，附圖1中圖a反映了 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增質(zhì)量較好的情形。
[0056]三、SSCP檢測(cè)
[0057](1)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制
[0058]配制2板膠:30%丙烯酰胺溶液26.6ml，5XTBE20ml，10%AP700y l,TEMED66y 1，蒸餾水52.8ml。攪拌均勻后勻速灌入制膠器，并插入梳子，待膠凝固后，緩緩拔出梳子。
[0059](2) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性
[0060]取3μ I PCR產(chǎn)物，加入7μ I變性緩沖液，95%甲酰胺、10mmol/L EDTA、0.05%溴酚蘭、0.05%二甲苯青，瞬時(shí)離心后，在PCR儀中98°C變性lOmin，取出后立即置于冰上，IOmin后全部上樣。
[0061](3)聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0062]將適量0.5XTBE緩沖液加入上下槽，用注射器將產(chǎn)生的氣泡趕出，并沖洗點(diǎn)樣孔；按正負(fù)極合上電泳槽蓋，預(yù)電泳30min后，用微量進(jìn)樣器吸取變性后的PCR產(chǎn)物加入點(diǎn)樣孔；點(diǎn)樣完成后，電壓180V，電流50mA，電泳20h。
[0063](4)染色、顯色:
[0064]從電泳槽中取出凝膠，用蒸餾水漂洗2次后，加入染色液(0.1 %硝酸銀)250ml，放于搖床避光輕輕搖15min，倒出染色液；
[0065]加入顯色液(2%氫氧化鈉+0.1 %甲醛)250ml，浸沒凝膠，邊搖邊觀察，直到凝膠上顯現(xiàn)電泳帶；倒出顯色液，迅速用去離子水沖洗2~3次；
[0066]Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)成像，根據(jù)條帶數(shù)量和位置進(jìn)行基因判型。結(jié)果表明，引物I擴(kuò)增的基因片段存在多態(tài)性，具有三種基因型:TT、TC和CC，結(jié)果參見附圖2 ;引物2擴(kuò)增的基因片段不具有多態(tài)性。
[0067]四、DNA測(cè)序
[0068]選取引物I擴(kuò)增基因片段中不同基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物40 μ 1，送往上海生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，利用DN A MAN軟件分析對(duì)比DNA序列，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)706T/C，結(jié)果參見附圖3。
[0069]五、關(guān)聯(lián)分析
[0070]利用軟件SPSS17.0，對(duì)不同基因型間的平均體重(kg)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如下表1:
[0071]表1:不同基因型間的平均體重(kg)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)表
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法，其特征在于，具體方法步驟如下: (1)阿勒泰羊基因組DNA提取:采集阿勒泰羊血樣5ml，提取DNA，在_20°C保存；0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)溴化已錠染色后，于凝膠成像儀紫外燈下照射，觀察條帶的大小和亮度，判斷DNA的提取質(zhì)量； (2)阿勒泰羊MyoDl基因特異性引物設(shè)計(jì):利用綿羊MyoDl基因的DNA序列(GenBank登錄號(hào):NM_001009390)，自行人工設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，兩對(duì)特異性引物序列分別為: 引物1: 上游引物 F: 5' -CCGCTGTTTACTGTGGG-3'；
下游引物 R: 5' -GCTGGTTTGGGTTGCT-3'； 引物2:
上游引物 F: 5' -AGCAACCCAAACCAGC-3' 下游引物 R: 5' -ATGCCGTCGGAACAGT-3'； (3)阿勒泰羊MyoDl基因的PCR擴(kuò)增:根據(jù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物，特異性擴(kuò)增阿勒泰羊MyoDl基因的兩個(gè)片段；PCR反應(yīng)體系為:Mi xl0.0 μ 1，上下游引物各0.4 μ 1，DNA模板1.5 μ 1，加水至總體積20 μ I ;反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5mi n，94°C變性30s、退火溫度30s、72°C延伸Imi n，循環(huán)31次，72°C延伸5mi n，4°C保存；特異性擴(kuò)增的兩個(gè)PCR產(chǎn)物均由I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)溴化已錠染色后，于凝膠成像儀紫外燈下照射，觀察擴(kuò)增帶的大小和亮度，判斷PCR產(chǎn)物擴(kuò)增質(zhì)量； (4)SSCP檢測(cè):分別對(duì)阿勒泰羊MyoDl基因的兩個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)，篩選具有多態(tài)性的PCR擴(kuò)增片段；取311 I PCR產(chǎn)物與7μ I的98%去離子甲酰胺的變性劑混合，98°C變性IOmin后冰浴lOmin，使之保持變性狀態(tài)；變性后PCR產(chǎn)物用8 %非變性聚丙烯凝膠(polyacrylamide gel, PAG) 180V電泳20h,銀染顯色后，于凝膠成像儀白光下照射,觀察條帶的大小，判斷有無多態(tài)性，有多態(tài)的判斷基因型； (5)DNA測(cè)序，找出阿勒泰羊MyoDl基因突變位點(diǎn)；對(duì)于SSCP檢測(cè)中具有多態(tài)性的基因，將其不同基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，用以判斷突變堿基和位點(diǎn)； (6)突變堿基與阿勒泰羊產(chǎn)肉量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確定影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的DNA分子標(biāo)記，并對(duì)阿勒泰羊中多態(tài)基因不同基因型間的個(gè)體體重進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，P <0.01時(shí)差異極顯著；P < 0.05時(shí)差異顯著；P > 0.05時(shí)差異不顯著；若差異顯著或極顯著，則說明導(dǎo)致基因擴(kuò)增片段出現(xiàn)多種基因型的突變堿基是顯著影響阿勒泰羊產(chǎn)肉量的基因突變位點(diǎn)，該多態(tài)基因可作為影響決定阿勒泰羊產(chǎn)肉量的DNA分子標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的用于選育阿勒泰羊產(chǎn)肉性能的分子標(biāo)記方法在提高阿勒泰羊的產(chǎn)肉性能中的應(yīng)用，其特征在于，淘汰基因型為TT或TC的阿勒泰羊個(gè)體，留用基因型為CC的阿勒泰羊個(gè)體，以此來選育提高新疆阿勒泰羊的產(chǎn)肉量。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525920SQ201310450634
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】劉武軍, 王瓊, 邵勇鋼, 劉玲玲, 馬海玉, 于茜 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)