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      一種用于肉毒桿菌lamp核酸檢測引物組和試劑盒的制作方法

      文檔序號:520138閱讀:493來源:國知局
      一種用于肉毒桿菌lamp核酸檢測引物組和試劑盒的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組和試劑盒,其特征在于,引物組包括:外側(cè)正向引物,其為SEQ?ID?No:1所示的多核苷酸序列;外側(cè)反向引物,其為SEQ?ID?No:2所示的多核苷酸序列;內(nèi)側(cè)正向莖環(huán)引物,其為SEQ?ID?No:3所示的多核苷酸序列;內(nèi)側(cè)反向莖環(huán)引物,其為SEQ?ID?No.4所示的多核苷酸序列。一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒包括所述的引物組。本發(fā)明所述檢測試劑盒是將恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與DNA顯色檢測相結(jié)合,靈敏度高、特異性強(qiáng),結(jié)果準(zhǔn)確,操作簡單快速,相關(guān)儀器設(shè)備要求低,適于基層人員操作。
      【專利說明】—種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組和試劑盒
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及分子學(xué)和分類學(xué)領(lǐng)域,特別涉及用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組和試劑盒。
      【背景技術(shù)】
      [0002]肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium, botulinum)是一種生長在缺氧環(huán)境下的革蘭氏陽性產(chǎn)孢子細(xì)菌,具有極強(qiáng)的生存能力。肉毒桿菌產(chǎn)生的毒素,肉毒毒素是已知的毒性最強(qiáng)的毒素之一。肉毒桿菌是一種致命病菌,人們食入和吸收這種毒素后,神經(jīng)系統(tǒng)將遭到破壞,病情嚴(yán)重可能導(dǎo)致死亡。目前報(bào)道新西蘭恒天然濃縮乳清蛋白粉大批量被肉毒桿菌污染,多家產(chǎn)品被卷入其中。
      [0003]傳統(tǒng)肉毒桿菌檢測技術(shù)為酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA),ELISA檢測技術(shù)成本較低,但其受抗體批次和樣本影響比較大,極易出現(xiàn)假陰和假陽性,其靈敏度和特異性無法滿足檢測需要。目前,肉毒桿菌的檢測主要集中在熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法。但是,熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員,且操作復(fù)雜,檢測耗時(shí)長,只有專業(yè)檢測機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)室才能獨(dú)立操作,不利于技術(shù)推廣。
      [0004]本發(fā)明所述用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組和試劑盒與傳統(tǒng)檢驗(yàn)技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)品相比靈敏度高、特異性好、儀器要求低、易于操作、適用于高通量篩選和污染易控制等獨(dú)到的優(yōu)勢,市場前景廣闊。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005]本發(fā)明目的之一在于提供用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的引物組。本發(fā)明的另一目的在于用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒。本發(fā)明的總體目的是將LAMP核酸檢測與DNA顯色檢測相結(jié)合,開發(fā)出對儀器設(shè)備要求低,操作簡單,適于基層人員操作的肉毒桿菌檢測試劑盒。
      [0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明公開了一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組,其特征在于,包括:
      [0007]外側(cè)正向引物,其為SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列;
      [0008]外側(cè)反向引物,其為SEQ ID N0.2所示的多核苷酸序列;
      [0009]內(nèi)側(cè)正向莖環(huán)引物,其為SEQ ID N0.3所示的多核苷酸序列;
      [0010]內(nèi)側(cè)反向莖環(huán)引物,其為SEQ ID N0.4所示的多核苷酸序列。
      [0011]一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒,其特征在于,包括權(quán)利要求1所述的引物組。
