一種用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的制作方法
【專利摘要】一種用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)，包括核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)5'端連接的熒光基團(tuán)和與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)3'端連接的淬滅基團(tuán)，其制備方法是：在半導(dǎo)體量子點(diǎn)水溶液中加入連接劑，加入核酸鏈在37℃孵育；再加入NaCl甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后沉淀重懸于去離子水中；加入核黃素水溶液進(jìn)行反應(yīng)即可。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：選用量子點(diǎn)和核黃素作為信標(biāo)中熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體和受體，使自由態(tài)的分子信標(biāo)具有細(xì)胞染色和紅外成像的能力；當(dāng)信標(biāo)分子一旦與靶點(diǎn)結(jié)合，量子點(diǎn)的熒光信號即被恢復(fù)；將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶設(shè)計為分子信標(biāo)的靶點(diǎn)，利用其只在腫瘤細(xì)胞中高效表達(dá)的特點(diǎn)，使該分子信標(biāo)具有癌癥診斷的通用性。
【專利說明】—種用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是一種用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)。
【背景技術(shù)】
[0002]端粒酶活性是人類惡性腫瘤早期診斷的通用標(biāo)志物，這是因為85-95%的各類惡性腫瘤組織中都存在端粒酶的陽性表達(dá)。癌細(xì)胞之所以能夠突破壽命的限制，是因為它們可以合成具有活性的端粒酶，端粒酶能夠?qū)s短的染色體末端進(jìn)行修復(fù)，使癌細(xì)胞無限地分裂。因此可以采用端粒酶靶向探針進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的診斷和標(biāo)識。近年發(fā)展起來的分子信標(biāo)作為一種靶向檢測探針，吸引了許多研究者的注意，分子信標(biāo)是一種具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的熒光核酸探針，自由狀態(tài)時的分子信標(biāo)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此時由于熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)靠得很近，熒光被淬滅；當(dāng)與靶序列結(jié)合后，分子信標(biāo)的空間構(gòu)型發(fā)生改變，熒光恢復(fù)。
[0003]目前，人們對分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)做出了許多改進(jìn)，使其在序列檢測、病原體偵測、藥物療效監(jiān)測、區(qū)分基因野生型和突變型、DNA-蛋白相互作用研究、定量聚合酶鏈擴(kuò)增(PCR)、以及體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA實時檢測等眾多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。如中國專利CN102115784A公開了一種PCR熒光分子信標(biāo)探針技術(shù)定量檢測人類白細(xì)胞抗原B27基因的方法，淬滅基團(tuán)為DABCYL，熒光基團(tuán)為FAM，以HLA-B27基因為檢測目標(biāo)，實現(xiàn)了對HLA-B27基因的快速定量檢測。中國專利CN102154474A也公開了一種用于肺癌診斷的分子信標(biāo)復(fù)合物，包括磁性納米微球以及吸附在磁性納米微球上的分子信標(biāo)，發(fā)光基團(tuán)為Alexa488，淬滅基團(tuán)為BHQI，該發(fā)明克服分子信標(biāo)活體檢測中的假陽性問題，對活細(xì)胞內(nèi)miR-155進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對肺癌的診斷與 鑒別診斷。
[0004]我們已經(jīng)知道人端粒酶主要包括三種成分:人端粒酶RNA成分(humantelomerase RNA template, hTR)、人端粒酶催化亞單位(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)及端粒酶相關(guān)蛋白hTEPl (TPl / TLP1)，其中hTERT是端粒酶活性的決定因素，其基因位于5號染色體短臂末端5pl5.33的單拷貝基因，大小約3.5kb，其mRNA水平與端粒酶活性呈正相關(guān)。本發(fā)明采用量子點(diǎn)作為分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)，設(shè)計了一種用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)，它能與腫瘤細(xì)胞中的hTERT mRNA發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而檢測端粒酶的活性。本發(fā)明的基本思路是選用量子點(diǎn)和核黃素作為信標(biāo)中熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的供體和受體，使自由態(tài)的分子信標(biāo)不具有熒光信號，能用于細(xì)胞染色和成像，通過檢測熒光信號可以追蹤分子信標(biāo)的準(zhǔn)確位置；當(dāng)信標(biāo)與靶點(diǎn)結(jié)合時，信標(biāo)中量子點(diǎn)的熒光信號恢復(fù)，癌變細(xì)胞就會出現(xiàn)閃爍的亮點(diǎn)，實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞成像和早期診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)分析，提供一種操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高的用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)，而且其制備方法簡單、操作方便，可用于端粒酶活性檢測。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:
