二次酶解制備幾丁聚糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種二次酶解制備幾丁聚糖的方法，包括如下步驟：將蟹殼或蝦殼干燥、粉碎；二次脫鈣和脫蛋白；酶解脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。本發(fā)明的酶解工藝與現(xiàn)有技術(shù)制相比，二次脫鈣與脫蛋白，并且第二次脫鈣與脫蛋白在在同一步驟中實(shí)現(xiàn)，大大提高生產(chǎn)效率；采用酶解脫乙酰，減少強(qiáng)堿用量，耗能低，無污染，更加環(huán)保。
【專利說明】二次酶解制備幾丁聚糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及幾丁聚糖制備方法，屬于制造領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]甲殼素是一種天然含氮多糖物質(zhì)，廣泛存在與無脊椎動(dòng)物的外殼或角質(zhì)層中，尤其是蝦蟹類的外殼中。甲殼素很容易獲得，可再生，是僅次于纖維素的天然均聚物，但是因分子內(nèi)部有很強(qiáng)的氫鍵作用，溶解性低，應(yīng)用范圍受到限制。
[0003]甲殼素脫乙酰后生成殼聚糖。目前殼聚糖的制備多采用化學(xué)法和酶解法脫乙酰。化學(xué)法脫乙酰反應(yīng)中，影響脫乙酰的因素很多，但是主要影響因素包括:堿液濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間。一般來說，提高反應(yīng)溫度和延長反應(yīng)時(shí)間均可提高脫乙酰度，但是會(huì)導(dǎo)致甲殼素主鏈降解增加，從而影響產(chǎn)品的粘度和分子量。通入氮?dú)饪梢栽谝欢ǔ潭壬蠝p緩主鏈的降解。由于化學(xué)法使用的堿液濃度高，反應(yīng)時(shí)間長，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，環(huán)境污染嚴(yán)重。
[0004]酶解法不會(huì)降解主鏈，并且無污染，具有重要的研究開發(fā)價(jià)值。影響酶解的因素很多，主要包括PH值和溫度。文獻(xiàn)記載最適宜PH值4-8，最適宜溫度30-70°C (《甲殼酶特性與應(yīng)用研究》萬云洋等《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》2003 vol 15 N0.6)。迄今為止發(fā)現(xiàn)的真菌甲殼質(zhì)脫乙酰酶(CDA)都是糖蛋白，且有良好的熱穩(wěn)定性。但是不同來源CDA的存在位置、最適宜PH值(PH4.5-12)、碳水化合物含量、相對(duì)分子質(zhì)量及離子影響等有較大的差異。
[0005]迄今報(bào)道的CDA基本都來源于真菌。真菌來源的CDA主要作用是自身細(xì)胞壁的合成，最適底物一般為甲殼寡糖，對(duì)甲殼質(zhì)的活性較低，不適合用酶法脫乙酰生產(chǎn)殼聚糖。真菌來源的CDA來源廣泛，獲取容易，成本相對(duì)較低。因此如何能夠?qū)⒄婢鷣碓吹腃DA用于制備殼聚糖成為本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種新的幾丁聚糖制備方法，所述的方法能夠較現(xiàn)有技術(shù)更節(jié)能環(huán)保。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種用真菌來源的CDA制備幾丁聚糖的方法，所述的方法能夠解決現(xiàn)有技術(shù)CDA不適于生產(chǎn)幾丁聚糖的技術(shù)難題。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種安全的幾丁聚糖制備方法，所述的方法制得的幾丁聚糖無強(qiáng)酸或強(qiáng)堿殘留，產(chǎn)品更安全。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供一種具有市場競爭力的幾丁聚糖，所述的產(chǎn)品不因工藝的改進(jìn)而增加生產(chǎn)成本。
[0010]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
干燥粉碎、檸檬酸酸脫鈣；氫氧化鈉脫蛋白；酶解脫蛋白；甲殼質(zhì)脫乙酰酶脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。
[0011] 本發(fā)明采用制備方法對(duì)脫鈣前的蟹殼或蝦殼進(jìn)行預(yù)處理，然后再進(jìn)行脫鈣和脫蛋白。
[0012]為增強(qiáng)脫鈣和脫蛋白效果，本發(fā)明優(yōu)選的將蟹殼或蝦殼粉碎至25~40 μ m顆粒，顆粒過小則增加生產(chǎn)成本，顆粒過大效果較差。發(fā)明人經(jīng)過多次試驗(yàn)及經(jīng)驗(yàn)，最終確定25~40 μ m顆粒范圍達(dá)到脫鈣和成本的最佳性價(jià)比。
[0013]本發(fā)明粉碎后的原料加入4-8倍重量體積比的水制成料液，再加入10~15%檸檬酸酸，充分反應(yīng)后，過濾，水洗至中性，留取殘?jiān)?。殘?jiān)屑尤?~15%氫氧化鈉溶液，SO-1OO0C，l-3h，水洗至中性，過濾，留取殘?jiān)?br> [0014]本發(fā)明的酶解采用菠蘿蛋白酶較其他蛋白酶具有更好的酶解效果。當(dāng)然，選用其他蛋白酶進(jìn)行酶解也能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明工藝中最佳酶解方案是將第一次脫蛋白后的殘?jiān)屑尤?-8倍重量體積比的水，再加入菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至5.5~
6.5,40~60°C攪拌I~2h ;分離液體，殘?jiān)俅沃貜?fù)提取。
[0015]酶解殼料所用的蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.05~0.2%為佳。
[0016]酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘?jiān)?，殘?jiān)礊榧讱べ|(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) I~3:1~6，0.2MPa, 30 ~32°C，48 ~72h, 120°C，20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0017]所述的可以從公開市場上購得，也可以通過構(gòu)巢曲霉菌發(fā)酵后制得。
