棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，本發(fā)明針對(duì)棗瘋病植原體16S?rDNA基因保守序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫62℃左右，幾十分鐘即可實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增；4條引物對(duì)靶序列的6個(gè)特異序列區(qū)域的識(shí)別，保證了LAMP擴(kuò)增的高度特異性；LAMP不需要模板的熱變性，長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)，在等溫條件下擴(kuò)增，不會(huì)因溫度改變而造成時(shí)間的浪費(fèi)，使反應(yīng)速度可提高30-50％；反應(yīng)結(jié)束后，可直接通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)管顏色變化，或通過(guò)凝膠電泳判斷檢測(cè)結(jié)果；該技術(shù)對(duì)棗瘋病植原體的檢測(cè)特異性強(qiáng)，具有快速、高效、儀器要求簡(jiǎn)易，操作簡(jiǎn)便，成本低，易于在基層推廣使用的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)檢測(cè)率瘋病植原體的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]棗瘋病(Juiube witches’broom, JWB)又稱“棗癌癥”是由植原體病原侵染導(dǎo)致的、在棗樹(shù)生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的毀滅性病害。植原體原稱類菌原體，為單細(xì)胞原核生物，無(wú)細(xì)胞壁，由生物膜包圍，可引起多種病害。根據(jù)植原體16S rDNA基因序列為對(duì)象進(jìn)行分析，可將植原體分為28個(gè)組。其中引起棗瘋病的棗瘋病植原體與榆樹(shù)黃化植原體、葡萄金黃化植原體等同為榆樹(shù)黃化組成員。棗瘋病分布范圍廣，傳播速度快，致病力強(qiáng)，樹(shù)體一旦感病，終身攜帶，傳統(tǒng)的病害防治技術(shù)和栽培技術(shù)難以治愈。我國(guó)多數(shù)棗樹(shù)主栽品種對(duì)棗瘋病敏感，全國(guó)每年因棗瘋病死樹(shù)高達(dá)千萬(wàn)株，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億元，嚴(yán)重阻礙了棗樹(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。要從根本上解決棗瘋病的防治問(wèn)題是采取有效的預(yù)防措施，加強(qiáng)種苗(接穗、砧木)的檢疫檢驗(yàn)，采用健康苗木(砧木、接穗)，建立無(wú)病苗木繁育體系，從源頭上杜絕病原才是控制棗瘋病發(fā)生蔓延的根本途徑，而建立和應(yīng)用先進(jìn)的病原檢測(cè)技術(shù)是紅棗無(wú)病苗木生產(chǎn)的核心所在。
[0003]植原體自發(fā)現(xiàn)后，其檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展一直沒(méi)有大的突破。傳統(tǒng)的電鏡觀察、血清學(xué)等檢測(cè)方法因?yàn)殪`敏度低、周期長(zhǎng)和操作繁瑣等不足，已不能滿足現(xiàn)代生產(chǎn)的需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)引入植原體病害研究領(lǐng)域，植原體鑒定和檢測(cè)技術(shù)才得到了較快的發(fā)展，如普通PCR、巢氏PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等，但這些方法不僅需要PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等昂貴的儀器設(shè)備，且操作程序繁 瑣復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)人員有較高的技術(shù)要求，大大限制了作為快速診斷方法的使用和推廣。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是 Notomi等在2000年開(kāi)發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、不需要復(fù)雜的儀器，肉眼可直接觀察檢測(cè)結(jié)果，其高效性、簡(jiǎn)易性、成本低廉且檢測(cè)周期短等特點(diǎn)非常適合于基層及現(xiàn)場(chǎng)使用。該技術(shù)針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)段，設(shè)計(jì)4條特異引物并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在一定溫度下對(duì)核酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體的檢測(cè)。