一種用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)，包括核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)5’端連接的熒光基團(tuán)和與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)3’端連接的淬滅基團(tuán)，所述核酸莖環(huán)結(jié)^5' ccgctggcca cgttcgtgcg g3，[No ID +101 ~+1211, 5’gcgcggg gacccggcggctttccgcgc3' [No ID +154~+180],5’gtggcc cagtgcctgg tgtgcgtgcc ctgggacgc3’ [No ID+185^+2201,5' gtgaccgtgg tttctgtgtg gtgtcac3’「No ID +831~+857],5’eg ccgagaccaagcacttcctc tactcctcag gcg3’ [No ID +1019~+1043],5’gcttcctcag gaacaccaagaagttcatct ccctggggaa gc3’ [No ID +1491~+1532],5’ggtc tttcttttat gtcacggagacc3’ [No ID +1707~+17321,5，ctctttttct accggaagag3，[No ID +1751~+1770],5'ctgcg ggagctgtcg RaagcagS' [No ID +1826~+1847],5’egg cttttgttca gatgccg3’ [NoID +2748~+2767],5’ggtg cggcctgctg ctggataccc ggacc3’ [No ID +2787~+2815],5’gcagagc gactactcca gctatgc3’ [No ID +2824~+2847], 5’ccagtc tcaccttcaaccgcggcttc aaggctgg3，[No ID +2865~+2898],5' ctctgctac tccatcctga aagccaag3’ [NoID +3122~+31481,5’actcagga cagcccagacgcagctgagt3’「No ID +3283~+3301]，5’ ctcccggggacgac gctgactgcc ctggag3’ [No ID +3317~+3350],其中畫線部分均為該核酸鏈中能形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的序列；所述熒光基團(tuán)為TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe或CdSe/CdS、CdSe/ZnSe, CdSe/ZnS、CdS/ZnS核殼結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)材料；所述淬滅基團(tuán)為核黃素，其分子結(jié)構(gòu)如圖2所示，核酸的5’端連接一個熒光基團(tuán)為半導(dǎo)體量子點(diǎn)，3’端連接一個淬滅基團(tuán)為核黃素，其中與核黃素的鏈接有四個位點(diǎn)。
[0007]—種所述用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的制備，步驟如下:
1)在TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS 核殼結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)水溶液中，加入6-馬來酰亞胺基乙酸N-琥珀酸亞胺酯(EMCS)或雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸酯鈉鹽(BS3)連接劑溶液，充分?jǐn)嚢?0-30min后，加入5’端巰基修飾后的核酸鏈，25-40°C溫度下孵育2.5h，得到混合液；
2)在上述混合液中加入NaCl的甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后，沉淀重懸于去離子水中；
3)在上述沉淀重懸的去離子水中加入核黃素水溶液，25-40°C溫度下反應(yīng)2-12h，得到孵育液；
4)在上述孵育液中加入濃度為2ul1X10 - 4mol/L的核酸鏈5’ ggtctccgtgacataaaagaaagacc3’ , 25-40°C溫度下反應(yīng)2.5h,即可制得該量子點(diǎn)_核黃素分子信標(biāo)。
[0008]所述半導(dǎo)體量子點(diǎn)水溶液的濃度為0.5-10mmol/L,連接劑溶液的濃度為
0.5-10mg/mL,核酸鏈溶液的濃度為0.1 X 10—4_1 X 10—4mol/L ;半導(dǎo)體量子點(diǎn)水溶液、連接劑溶液和核酸鏈溶液的體積比為3:1:0.0075。
[0009]所述核黃素水溶液的濃度為0.01-0.15mg/mL。
[0010]所述核黃素水溶液與半導(dǎo)體量子點(diǎn)水溶液的體積比為1:1。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
本發(fā)明所開發(fā)的量子點(diǎn)分子信標(biāo)，是一種快速、高效的癌細(xì)胞端粒酶活性檢測探針，它能從分子水平上對癌變細(xì)胞進(jìn)行特異性熒光標(biāo)記。當(dāng)有靶序列存在時，分子信標(biāo)的環(huán)序列與靶序列特異性結(jié)合，熒光分子與淬滅分子分開，產(chǎn)生可被檢測的425nm熒光信號；當(dāng)靶序列不存在時，分子信標(biāo)呈“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，莖部的熒光分子與淬滅分子接近至7-10nm，產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，量子點(diǎn)發(fā)出的425nm熒光被淬滅分子吸收，此時檢測不到量子點(diǎn)的熒光信號。該分子信標(biāo)可以制備成生物制劑，配以簡單的熒光顯象裝置，就能應(yīng)用到臨床診斷中。量子點(diǎn)分子信標(biāo)是從癌變細(xì)胞生理學(xué)層面上進(jìn)行檢測，這使癌癥診斷提前到了細(xì)胞水平，能爭取更多的治療時間，研究成果具有一定的社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】[0012]圖1為本發(fā)明量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的分子構(gòu)造圖。