[0018]所述的甲殼質(zhì)脫乙酰酶制備方法如下:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接入構(gòu)巢曲霉菌，30~35°C，PH6.0~7.0，72~96h。
[0019]經(jīng)過二次脫鈣和脫蛋白后，去除了原料中的鈣離子、蛋白質(zhì)其它有機(jī)物質(zhì)。
[0020]本發(fā)明所述的幾丁聚糖脫乙酰度高達(dá)95%以上。
[0021]本發(fā)明的產(chǎn)物與任何一種或一種以上藥劑學(xué)上輔料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甘氨酸等混合制成的各種劑型，例如，可制成片齊?、緩釋片、滴丸、顆粒齊?、膠囊齊?、微粒劑。優(yōu)選劑型為膠囊劑或顆粒劑。
[0022]本發(fā)明的酶解工藝與現(xiàn)有技術(shù)制相比，二次脫鈣與脫蛋白，并且第二次脫鈣與脫蛋白在在同一步驟中實(shí)現(xiàn)，大大提高生產(chǎn)效率；采用酶解脫乙酰，減少強(qiáng)堿用量，耗能低，無污染，更加環(huán)保。

【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1
制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，35°C，PH6.0,發(fā)酵72h。
[0024]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至25 μ m顆粒，加入4倍重量體積比的水制成料液，料液中加入10%檸檬酸酸，充分反應(yīng)后，過濾，水洗至中性，留取殘?jiān)?。殘?jiān)屑尤?%氫氧化鈉溶液，80°C，Ih，過濾水洗至中性。
[0025]將第一次脫蛋白后的殘?jiān)屑尤?倍重量體積比的水，再加入占?xì)ち现亓勘葹?.05%菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至5.5，40°C攪拌Ih ;分離液體，殘?jiān)俅沃貜?fù)提取。
[0026]酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘?jiān)瑲堅(jiān)礊榧讱べ|(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) 1:1,0.2MPa，30°C，48h，120°C，20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0027]實(shí)施例2 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，30°C，PH7.0，72h。
[0028]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至40 μ m顆粒，加入8倍重量體積比的水制成料液，料液中加入15%檸檬酸酸，充分反應(yīng)后，過濾，水洗至中性，留取殘?jiān)?。殘?jiān)屑尤?5%氫氧化鈉溶液，100°C，3h，過濾水洗至中性。
[0029]將第一次脫蛋白后的殘?jiān)屑尤?倍重量體積比的水，再加入占?xì)ち现亓勘葹?.2%菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至6.5，60°C攪拌2h ;分離液體，殘?jiān)俅沃貜?fù)提取。
[0030]酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘?jiān)?，殘?jiān)礊榧讱べ|(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) 1: 6,0.2MPa,32°C , 72h, 120°C，20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0031]實(shí)施例3 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，33°C，PH6.5，96h。
[0032]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至25 μ m顆粒，加入8倍重量體積比的水制成料液，料液中加入12%檸檬酸酸，充分反應(yīng)后，過濾，水洗至中性，留取殘?jiān)?。殘?jiān)屑尤?2%氫氧化鈉溶液，90°C，2h，過濾水洗至中性。
[0033]將第一次脫蛋白后的殘?jiān)屑尤?倍重量體積比的水，再加入占?xì)ち现亓勘葹?.1%菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至6，50°C攪拌1.5h ;分離液體，殘?jiān)俅沃貜?fù)提取。
[0034]酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘?jiān)?，殘?jiān)礊榧讱べ|(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) 3: 6,0.2MPa,31°C，72h, 120°C，20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0035]實(shí)施例4 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，32°C，PH6.6，72h。
[0036]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至40 μ m顆粒，加入4倍重量體積比的水制成料液，料液中加入10%檸檬酸酸，充分反應(yīng)后，過濾，水洗至中性，留取殘?jiān)?。殘?jiān)屑尤?5%氫氧化鈉溶液，100°C，lh，過濾水洗至中性。
[0037]將第一次脫蛋白后的殘?jiān)屑尤?倍重量體積比的水，再加入占?xì)ち现亓勘葹?.15%菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至5.5，60°C攪拌Ih ;分離液體，殘?jiān)俅沃貜?fù)提取。
[0038]酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘?jiān)瑲堅(jiān)礊榧讱べ|(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) 1:3,0.2MPa，32°C ,48 ~72h，120°C，20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0039]實(shí)施例5 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，34°C，PH6.l，72h。