此前，已有應(yīng)用在肺炎鏈球菌、西尼羅病毒、SARS病毒、番爺黃葉病毒、山藥嵌紋病毒、肺炎支原體等病原微生物的檢測(cè)以及登革病毒的分型等方面的報(bào)道，目前，尚未見(jiàn)利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)棗瘋病植原體的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]目前針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)專門(mén)利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)棗瘋病植原體的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種棗瘋病植原體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，能夠進(jìn)行快速、特異、靈敏、簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，克服已有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明根據(jù)棗瘋病植原體分離物16S rDNA基因的保守序列，設(shè)計(jì)了棗瘋病植原體LAMP特異性引物，確定反應(yīng)條件和試劑濃度并進(jìn)行優(yōu)化，建立了棗瘋病植原體的LAMP快速檢測(cè)體系，此方法對(duì)棗瘋病植原體的檢測(cè)特異性強(qiáng)，Ih即可獲得檢測(cè)結(jié)果，具有快速、高效、簡(jiǎn)易的特點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明提供了一種建立棗瘋病植原體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，包括以下步驟。
[0008](I)提供一套用于檢測(cè)棗瘋病植原體的LAMP反應(yīng)特異性引物序列，具體的寡聚核苷酸序列為:
[0009]F3:5/ -GTCTGCAACTCGACTTCATGAA-3'
[0010]B3:5/ -TAACCCCAATCATCAACCCTA-3'
[0011]FIP:5/ -GGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTTTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC-3'
[0012]BIP:5/ -AAACCACGAAAGTTAGCAATACCCGTTTTCCTTAGACAGCTCCCTCTTCTTGC-3'。
[0013](2)提供棗瘋病植原體的LAMP檢測(cè)方法，即首先從待檢測(cè)樣品中制備反應(yīng)模板，并配制LAMP反應(yīng)體系，然后通過(guò)LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增。
[0014](3)最后通過(guò)日光下肉眼觀察或電泳檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有棗瘋病植原體。
[0015]具體的，本發(fā)明提供了一種棗瘋病植原體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0016](I)設(shè)計(jì)用于檢測(cè)率瘋病植原體的LAMP引物:首先在Genebank中搜集全部植原體及有代表性細(xì)菌的16S rDNA核 酸序列，利用Omiga軟件對(duì)上述序列進(jìn)行比較及一致性分析，找出棗瘋病植原體與其他植原體的基因差異位點(diǎn)和高度保守區(qū)域，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件 Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)針對(duì)棗瘋病植原體16S rDNA基因保守序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)出I套特異性引物，包括I對(duì)外引物F3、B3和I對(duì)內(nèi)引物FIP、BIP，引物由上海生工生物工程公司按照PAGE純度級(jí)別合成。
[0017]引物序列如下所示:
[0018]F3:5/ -GTCTGCAACTCGACTTCATGAA-3'
[0019]B3:5/ -TAACCCCAATCATCAACCCTA-3'
[0020]FIP:5/ -GGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTTTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC-3'
[0021]BIP:5/ -AAACCACGAAAGTTAGCAATACCCGTTTTCCTTAGACAGCTCCCTCTTCTTGC-3'。
[0022](2)植物總DNA的提取:采用植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取棗樹(shù)葉片總DNA，置于-40C冰箱貯存?zhèn)溆谩?br> [0023](3)配制LAMP反應(yīng)體系:反應(yīng)體系為25 μ L，各組分的用量為，8U/ μ L的Bst DNA聚合酶 L O μ L，I X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ L, I Ommol/L 的 dNTP2.5 μ L，1.0mmol/L 的Betain2.0yL, 25mmol/L 的 MgS044.0uL, 1.8 μ mol/L 的引物 FIP,BIP 各 2.0 μ L，0.2 μ mol/L 的引物 F3、B3 各 0.5 μ L，625 μ mol/L 的 Calceinl.0 μ L，12.5mmol/L 的 MnCl2L 0 μ L，模板 DNA1.0 μ L，補(bǔ)足滅菌 ddH20 M 25 μ L0
[0024](4)通過(guò)LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增:將混合物置于62 °C恒溫反應(yīng)60min,8CTC滅活 5min。
[0025](5) LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的分析:
[0026]分析方法1:瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色15min后，在凝膠成像系統(tǒng)上成像。分析方法2:在日光下，肉眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化。