      [0012]優(yōu)選的是,包括含有權(quán)利要求1所述的引物組的反應(yīng)體系,25 μ I所述反應(yīng)體系的配置為:8U/ μ I的鏈置換DNA活性聚合酶,2 μ I濃度為IOmM內(nèi)側(cè)正向莖環(huán)引物,2 μ I濃度為1OmM的內(nèi)側(cè)反向莖環(huán)引物,0.5μ I濃度為1OmM外側(cè)正向引物,0.5μ I濃度為IOmM外側(cè)反向引物,2.5μ 110XPCR緩沖液,1μ I濃度為1OmM的dNTPs,1μ I濃度為I~10 μ g/μ I的待檢測基因組DNA提取液,1.25 μ 120XDNA熒光染料和13.25 μ I雙蒸水。
      [0013]優(yōu)選的是,所述DNA熒光染料為10000XSYBR Green I。
      [0014]優(yōu)選的是,以待測肉毒桿菌DNA為模板作為檢測組,以肺炎球菌DNA、大腸桿菌DNA、金黃色葡萄球菌DNA、鼠傷寒沙門氏菌DNA、破傷風(fēng)梭菌DNA和白色念珠菌DNA做為陰性對照組,用權(quán)利要求2所述試劑盒配制所述反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP檢測,之后用紫外分析儀測量所述反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。
      [0015]優(yōu)選的是,與所述陰性對照組相比所述檢測組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)說明檢測樣品為肉毒桿菌。
      [0016]優(yōu)選的是,所述試劑盒的檢測反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min,65°C恒溫反應(yīng)Ih和80°C孵育 IOmin。
      [0017]本發(fā)明人使用本發(fā)明所述引物組和試劑盒,按照本發(fā)明的檢測方法對肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia, coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、白色念珠菌(Candida albicans)等11種不攜帶NTNH基因的菌種進(jìn)行LAMP核酸檢測,反應(yīng)結(jié)束以后用紫外分析儀進(jìn)行不開蓋熒光檢測,結(jié)果顯示陽性對照產(chǎn)生高強(qiáng)度DNA擴(kuò)增熒光,而不攜帶NTNH基因的對照菌種不產(chǎn)生高于本底水平的熒光。從而證明對不攜帶NTNH基因的其他菌種的LAMP檢測不會(huì)產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。
      [0018]本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所述LAMP檢測技術(shù)30min即可擴(kuò)增至109倍,于低至幾個(gè)拷貝的病毒模板也能有效擴(kuò)增,與傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增技術(shù)相比,LAMP反應(yīng)簡單,反應(yīng)效率大大提高,而且特異性高、儀器要求低,只需要水浴鍋即可,產(chǎn)物檢測用肉眼觀察或紫外分析儀檢測沉淀濁度即可判斷、易于`操作、適用于高通量篩選和污染易控制。本發(fā)明所述檢測試劑盒是將恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與DNA顯色檢測相結(jié)合,開發(fā)出對儀器設(shè)備要求低,操作簡單,適于基層人員操作的肉毒桿菌檢測試劑盒。
      [0019]總之,本發(fā)明的有益效果為:
      [0020]1.本發(fā)明中引物組為特異性引物,是專門用于擴(kuò)增一段肉毒桿菌的特異性保守序列,保證了檢測的特異性和準(zhǔn)確性。
      [0021]2.本發(fā)明試劑盒以LAMP代替熒光實(shí)時(shí)定量PCR,效率高,時(shí)間更短,特異性好靈敏度更高,檢測效果更加準(zhǔn)確。
      [0022]3.使用本發(fā)明所述試劑盒檢測肉毒桿菌無需采購昂貴儀器設(shè)備,無需專業(yè)技術(shù)人員,適于基層推廣。
      [0023]4.本發(fā)明所述試劑盒檢測方法簡單快捷:反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫統(tǒng)一環(huán)境中一步完成,省去了反轉(zhuǎn)錄步驟和改變溫度所需的時(shí)間。
      [0024]5.使用本發(fā)明所述試劑盒對肉毒桿菌進(jìn)行在65°C恒溫條件下高效、特異、快速的擴(kuò)增目的基因,完成檢測過程,整個(gè)檢測過程只需I~2h就可完成。
      [0025]6.檢測結(jié)果肉眼即可辨別。
      [0026]本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義
      [0027]除非另外定義,否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料,但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。[0028]術(shù)語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸(DNA)、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制,否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸,所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制,否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物,其包括PNA (肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定,否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。
