一種發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶q10的方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶Q10的方法，具體過程為：1）、優(yōu)選高產(chǎn)菌株：將關(guān)鍵酶基因2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因克隆到光合細菌中并強化表達，得到還原型輔酶Q10高產(chǎn)菌株；2）、發(fā)酵培養(yǎng)并進行代謝調(diào)控：將冷凍保存的光合細菌菌種室溫放置10-12小時后，接種到斜面培養(yǎng)基上，置恒溫培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)20h，再接種到50ml液體活化培養(yǎng)基中，置搖床中35℃培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，然后接種到含100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為15～20ml，35℃搖床培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)速為250r/min；在發(fā)酵培養(yǎng)后24h，添加前體物質(zhì)L-苯丙氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收獲培養(yǎng)物；3）、提取目的產(chǎn)物。該方法能在不產(chǎn)生有毒氣體和工業(yè)廢渣的情況下顯著提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。
【專利說明】一種發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶Q10的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于還原型輔酶QlO生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體提供一種發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]輔酶QlO廣泛存在于生物體內(nèi)，是人體細胞中線粒體的電子傳遞系統(tǒng)的構(gòu)成因子，在氧化磷酸化反應(yīng)中發(fā)揮電子搬運工的作用，由此參與ATP的生成。輔酶QlO分為氧化型和還原型，在生物體內(nèi)，氧化型可以轉(zhuǎn)化為還原型，而還原型的比例隨著年齡和壓力的增加會減少。所以，還原型輔酶QlO的需求比較大。
[0003]還原型輔酶QlO (CoQltlH2)具有防止衰老和疲勞的作用。在動物實驗中，用含0.2%還原型輔酶QlO的餌料，培養(yǎng)出生后I個月的小鼠，連續(xù)喂養(yǎng)，試驗證明其具有抑制老化的作用。而在氧化型輔酶QlO的實驗中沒有發(fā)現(xiàn)這樣的作用。用含0.3%還原型輔酶QlO的餌料，培養(yǎng)出生后13個月的小鼠，連續(xù)喂養(yǎng)，到第19個月發(fā)現(xiàn)它具有抑制聽覺退化的作用。說明在高齡期使用還原型輔酶QlO依然有效果。在抑制光老化的動物實驗中，用含1%還原型輔酶QlO的餌料培養(yǎng)，證明了它具有抑制光老化的作用。還原型輔酶QlO臨床上廣泛用于心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、高血壓、高血脂、糖尿病、重癥肝炎等疾病的治療。
[0004]在人的機體內(nèi)93%是還原型輔酶Q10，7%是氧化型輔酶Q10，起上述2個主要作用的是還原型輔酶Q10。所以生產(chǎn)還原型輔酶QlO是對人體有直接的積極意義，特別是天然的還原型輔酶Q10。但是，由于還原型輔酶QlO容易被分子氧氧化，目前還未見具有工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)還原型輔酶QlO技術(shù)方面的報道。
[0005]目前國內(nèi)外主要有三種工藝制取還原型輔酶:動植物提純、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵。
[0006]化學(xué)合成過程繁雜、危險、成本高。另外，采用化學(xué)合成法時，會產(chǎn)生、混入有安全性隱患的副產(chǎn)物(Z)-異構(gòu)體。
[0007]生物提取法中動植物還原型輔酶QlO含量低，而且各種化學(xué)成分復(fù)雜，并受原料和來源限制，因此成本高，價格昂貴，規(guī)模化生產(chǎn)受到了一定限制。
[0008]發(fā)酵法被認(rèn)為是最有前途的合成工藝，近幾年來微生物發(fā)酵法成為國內(nèi)外開發(fā)的熱點。紅極毛桿菌、脫氧極毛桿菌、甲烷微環(huán)菌等是生產(chǎn)還原型輔酶QlO的主要菌種。
[0009]對于高質(zhì)量還原型輔酶QlO的合成，領(lǐng)先技術(shù)尚屬于日本Kaneka公司，國內(nèi)暫無成熟的適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的技術(shù)，雖然具有還原型輔酶QlO化學(xué)合成、微生物發(fā)酵、動植物提取的專利，但收率不高，因此急需開發(fā)一種高產(chǎn)量的還原型輔酶QlO合成技術(shù)并用于提聞人們的健康水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明意在基因重組構(gòu)建高產(chǎn)發(fā)酵菌株，利用分子生物學(xué)技術(shù)對還原型輔酶QlO發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟進行代謝調(diào)控，最終得到高收率的、可以用于制作成藥品及保健品的還原型輔酶Q10。
[0011]本發(fā)明具體提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，其特征在于，采用發(fā)酵法生產(chǎn)還原型輔酶Q10，其具體過程為:
[0012]I)、優(yōu)選高產(chǎn)菌株