[0027](6)結(jié)果的判定:在分析方法I中，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察是否有梯形條帶，若出現(xiàn)梯形條帶判定為陽(yáng)性，反之，為陰性。在分析方法2中，若擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)榇渚G色則判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品中感染有棗瘋病植原體，若擴(kuò)增產(chǎn)物仍為棕黃色則判定為陰性。
[0028]通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下效果:本發(fā)明針對(duì)棗瘋病植原體16S rDNA基因中6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等溫60°C左右，幾十分鐘即可實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增，4條引物對(duì)靶序列的6個(gè)特異序列區(qū)域的識(shí)別，保證了 LAMP擴(kuò)增的高度特異性。另外本發(fā)明使用Calcein+MnCl2替代了 SYBR Green，在配置環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液時(shí)就加入反應(yīng)液中，僅在發(fā)生環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)時(shí)才呈現(xiàn)翠綠色，避免了常規(guī)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法需在反應(yīng)結(jié)束后加入SYBRGreen染液顯色造成的假陽(yáng)性問(wèn)題，具有更好的特異性。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)不需要模板的熱變性，長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)，在等溫條件下擴(kuò)增，不會(huì)因溫度改變而造成時(shí)間的浪費(fèi)，使反應(yīng)速度可提高30-50%，只在水浴鍋中Ih即可完成檢測(cè)棗瘋病植原體。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0030](I)特異性強(qiáng):所用的特異性引物針對(duì)棗瘋病植原體16S rDNA基因中6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)，特異性超過(guò)常規(guī)PCR。
[0031](2)靈敏度高:對(duì)棗瘋病植原體檢測(cè)的靈敏比普通PCR方法高100倍以上。
[0032](3)檢測(cè)快捷Adna的提取，到檢測(cè)完畢用時(shí)約2h，而常規(guī)pcr需要5h以上，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間。
[0033](4)經(jīng)濟(jì)實(shí)用:不需要昂貴的的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，只要水浴鍋或金屬浴就能完成檢測(cè)反應(yīng)。
`[0034](5)操作簡(jiǎn)便、結(jié)果明顯:整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不涉及復(fù)雜儀器或設(shè)備，稍具分子生物學(xué)基礎(chǔ)的人員即可完成操作；結(jié)果可直接通過(guò)肉眼觀察鑒定，陽(yáng)性結(jié)果為翠綠色，陰性結(jié)果為棕黃色。
[0035](6)對(duì)人和環(huán)境安全:避免了常規(guī)PCR檢測(cè)過(guò)程使用溴化乙錠等有毒化學(xué)藥品，對(duì)人和環(huán)境都較為安全。
[0036]總之，本發(fā)明采用的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有反應(yīng)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1:棗瘋病植原體DNA環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。圖中泳道M為IOObp DNA Ladder，泳道I為陰性對(duì)照，泳道2_4為棗瘋病植原體總DNA。
[0038]圖2:肉眼檢測(cè)棗瘋病植原體DNA環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物。圖中I為陰性對(duì)照,2_4為棗瘋病植原體總DNA。
[0039]圖3-4:棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。圖中1、2、3分別代表采用泡桐叢枝植原體DNA、翠菊黃化植原體DNA、葡萄金黃化植原體DNA作為模板時(shí)的LAMP檢測(cè)結(jié)果，4~7代表采用棗瘋病植原體DNA作為模板時(shí)的LAMP檢測(cè)結(jié)果，8為健康棗樹(shù)DNA，9為滅菌雙蒸水對(duì)照。
[0040]圖3:瓊脂糖(2.0% w/v)電泳使用EB染色顯示LAMP反應(yīng)特異性。[0041 ] 圖4:肉眼檢測(cè)LAMP反應(yīng)特異性。
[0042]圖5-7:棗瘋病植原體LAMP檢測(cè)方法與常規(guī)PCR檢測(cè)方法間的靈敏度比較。圖中泳道M為IOObp DNA Ladder,泳道1_7分別對(duì)應(yīng)采用10倍梯度稀釋的DNA模板即DNA濃度為43ng/ μ L~4.3fg/ μ L時(shí)的擴(kuò)增情況，泳道8為滅菌雙蒸水對(duì)照。
[0043]圖5:瓊脂糖(2.0% w/v)電泳使用EB染色顯示LAMP反應(yīng)靈敏度。
[0044]圖6:肉眼檢測(cè)LAMP反應(yīng)靈敏度。
[0045]圖7:瓊脂糖(1.0% w/v)電泳使用EB染色顯示常規(guī)PCR反應(yīng)靈敏度。
【具體實(shí)施方式】