      [0029]術(shù)語“PCR”意指聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA、RNA的地方.聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase ChainReaction,簡稱PCR)又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。
      [0030]術(shù)語“環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)”意指針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物,利用一種鏈置換DNA活性聚合酶在等溫條件60~63°C保溫30~60min,完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
      [0031]術(shù)語“引物”意指一小段單鏈DNA或RNA,作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn),除非特定限制,否則所述術(shù)語涵蓋自然中生物的DNA復(fù)制和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中人工合成的引物(通常為DNA引物)。之所以需要引物是因?yàn)樵贒NA合成中DNA聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的DNA鏈上。除非特定限制,否則上游引物為在DNA復(fù)制時(shí),作為DNA模板3'端的復(fù)制起始點(diǎn)的引物,下游引物為在DNA復(fù)制時(shí),作為DNA模板5'端的復(fù)制起始點(diǎn)的引物。
      [0032]術(shù)語“鏈置換DNA活性聚合酶”意指一類在細(xì)胞復(fù)制DNA的過程中起重要作用的酶,以DNA為復(fù)制模板,從將DNA由5'端點(diǎn)開始復(fù)制到3'端的酶。鏈置換DNA活性聚合酶的主要活性是催化DNA的合成及其相輔的活性。
      `[0033]術(shù)語“緩沖液”意指一類當(dāng)往某些溶液中加入一定量的酸和堿時(shí),有阻礙溶液pH變化作用的溶液。
      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0034]圖1為本發(fā)明所述肺炎球菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門菌、白色念珠菌、痢疾志賀菌、破傷風(fēng)梭菌和肉毒桿菌的LAMP核酸檢測結(jié)果中各反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度對比圖。
      【具體實(shí)施方式】
      [0035]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明,以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
      [0036]實(shí)施例1:
      [0037]引物設(shè)計(jì):
      [0038]所述引物組的四個(gè)引物使用Premier Biosoft公司的LAMP引物設(shè)計(jì)軟件LampDesignerl.10,根據(jù)肉毒桿菌NTNH結(jié)構(gòu)域的保守序列來設(shè)計(jì)。
      [0039]實(shí)施例2[0040]使用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行肉毒桿菌檢測
      [0041]步驟一,提取檢測樣品的基因組DNA作為模板;
      [0042]步驟二,將所述基因組DNA在95°C預(yù)變性5min,然后立即將所述預(yù)變性的基因組DNA置于冰上冷卻;
      [0043]步驟三,取I μ I所述預(yù)變性的基因組DNA和所述試劑盒中試劑配制成所述LAMP檢測反應(yīng)體系,輕輕混勻;
      [0044]步驟四,將所述配制成的LAMP檢測反應(yīng)體系65 °C反應(yīng)Ih進(jìn)行退火和延伸,之后將退火和延伸后的所述LAMP檢測反應(yīng)體系80°C孵育IOmin ;
      [0045]步驟五,所述孵育結(jié)束之后,將所述反應(yīng)體系置于紫外分析儀中測量所述反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度,根據(jù)所述熒光強(qiáng)度的變化確定檢測結(jié)果。
      [0046]實(shí)施例3:
      [0047]陰性對照
      [0048]步驟一,提取肺炎球菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門菌、白色念珠菌、痢疾志賀菌和破傷風(fēng)梭菌11種細(xì)菌的基因組DNA作為模板;
      [0049]步驟二,將所述基因組DNA在95°C預(yù)變性5min,然后立即將所述預(yù)變性的基因組DNA置于冰上冷卻;
      [0050]步驟三,取I μ I所`述預(yù)變性的基因組DNA和所述試劑盒中試劑配制成所述LAMP檢測反應(yīng)體系,輕輕混勻;
      [0051]步驟四,將所述配制成的LAMP檢測反應(yīng)體系65°C反應(yīng)Ih進(jìn)行退火和延伸,之后將退火和延伸后的所述LAMP檢測反應(yīng)體系80°C孵育IOmin ;