[0013]將關(guān)鍵酶基因克隆到光合細菌中并強化表達，得到還原型輔酶QlO高產(chǎn)菌株，其中關(guān)鍵酶基因為2，3- 二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因；(如不具備條件，可以不通過基因工程技術(shù)來篩選高產(chǎn)菌株，國內(nèi)外用于輔酶QlO發(fā)酵生產(chǎn)的菌株包括十幾種甚至幾十種，篩選高產(chǎn)菌株的空間也比較廣泛)。
[0014]2 )、發(fā)酵培養(yǎng)并進行代謝調(diào)控
[0015]將冷凍保存的光合細菌菌種(即篩選出來的還原型輔酶QlO高產(chǎn)菌株)室溫放置10-12小時后，接種到斜面培養(yǎng)基上，置恒溫培養(yǎng)箱中35°C培養(yǎng)20h，再接種到50ml液體活化培養(yǎng)基中，置搖床中35°C培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，然后接種到含100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為15~20ml，35°C搖床培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)速為250r/min ；
[0016]在發(fā)酵培養(yǎng)后24h (即指數(shù)生長期之前)，添加前體物質(zhì)L-苯丙氨酸(添加量優(yōu)選為lmmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收獲培養(yǎng)物；
[0017]3)、提取目的產(chǎn)物。
[0018]工業(yè)發(fā)酵若想獲得較高目的產(chǎn)物產(chǎn)量，必須突破(或解除)微生物細胞自我調(diào)節(jié)控制機制，最常用且有效的方法就是從遺傳的角度解除微生物正常代謝控制機制的突變株。輔酶QlO發(fā)酵生產(chǎn)的代謝調(diào)控育種基本途徑有:應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株、選育抗反饋調(diào)節(jié)突變株、利用營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株或條件突變株的方法，解除終產(chǎn)物對關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)、構(gòu)建目的工程菌株等。我們最終選擇制備營養(yǎng)缺陷型菌株，將關(guān)鍵酶基因克隆到光合細菌中并強化表達，得到還原型輔酶QlO高產(chǎn)菌株。
[0019]除了構(gòu)建重組菌株提高發(fā)酵產(chǎn)量外，對生產(chǎn)菌的發(fā)酵條件優(yōu)化也是提高發(fā)酵產(chǎn)量的一條重要而有效的途徑，輔酶QlO的微生物合成途徑主要分為芳香環(huán)合成及異戊烯基側(cè)鏈的生物合成路線。根據(jù)芳香環(huán)及異戊烯基側(cè)鏈的生物合成途徑結(jié)合細菌的代謝調(diào)節(jié)機制，本發(fā)明通過分析QlO工業(yè)發(fā)酵高產(chǎn)菌株的選育途徑，最終選擇在指數(shù)生長期之前，即發(fā)酵培養(yǎng)后24h，加入前體物質(zhì)L-苯丙氨酸，用以提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。
[0020]本發(fā)明所述發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，其特征在于:所述斜面培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，瓊脂20g/L，pH6.5。
[0021]所述液體活化培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
[0022]所述發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，MgSO4L 2g/L, K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
[0023]本發(fā)明所述發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，其特征在于，所述提取目的產(chǎn)物的過程為:將發(fā)酵培養(yǎng)物過濾除去培養(yǎng)液，剩余濕菌體加入含有枸櫞酸的純凈水(優(yōu)選將其調(diào)至pH=6.0)，超聲破壁后進行噴霧干燥，得到干菌體，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分?jǐn)嚢韬笥眉和榉?次進行萃取，合并己烷層進行減壓蒸餾，充分除去有機溶劑后得到還原型輔酶QlO的干粉，采用高效液相色譜法進行含量測定。
[0024]經(jīng)過大量試驗發(fā)酵培養(yǎng)，上述方法生產(chǎn)還原型輔酶QlO含量均不低于0.42mg/g(濕菌重)。
[0025]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0026]I)、采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建目的基因用以篩選高產(chǎn)還原型輔酶QlO的菌株；
[0027]2)、利用分子生物學(xué)技術(shù)對發(fā)酵過程進行代謝調(diào)控，目的產(chǎn)物產(chǎn)量提高顯著；
[0028]3)、本發(fā)明不產(chǎn)生有毒氣體和大量工業(yè)廢渣，無污染。
【具體實施方式】
[0029]以下實施例均采用高效液相色譜法進行還原型輔酶QlO含量測定，高效液相色譜條件為:C18柱(Sigma公司),4.6mmX250mm ;流動相:70%甲醇；檢測波長:210nm ;流速:lml/min。
[0030]實施例1
[0031]1.優(yōu)選高產(chǎn)菌株(構(gòu)建目的工程菌株)