[0046]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0047]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而絕不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說(shuō)明外，本申請(qǐng)中的所有科技術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。
[0048]試驗(yàn)藥品:植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit, TIANGEN)、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)、Tap DNA聚合酶購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Bst DNA聚合酶大片段、I X ThermoPol反應(yīng)緩沖液為北京紐英倫NEB生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；甜菜堿(Betain)、鈣黃綠素(Calcein)購(gòu)自上海生工生物工程公司。
[0049]試驗(yàn)材料:以常規(guī)PCR檢測(cè)到的含有棗瘋病植原體的棗樹(shù)葉片總DNA為材料，健康棗樹(shù)葉片總DNA和滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照。
[0050]本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。
[0051]實(shí)施例1引物的制備
[0052]1.引物的設(shè)計(jì)和合成:首先從Genebank中搜集全部植原體及有代表性細(xì)菌的16S rDNA核酸序列，利用Omiga軟件對(duì)上述序列進(jìn)行比較及一致性分析，找出棗瘋病植原體與其他植原體的基因差異位點(diǎn)和高度保守區(qū)域，利用LAMP在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)針對(duì)率瘋病植原體16S rDNA基因保守序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了多組引物，然后根據(jù)引物所在區(qū)域的保守性、弓丨物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體GC含量以及Tm值等綜合因素，選取出I套特異性引物，包括I對(duì)外引物F3、B3和I對(duì)內(nèi)引物FIP、BIP，引物由上海生工生物工程公司按照PAGE純度級(jí)別合成。
[0053]引物序列如下所示:
[0054]F3:5/ -GTCTGCAACTCGACTTCATGAA-3'；
[0055]B3:5/ -TAACCCCAATCATCAACCCTA-3'；
[0056]FIP:5/ -GGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTTTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC-3'；
[0057]BIP:5/ -AAACCACGAAAGTTAGCAATACCCGTTTTCCTTAGACAGCTCCCTCTTCTTGC-3'。
[0058]2.引物的準(zhǔn)備:引物合成后，用滅菌雙蒸水分別稀釋為ΙΟμπιοΙ/L，將引物置于-20°C冰箱避光保存?zhèn)溆谩?br> [0059]實(shí)施例2棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立
[0060]1.植物總DNA的提取
[0061]采用植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取棗樹(shù)葉片總DNA,置于_40°C冰箱貯存?zhèn)溆谩?br> [0062]2.建立并優(yōu)化棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序
[0063]反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的初步建立:棗瘋病植原體LAMP反應(yīng)體系為25 μ L，各組分的用量為:8U/yL 的 Bst DNA 聚合酶 0.8 μ L，I X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ L，10mmol/L的 dNTP2.0 μ L，1.0mmol/L 的 Betain2.0yL, 25mmol/L 的 MgS045.0uL, 1.8 μ mol/L 的引物FIP、BIP 各 2.Ομ L,0.2ymol/L 的引物 F3、B3 各 0.5 μ L,625 μ mol/L 的 Calceinl.0 μ L,12.5mmol/L的MnCl2L O μ L，模板DNA1.0yL,補(bǔ)足滅菌ddH20 M 25 μ L0混勻后將混合物置于60°C恒溫反應(yīng)60min,80°C滅活5min。
[0064]將反應(yīng)溫度按55°C~68°C依次遞增，多次重復(fù)試驗(yàn)后確定最佳退火溫度。對(duì)構(gòu)建反應(yīng)體系的主要影響因素在如下范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化:外引物與內(nèi)引物濃度比(1:1~1:16)、dNTP(0.Smmol/I,~3.0mmol/L)、MgSO4(2.0mmol/L ~12mmol/L)、Bst DNA 聚合酶(1.6U/μ L ~11.2U/ μ L)。
[0065]每次檢測(cè)時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照，在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均成立時(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)有效，可判定結(jié)果。