[0013]圖2為實施例1中量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的突光發(fā)射光譜。
[0014]圖3為實施例2中量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的突光發(fā)射光譜。
[0015]具體的實施方式 實施例1:
一種用于端粒酶活性檢測的TGA-ZnS: Mn2+量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)，如圖1所示，包括核酸革環(huán)結(jié)構(gòu) 5’gtgaccgtgg tttctgtgtg gtgtcac3’ [No ID +831 ~+857],(其中畫線部分為該核酸鏈中能形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的序列)，與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)5’端連接的突光基團(tuán)TGA-ZnS:Mn2+量子點(diǎn)。以及與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)3’端連接的淬滅基團(tuán)核黃素，其中與核黃素的鏈接有四個位點(diǎn)。
[0016]所述用于端粒酶活性檢測的TGA-ZnS = Mn2+量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的制備，步驟如下:
1)使用中國專利CN103242829A 合成的 TGA-ZnS:Mn2+，在 600 μ L 濃度我 2.5mmol/L的TGA-ZnS = Mn2+量子點(diǎn)水溶液中，TGA-ZnS: Mn2+采用中國專利CN103242829A方法合成，加入200 μ L濃度為0.5mg/mL 6-馬來酰亞胺基乙酸N-琥珀酸亞胺酯連接劑溶液，充分?jǐn)嚢鐸Omin后，加入1.5ul I X 10 - 4mol/L 5’端巰基修飾后的核酸鏈5’ HS (C6) RtRaccRtRRtttctgtgtg gtgtcac3’ [No ID +831 ~+857], 37°C孵育 2.5h,得到混合液；
2)在上述混合液中加入濃度為0.055mol/L的NaCl甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后,沉淀重懸于600ul去離子水中；
3)在上述沉淀重懸的去離子水中加入等體積量的濃度為0.lmg/mL的核黃素水溶液600uL，37°C孵育2h，得到孵育液；
4)在上述孵育液中加入濃度為3.5ul 1X10 —4mol/L的靶核酸5’ gtgacaccacacagaaaccacggtcacG’ , 37°C反應(yīng)2.5h,即可制得該量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)。
[0017]圖2為實施例1中量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的熒光發(fā)射光譜，圖中表明:TGA-ZnSiMn2+量子點(diǎn)的熒光發(fā)射峰為425nm，分子信標(biāo)處于游離態(tài)時，量子點(diǎn)的熒光相對強(qiáng)度從27降至10，這表明量子點(diǎn)與核黃素之間存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，可以作為分子信標(biāo)的能量供體和受體。當(dāng)有靶序列存在時，分子信標(biāo)的環(huán)序列與靶序列特異性結(jié)合，熒光分子與淬滅分子分開，熒光信號恢復(fù)，熒光相對強(qiáng)度從10升至17。
[0018]實施例2:一種用于端粒酶活性檢測的ZnS:Mn2+量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)，如圖1所示，包括核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu) 5’ggtc tttcttttat gtcacggaga cc3’ [No ID +1707~+1732],(其中畫線部分為該核酸鏈中能形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的序列)，與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)5’端連接的熒光基團(tuán)ZnS:Mn2+量子點(diǎn)。以及與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)3’端連接的淬滅基團(tuán)核黃素，其中與核黃素的鏈接有四個位點(diǎn)。
[0019]所述用于端粒酶活性檢測的ZnS =Mn2+量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的制備，步驟如下: 1)在600μ L濃度為8mmol/L ZnS量子點(diǎn)水溶液中，加入200 μ L濃度為2mg/mL的雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸酯鈉鹽，充分?jǐn)嚢?0min后，加入1.5uL濃度為0.5 X 10 -4mol/L 的 5’端巰基修飾后的核酸鏈:5’HS (C6)ggtc tttcttttat gtcacgg aga cc3’ [NoID +1707~+1732]，30°C孵育2.5h，得到混合液；
2)在上述混合液中加入濃度為0.055mol/L的NaCl甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后,沉淀重懸于600ul去離子水中；
3)在上述沉淀重懸的去離子水中加入等體積量的濃度為0.05mg/mL的核黃素水溶液600ul，37°C孵育4h，得到孵育液；