[0032]利用分子生物學(xué)技術(shù)找到還原型輔酶QlO生產(chǎn)菌株的關(guān)鍵酶基因2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因。通過重組DNA技術(shù)篩選帶有目標(biāo)基因的細胞，將目的基因引入生產(chǎn)菌株，增強合成目的產(chǎn)物的能力，這是構(gòu)建還原型輔酶QlO發(fā)酵重組菌株的基礎(chǔ)，通過克隆上述 關(guān)鍵酶基因，使其高效表達，并增強其代謝流；通過將帶有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至經(jīng)過誘變的突變菌。隨著細胞中合成酶基因拷貝數(shù)的增加，可積累較大量的產(chǎn)物；根據(jù)重組菌株的選擇標(biāo)記，篩選一種物質(zhì)分別以有選擇壓力與無選擇壓力的培養(yǎng)條件，進行搖瓶發(fā)酵實驗，測定質(zhì)粒的丟失情況；同時，通過連續(xù)幾次發(fā)酵實驗，測定產(chǎn)物的產(chǎn)量及菌株的穩(wěn)定性。
[0033]最終選擇將關(guān)鍵酶基因克隆到光合細菌中并強化表達，得到還原型輔酶QlO高產(chǎn)菌株。
[0034]2.發(fā)酵培養(yǎng)及代謝調(diào)控
[0035]將冷凍保存的光合細菌菌種室溫放置10小時后，接種到斜面培養(yǎng)基上，置恒溫培養(yǎng)箱中35°C培養(yǎng)20h，再接種到50ml液體活化培養(yǎng)基中，置搖床中35°C培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，然后接種到含100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為15~20ml，35°C搖床培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)速為250r/min。
[0036]斜面培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，瓊脂20g/L，pH6.5。
[0037]液體活化培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
[0038]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L,鹿糖15g/L,蛋白胨12g/L,酵母浸膏12g/L,MgSO4L 2g/L, K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
[0039]以上培養(yǎng)基配置后應(yīng)立即滅菌，121°C，15min。
[0040]在指數(shù)生長期之前，即發(fā)酵培養(yǎng)后24h，添加前體物質(zhì)L-苯丙氨酸lmmol/L，用以提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。
[0041]3.目的產(chǎn)物提取
[0042]將發(fā)酵培養(yǎng)物過濾除去培養(yǎng)液，剩余濕菌體加入含有枸櫞酸的純凈水,調(diào)pH=6.0,超聲破壁后進行噴霧干燥，得到干菌體，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分?jǐn)嚢韬笥眉和榉?次進行萃取，合并己烷層進行減壓蒸餾，充分除去有機溶劑后得到還原型輔酶QlO的干粉，采用高效液相色譜法進行含量測定:還原型輔酶QlO含量為0.43mg/g (濕菌重)。
[0043]實施例2
[0044]1.優(yōu)選高產(chǎn)菌株
[0045]將2，3- 二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因克隆到光合細菌中并強化表達，得到還原型輔酶QlO高產(chǎn)菌株。
[0046]2.發(fā)酵培養(yǎng)及代謝調(diào)控
[0047]將冷凍保存的光合細菌菌種室溫放置12小時后，接種到斜面培養(yǎng)基上，置恒溫培養(yǎng)箱中35°C培養(yǎng)20h，再接種到50ml液體活化培養(yǎng)基中，置搖床中35°C培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，然后接種到含100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為15~20ml，35°C搖床培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)速為250r/min。
[0048]斜面培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，瓊脂20g/L，pH6.5。
[0049]液體活化培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
[0050]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L,鹿糖15g/L,蛋白胨12g/L,酵母浸膏12g/L,MgSO4L 2g/L, K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
[0051]以上培養(yǎng)基配置后應(yīng)立即滅菌，121°C，15min。
[0052]在指數(shù)生長期之前，即發(fā)酵培養(yǎng)后24h，添加前體物質(zhì)L-苯丙氨酸lmmol/L，用以提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。
[0053]3.目的產(chǎn)物提取
[0054]將發(fā)酵培養(yǎng)物過濾除去培養(yǎng)液，剩余濕菌體加入含有枸櫞酸的純凈水,調(diào)=pH6.0,超聲破壁后進行噴霧干燥，得到干菌體，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分?jǐn)嚢韬笥眉和榉?次進行萃取，合并己烷層進行減壓蒸餾，充分除去有機溶劑后得到還原型輔酶QlO的干粉，采用高效液相色譜法進行含量測定:還原型輔酶QlO含量為0.42mg/g (濕菌重)。
[0055]實施例3
[0056]1.優(yōu)選高產(chǎn)菌株
[0057]將2，3- 二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因克隆到光合細菌中并強化表達，得到還原型輔酶QlO高產(chǎn)菌株。
[0058]2.發(fā)酵培養(yǎng)及代謝調(diào)控