[0066]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的判定:如圖1所示，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察是否有梯形條帶，若出現(xiàn)梯形條帶判定為陽(yáng)性，反之，為陰性?；蛲ㄟ^(guò)肉眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化(圖2)，若擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)榇渚G色則判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品中感染有棗瘋病植原體，若擴(kuò)增產(chǎn)物仍為棕黃色則判定為陰性。
[0067]通過(guò)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增最佳反應(yīng)體系為 25 μ L:8U/ μ L 的 Bst DNA 聚合酶 L O μ L，I X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ L, I Ommol/L的 dNTP2.5 μ L，1.0mmol/L 的 Betain2.0yL, 25mmol/L 的 MgS044.0uL, 1.8 μ mol/L 的引物FIP、BIP 各 2.Ομ L,0.2ym`ol/L 的引物 F3、B3 各 0.5 μ L,625 μ mol/L 的 Calceinl.0 μ L,12.5mmol/L 的 MnCl2L O μ L，模板 DNA1.0yL,補(bǔ)足滅菌 ddH20 M 25 μ L0
[0068]最佳反應(yīng)條件為:621^恒溫反應(yīng)60min,8(TC滅活5min。
[0069]實(shí)施例3特異性檢驗(yàn)
[0070]按上述實(shí)施例2所建立的棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，同時(shí)對(duì)棗瘋病植原體(榆樹(shù)黃化組)，葡萄金黃化植原體(榆樹(shù)黃化組)，泡桐叢枝植原體(翠菊黃化組)，翠菊黃化植原體(翠菊黃化組)，田間采集及實(shí)驗(yàn)室保存的健康棗樹(shù)基因組DNA以及滅菌雙蒸水作為模板，進(jìn)行棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的特異性試驗(yàn)。
[0071]分別提取健康棗樹(shù)、棗瘋病植原體、葡萄金黃化植原體，泡桐叢枝植原體，翠菊黃化植原體的基因組DNA以及滅菌雙蒸水作為模板。
[0072]按照上述實(shí)例2中確定的最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。
[0073]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的判定:通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察是否有梯形條帶，若出現(xiàn)梯形條帶判定為陽(yáng)性，反之，為陰性。或通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化，若擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)榫G色則判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品中感染有棗瘋病植原體，若擴(kuò)增產(chǎn)物仍為棕黃色則判定為陰性。
[0074]判斷結(jié)果如圖3、圖4所示，只有棗瘋病植原體DNA表現(xiàn)為陽(yáng)性反應(yīng)，肉眼觀察可見(jiàn)翠綠色，瓊脂糖凝膠電泳呈特征性梯形條帶。而同屬植原體榆樹(shù)黃化組的葡萄金黃化植原體和屬于植原翠菊黃化組的泡桐叢枝植原體、翠菊黃化植原體以及健康棗樹(shù)均為陰性。由此可見(jiàn)，本發(fā)明建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法對(duì)棗瘋病植原體有較強(qiáng)的特異性，能較好的區(qū)分不同組間及組內(nèi)的植原體，特異性較好。特異性驗(yàn)證通過(guò)后，即表明該檢測(cè)方法可應(yīng)用于棗瘋病植原體的檢測(cè)。
[0075]實(shí)施例4靈敏度檢測(cè)
[0076]采用植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取感染了棗瘋病植原體的棗樹(shù)葉片總DNA，以此作為模板，用滅菌雙蒸水進(jìn)行10倍梯度稀釋(43ng/l.! L~43fg/y L)，按照上述實(shí)例2中的最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)進(jìn)行靈敏度比較。
[0077]結(jié)果如圖5、圖6所示，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可檢測(cè)到的最小DNA濃度為4.3pg/μ L(瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)梯形條帶，肉眼觀察可見(jiàn)翠綠色)。
[0078]常規(guī)PCR檢測(cè):以10倍梯度稀釋的DNA為模板，R16mF2:5’ -CATGCAAGTCGAACGGA-3’，R16mR2:5’ -CTTAACCCCAATCATCGA-3’ 為擴(kuò)增引物進(jìn)行常規(guī) PCR擴(kuò)增。常規(guī)PCR擴(kuò)增體系為25 μ L:DNA模板l.0yL, 10 μ mol/L的引物各1.0 μ L，IOmmol/L 的 dNTPl.0μ L, 10XPCR Buffer (2.5mmol/L MgCl2) 2.5 μ L, 2.5U/μ L 的 TaqDNA 聚合酶0.3μ L，滅菌 ddH2018.2μ L。擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性 6min ;94°C變性 45s，52°C復(fù)性 45s，72°C延伸lmin, 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin0