4)在上述孵育液中加入濃度為2ul1X10 - 4mol/L的核酸鏈5’ ggtctccgtgacataaaagaaagacc3’，25°C反應(yīng)2.5h,即可制得該量子點(diǎn)_核黃素分子信標(biāo)。
[0020]圖3為實施例2中量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的熒光發(fā)射光譜，圖中表明:ZnS:Mn2+量子點(diǎn)的突光發(fā)射峰為425nm,分子信標(biāo)處于游尚態(tài)時,量子點(diǎn)與核黃素之間足夠接近，存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，量子點(diǎn)的熒光相對強(qiáng)度從27降至10。當(dāng)有靶序列存在時，分子信標(biāo)的環(huán)序列與靶序列特異性結(jié)合，熒光分子與淬滅分子分開，熒光信號恢復(fù)至17。
【權(quán)利要求】
1.一種用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)，其特征在于:包括核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)5’端連接的熒光基團(tuán)和與核酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)3’端連接的淬滅基團(tuán)，所述核酸某環(huán)結(jié)構(gòu)的序列為5’CCRCtRRCCa CRttCRtRCR g3’[No ID +101~+121],5'gcgcggg gacccggcgg ctttccgcgc3’ [No ID +154~+180],5’gtggcc cagtgcctggtgtgcgtgcc ctgggacgc3’ [No ID +185^+220],5' gtgaccgtgg tttctgtgtg gtgtcac3’ [NoID +831~+857],5’eg ccgagaccaa gcacttcctc tactcctcag gcg3’ [No ID +1019~+1043],5’gcttcctcag gaacaccaag aagttcatct ccctggggaa gc3’ [No ID +1491~+1532],5’ggtctttcttttat gtcacggaga cc3' [No ID +1707^+1732],5' ctctttttct accggaagag3’ [No ID+1751^+17701,5' ctgcg ggagctgtcg gaagcagS' [No ID +1826~+1847],5’egg cttttgttca￡atgccg3' [No ID +2748~+2767],5’ggtg cggcctgctg ctggataccc ggacc3’ [No ID+2787~+2815],5’gcagagc gactactcca gctatgc3’ [No ID +2824~+2847], 5’ccagtctcaccttcaa ccgcggcttc[No ID +2865~+2898],5' ctctgctac tccatcctgaaagccaag3' [No ID +3122^+3148],5’ actcagga cagcccagacgcBgctgagtS' [No ID+3283~+3301], 5，ctcc cggggacgac gctgactgcc ctggag3，[No ID +3317~+3350],其中畫線部分均為該核酸鏈中能形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的序列；所述熒光基團(tuán)為TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe或CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS核殼結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)材料；所述淬滅基團(tuán)為核黃素，其分子結(jié)構(gòu)如圖2所示，核酸的5’端連接一個熒光基團(tuán)為半導(dǎo)體量子點(diǎn)，3’端連接一個淬滅基團(tuán)為核黃素，其中與核黃素的鏈接有四個位點(diǎn)。
2.一種如權(quán)利要求1所述用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的制備，其特征在于步驟如下:
1)在TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS 核殼結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)水溶液 中，加入6-馬來酰亞胺基乙酸N-琥珀酸亞胺酯(EMCS)或雙(硫代琥珀酰亞胺基)辛二酸酯鈉鹽(BS3)連接劑溶液，充分?jǐn)嚢?0-30min后，加入5’端巰基修飾后的核酸鏈，25-40°C溫度下孵育2.5h，得到混合液； 2)在上述混合液中加入NaCl的甲醇溶液，除去過量的連接劑，離心后，沉淀重懸于去離子水中； 3)在上述沉淀重懸的去離子水中加入核黃素水溶液，25-40°C溫度下反應(yīng)2-12h，得到孵育液； 4)在上述孵育液中加入濃度為2ul1X10 - 4mol/L的核酸鏈5’ ggtctccgtgacataaaagaaagacc3’ , 25-40°C溫度下反應(yīng)2.5h,即可制得該量子點(diǎn)_核黃素分子信標(biāo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的制備，其特征在于:所述半導(dǎo)體量子點(diǎn)水溶液的濃度為0.5-lOmmol/L，連接劑溶液的濃度為0.5-10mg/mL,核酸鏈溶液的濃度為0.1 X 10—4_1 X 10—4mol/L ;半導(dǎo)體量子點(diǎn)水溶液、連接劑溶液和核酸鏈溶液的體積比為3:1:0.0075。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的制備，其特征在于:所述核黃素水溶液的濃度為0.01-0.15mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于端粒酶活性檢測的量子點(diǎn)-核黃素分子信標(biāo)的制備，其特征在于:所述核黃素水溶液與半導(dǎo)體量子點(diǎn)水溶液的體積比為1:1。
【文檔編號】C12N15/11GK103497997SQ201310453815
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】應(yīng)明, 劉靜, 沈林燕 申請人:天津理工大學(xué)