[0059]將冷凍保存的光合細菌菌種室溫放置10小時后，接種到斜面培養(yǎng)基上，置恒溫培養(yǎng)箱中35°C培養(yǎng)20h，再接種到50ml液體活化培養(yǎng)基中，置搖床中35°C培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，然后接種到含100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為15~20ml，35°C搖床培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)速為250r/min。
[0060]斜面培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L,鹿糖15g/L,蛋白胨12g/L,酵母浸膏12g/L,瓊脂20g/L，pH6.5。
[0061]液體活化培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
[0062]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L,鹿糖15g/L,蛋白胨12g/L,酵母浸膏12g/L,MgSO4L 2g/L, K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
[0063]以上培養(yǎng)基配置后應(yīng)立即滅菌，121°C，15min。
[0064]在指數(shù)生長期之前，即發(fā)酵培養(yǎng)后24h，添加前體物質(zhì)L-苯丙氨酸lmmol/L，用以提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。
[0065]3.目的產(chǎn)物提取
[0066]將發(fā)酵培養(yǎng)物過濾除去培養(yǎng)液，剩余濕菌體加入含有枸櫞酸的純凈水,調(diào)pH=6.5，超聲破壁后進行噴霧干燥，得到干菌體，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分?jǐn)嚢韬笥眉和榉?次進行萃取，合并己烷層進行減壓蒸餾，充分除去有機溶劑后得到還原型輔酶QlO的干粉，采用高效液相色譜法進行含量測定:還原型輔酶QlO含量為0.43mg/g (濕菌重)。
[0067]上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效 變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶Qio的方法，其特征在于，采用發(fā)酵法生產(chǎn)還原型輔酶Q10，其具體過程為: 1)、優(yōu)選高產(chǎn)菌株 將關(guān)鍵酶基因克隆到光合細菌中并強化表達，得到還原型輔酶QlO高產(chǎn)菌株，其中關(guān)鍵酶基因為2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因； 2)、發(fā)酵培養(yǎng)并進行代謝調(diào)控 將冷凍保存的光合細菌菌種室溫放置10-12小時后，接種到斜面培養(yǎng)基上，置恒溫培養(yǎng)箱中35°C培養(yǎng)20h，再接種到50ml液體活化培養(yǎng)基中，置搖床中35°C培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，然后接種到含100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為15~20ml，35°C搖床培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)速為250r/min ； 在發(fā)酵培養(yǎng)后24h，添加前體物質(zhì)L-苯丙氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收獲培養(yǎng)物； 3)、提取目的產(chǎn)物。
2.按照權(quán)利要 求1所述發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，其特征在于:所述斜面培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，瓊脂20g/L，ρΗ6.5。
3.按照權(quán)利要求1所述發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，其特征在于:所述液體活化培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，pH6.5。
4.按照權(quán)利要求1所述發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L，酵母浸膏12g/L，MgSO4L 2g/L，K2HPO4.3H201.2g/L, KH2PO4L 2g/L, pH5.5。
5.按照權(quán)利要求1所述發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，其特征在于，所述提取目的產(chǎn)物的過程為:將發(fā)酵培養(yǎng)物過濾除去培養(yǎng)液，剩余濕菌體加入含有枸櫞酸的純凈水，超聲破壁后進行噴霧干燥，得到干菌體，以1:10 (w:v)比例加入乙醇，充分?jǐn)嚢韬笥眉和榉?次進行萃取，合并己烷層進行減壓蒸餾，充分除去有機溶劑后得到還原型輔酶QlO的干粉。
6.按照權(quán)利要求5所述發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，其特征在于:在剩余濕菌體加入含有枸櫞酸的純凈水，將其調(diào)至PH=6.0。
7.按照權(quán)利要求1所述發(fā)酵生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，其特征在于:所述前體物質(zhì)L-苯丙氨酸的添加量為lmmol/L。
【文檔編號】C12N1/21GK103740777SQ201310455555
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】張英杰, 高勁松, 魏奇 申請人:遼寧琦潤生物科技有限公司