[0079]瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖7所示，常規(guī)PCR擴(kuò)增得到預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為1500bp，其最小檢出限為430 μ g/ μ L。
[0080]由此可以看出，本發(fā)明建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的敏感性比常規(guī)PCR高100 倍。`
【權(quán)利要求】
1.一種棗瘋病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于它的方法包括以下兩部分: (1)提供兩對(duì)用于檢測(cè)棗瘋病植原體的LAMP引物序列，即長(zhǎng)度分別為22bp、21bp、50bp和53bp的寡聚核苷酸序列，依次命名為F3、B3、FIP和BIP，上述兩對(duì)LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下:
F3:5’ -GTCTGCAACTCGACTTCATGAA-3’
B3:5， -TAACCCCAATCATCAACCCTA-3’
FIP:5’ -GGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTTTTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATC-3，
BIP:5’ -AAACCACGAAAGTTAGCAATACCCGTTTTCCTTAGACAGCTCCCTCTTCTTGC-3， (2)提供一種棗瘋病植原體的LAMP檢測(cè)方法，即首先從待測(cè)樣品中制備反應(yīng)模板，并配置LAMP反應(yīng)體系，然后通過(guò)LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增，最后根據(jù)反應(yīng)混合物的顏色顯示或通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，判斷檢測(cè)結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)棗瘋病植原體的2對(duì)LAMP引物，其特征在于，其設(shè)計(jì)的方法是:在Genebank中搜集全部植原體及有代表性細(xì)菌的16S rDNA核酸序列,利用Omiga軟件對(duì)上述序列進(jìn)行比較及一致性分析，找出棗瘋病植原體與其他植原體的基因差異位點(diǎn)和高度保守區(qū)域，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4針對(duì)棗瘋病植原體16SrDNA基因保守序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)出I套特異性引物，包括I對(duì)外引物F3、B3和I對(duì)內(nèi)引物FIP、BIP。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的棗瘋病植原體LAMP檢測(cè)方法具體為:(1)模板的提取:采用植物 基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取棗樹(shù)葉片總DNA作為模板； (2)以提取的植物總DNA為模板，分別設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、健康植株總DNA對(duì)照及無(wú)菌雙蒸水對(duì)照，采用權(quán)利要求1所述的引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)； (3)所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系為25μ L包括:8U/yL的Bst DNA聚合酶1.0 μ L，I X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ L, 10mmol /I,的 dNTP2.5 μ L, 1.0mmol/L 的 Betain2.0 μ L,25mmol/L 的 MgS044.0uL, 1.8 μ mol/L 的引物 FIP、BIP 各 2.0 μ L，0.2 μ mol/L 的引物 F3、B3各 0.5 μ L，625 μ mol/L 的 Calceinl.0yL, 12.5mmol/L 的 MnCl2L OyL,模板 DNA1.0 μ L，補(bǔ)足滅菌ddH20至25 μ L ; (4)所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)程序:62°C恒溫反應(yīng)60min,80°C滅活5min； (5)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)果分析:分析方法1:瓊脂糖凝膠電泳，反應(yīng)結(jié)果通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色15min后，在凝膠成像系統(tǒng)上成像，若出現(xiàn)梯形條帶判定為陽(yáng)性，反之，為陰性。分析方法2:在日光下，肉眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化，若擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)榇渚G色則判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品中感染有棗瘋病植原體，若擴(kuò)增產(chǎn)物仍為棕黃色則判定為陰性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103497998SQ201310455621
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】韓劍, 羅明, 張祥林, 何貴倫, 殷智婷 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)