      [0052]步驟五,所述孵育結(jié)束之后,將所述反應(yīng)體系置于紫外分析儀中測量所述反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度,根據(jù)所述熒光強(qiáng)度的變化確定檢測結(jié)果。
      [0053]如圖1所示,編號為I~12的反應(yīng)管分別對應(yīng)肺炎球菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門菌、白色念珠菌、痢疾志賀菌、破傷風(fēng)梭菌和肉毒桿菌。
      [0054]所述實(shí)施例2與實(shí)施例3中各陰性對照組比較實(shí)施例2中產(chǎn)生高強(qiáng)度DNA擴(kuò)增熒光,如圖1中12號反應(yīng)管,而不攜帶NTNH基因的實(shí)施例3陰性對照菌種不產(chǎn)生高于本底水平的熒光,如圖1中I~11號反應(yīng)管。從而證明對不攜帶NTNH基因的其他菌種的LAMP檢測不會(huì)產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。
      [0055]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上,但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用,它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域,對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言,可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改,因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下,本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出的實(shí)施例。
      【權(quán)利要求】
      1.一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組,其特征在于,包括, 外側(cè)正向引物,其為SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列; 外側(cè)反向引物,其為SEQ ID N0.2所示的多核苷酸序列; 內(nèi)側(cè)正向莖環(huán)引物,其為SEQ ID N0.3所示的多核苷酸序列; 內(nèi)側(cè)反向莖環(huán)引物,其為SEQ ID N0.4所示的多核苷酸序列。
      2.一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒,其特征在于,包括權(quán)利要求1所述引物組。
      3.如權(quán)利要求2所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒,其特征在于,包括含有權(quán)利要求1所述的引物組的反應(yīng)體系,25 μ I所述反應(yīng)體系的配置為:8υ/μ I的鏈置換DNA聚合酶,2 μ I濃度為IOmM內(nèi)側(cè)正向莖環(huán)引物,2 μ I濃度為IOmM的內(nèi)側(cè)反向莖環(huán)引物,0.5μ I濃度為I OmM外側(cè)正向引物,0.5μ I濃度為IOmM外側(cè)反向引物,2.5 μ 110XPCR緩沖液,I μ I濃度為IOmM的dNTPs,I μ I濃度為I~10 μ g/ μ I的待檢測基因組DNA提取液, 1.25 μ 120 X DNA熒光染料和13.25 μ I雙蒸水。
      4.如權(quán)利要求3所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒,其特征在于,所述DNA熒光染料為 10000XSYBR Green I。
      5.如權(quán)利要求2所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒,其特征在于,以待測肉毒桿菌DNA作為檢測組,以肺炎球菌DNA、大腸桿菌DNA、金黃色葡萄球菌DNA、鼠傷寒沙門氏菌DNA、破傷風(fēng)梭菌DNA和白色念珠菌DNA做為陰性對照組,用權(quán)利要求2所述試劑盒配制所述反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP檢測,之后用紫外分析儀測量所述反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。
      6.如權(quán)利要求5所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒,其特征在于,與所述陰性對照組相比所述檢測組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)說明待檢測樣品為肉毒桿菌。
      7.如權(quán)利要求5所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒的檢測反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min,65°C恒溫反應(yīng)Ih和80°C孵育lOmin。
      【文檔編號】C12N15/11GK103497999SQ201310456252
      【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
      【發(fā)明者】楊波, 楊建新, 吳立峰, 郭春雨 申請人:楊波, 楊建新, 吳立峰, 郭春雨
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