[0040]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至30 μ m顆粒，加入6倍重量體積比的水制成料液，料液中加入15%檸檬酸酸，充分反應(yīng)后，過濾，水洗至中性，留取殘?jiān)堅(jiān)屑尤?%氫氧化鈉溶液，80-0C，2h,過濾水洗至中性。
[0041]將第一次脫蛋白后的殘?jiān)屑尤?倍重量體積比的水，再加入占?xì)ち现亓勘葹?.08%菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至6.5，55°C攪拌2h ;分離液體，殘?jiān)俅沃貜?fù)提取。
[0042]酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘?jiān)瑲堅(jiān)礊榧讱べ|(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) 1:5,0.2MPa，31.5°C，64h，120°C，20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0043]實(shí)施例6 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，32°C，PH6.0，80h。
[0044]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至35 μ m顆粒，加入5倍重量體積比的水制成料液，料液中加入11%檸檬酸酸,充分反應(yīng)后,過濾,水洗至中性，留取殘?jiān)?。殘?jiān)屑尤?0%氫氧化鈉溶液，100°C，lh，過濾水洗至中性。
[0045]將第一次脫蛋白后的殘?jiān)屑尤?倍重量體積比的水，再加入占?xì)ち现亓勘葹?.12%菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至6.5，60°C攪拌2h;分離液體，殘?jiān)俅沃貜?fù)提取。
[0046]酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘?jiān)?，殘?jiān)礊榧讱べ|(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) 3:5，0.2MPa，32°C，56h，120°C，20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0047]實(shí)施例7 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，35°C，PH6.0，96h。
[0048]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至40 μ m顆粒，加入7倍重量體積比的水制成料液，料液中加入15%檸檬酸酸，充分反應(yīng)后，過濾，水洗至中性，留取殘?jiān)?。殘?jiān)屑尤?%氫氧化鈉溶液，100°C，lh，過濾水洗至中性。
[0049]將第一次脫蛋白后的殘?jiān)屑尤?倍重量體積比的水，再加入占?xì)ち现亓勘葹?.08%菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至6.5，45°C攪拌1.5h ;分離液體，殘?jiān)俅沃貜?fù)提取。
[0050] 酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘?jiān)?，殘?jiān)礊榧讱べ|(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) 1:3,0.2MPa，30°C , 72h, 120°C，20min，干燥即得幾丁聚糖。
【權(quán)利要求】
1.一種二次酶解制備幾丁聚糖的方法，包括如下步驟: (1)將蟹殼或蝦殼干燥粉碎； (2)第一次脫鈣和脫蛋白； (3)第二次脫鈣和脫蛋白； (4)酶解脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將蟹殼或蝦殼粉碎至0.5~1.0 μ m顆粒大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述的第一次脫鈣是將蟹殼或蝦殼粉碎后的原料中加入4-8倍重量體積比的水制成料液，再加入10~15%檸檬酸酸，充分反應(yīng)后，過濾，留取殘?jiān)?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的第一次脫蛋白是將第一次脫鈣后的殘?jiān)尤?-8倍重量體積比的水，加入8~15%氫氧化鈉溶液，80-100°C，l_3h，水洗至中性，過濾，留取殘?jiān)?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，所述的第二次脫鈣和脫蛋白是將第一次脫蛋白后的殘?jiān)屑尤?-8倍重量體積比的水，再加入菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至5.5~6.5，40~60°C攪拌I~2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，酶解殼料所用的蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.05~0.2%ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的脫乙酰是酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘?jiān)?，加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比I~3:1~6，30~320C，48~72h，0.2MPa, 120°C，20min，干燥即得幾丁聚糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的甲殼質(zhì)脫乙酰酶制備方法如下: (1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 0.01mol/l 的二氯化鈷 10ml，水 100ml ； (2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，30~35°C，PH6.0~7.0，72~96h。
【文檔編號(hào)】C12P19/26GK104046668SQ201310450751
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】郁正剛, 黃永亮, 田志同, 苗勝昆, 李瑩, 楊國元 申請(qǐng)人:天津天獅生物發(fā)展有限公司