Cbf1基因在提高綠色木霉的高溫耐受性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了CBF1基因在提高綠色木霉（Trichoderma?viride）的高溫耐受性的應(yīng)用，并提供一種高溫耐受性好的轉(zhuǎn)CBF1基因綠色木霉工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明中克隆了植物的轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因，構(gòu)建了該基因的真菌表達(dá)雙元載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入到綠色木霉（T.viride）中，獲得的轉(zhuǎn)CBF1基因的綠色木霉菌株的抗高溫脅迫能力有了提高。本發(fā)明對(duì)提高木霉的適應(yīng)環(huán)境的能力，進(jìn)而提高生物防治能力，擴(kuò)大木霉在農(nóng)田中的使用，有著重要的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】CBF1基因在提局綠色木霉的局溫耐受性中的應(yīng)用
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及CBFl基因在提高綠色木霉(Trichoderma viride)的高溫耐受性的應(yīng)用，以及一種轉(zhuǎn)CBFl基因綠色木霉工程菌的構(gòu)建方法。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]木霉(Trichoderma spp.)屬于半知菌亞門(mén)叢梗孢科,是一種多功能的絲狀真菌，在植物病害的生物防治、土壤環(huán)境中有毒物質(zhì)的降解和土壤修復(fù)、土壤有機(jī)質(zhì)的分解腐熟和微生態(tài)區(qū)系改良、纖維素酶的生產(chǎn)和纖維素物質(zhì)的利用等方面有著廣泛的用途。
[0003]木霉是至今為止應(yīng)用最為成功的植物病害生防真菌，常見(jiàn)的木霉有綠色木霉(T.viride)、哈茨木霉(T.hazinum)、康寧木霉(T.konigii)。一些木霉菌株已被廣泛用于植物病害的生物防治，防治鐮刀菌(Fusarium spp.)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、輪枝菌(Verticillia dahelia)、齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)菌等真菌引起的土傳根部病害如根腐病、枯萎病、腐爛病、黃萎病、白絹病`等，也可以防治灰葡萄孢(Botrytiscinerea)等真菌引起的葉部灰霉病等，效果顯著。木霉的生物防治作用機(jī)制主要包括競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、拮抗、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性等幾個(gè)方面。木霉生長(zhǎng)迅速、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求低，分泌豐富的纖維素酶系，可以在植物殘?bào)w、土壤等含有機(jī)質(zhì)的生境中通過(guò)菌絲體生長(zhǎng)和繁殖孢子存活。木霉也可以以其它真菌的菌絲為食，寄生在一些真菌營(yíng)養(yǎng)體上，導(dǎo)致宿主菌絲消解、死亡。木霉產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)包括木霉菌素、木膠霉素等，可以抑制其他微生物的生長(zhǎng)。此外，木霉還可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗病性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)。因此，木霉已經(jīng)被制成孢子粉等多種制劑，廣泛應(yīng)用于植病生防，目前在售的商業(yè)化的木霉制劑已有多種。
[0004]但是，在木霉制劑實(shí)際應(yīng)用于植物病害生物防治的過(guò)程中，防治效果受環(huán)境條件的影響較大。木霉不可避免的要面對(duì)一些不利環(huán)境，如高溫、低溫與高鹽和干旱等，這直接影響木霉生存。對(duì)生物防治來(lái)說(shuō)，木霉首先必需能夠適應(yīng)所處的生態(tài)環(huán)境條件并能夠很好地生存定殖，然后才能顯示出效果。許多在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)表現(xiàn)良好的菌株，在田間應(yīng)用時(shí)往往不能適應(yīng)環(huán)境、不能有效地定殖，從而引起防效下降。尤其是一些濕度較低、溫度過(guò)高或過(guò)低、鹽分較高引起的高滲透壓等不利的土壤環(huán)境條件下，木霉制劑在田間的病害防治效果顯著下降，主要原因就是存活率太低。如冬季較低的溫度成為影響木霉生存的關(guān)鍵因素，在此期間，應(yīng)用木霉可能無(wú)法保護(hù)植物耐寒株植物病原真菌引起的疾病。例如，高緯度地區(qū)冬季禾谷類作物和草坪草發(fā)生的雪霉病的防治。美國(guó)研究者開(kāi)發(fā)出了一株耐寒木霉菌株并申請(qǐng)美國(guó)專利(5418165)，菌株在低溫下的產(chǎn)孢能力增強(qiáng)，可以用于低溫地區(qū)的植物病害防治。作為生物防治劑應(yīng)用的木霉，另一個(gè)最相關(guān)的限制因素是它們不能忍受干燥的條件。土壤水分是影響木霉活動(dòng)的重要因子，如孢子萌發(fā)，芽管生長(zhǎng)和菌絲生長(zhǎng)，水分顯示了對(duì)木霉腐生能力決定性的作用。然而，一些植物病原真菌即使在干燥的土壤也能夠成長(zhǎng)引起植物病害。此外，干旱往往和高滲透壓的土壤環(huán)境伴隨，研究發(fā)現(xiàn)引起番茄萎蔫病的尖孢鐮刀菌(F.0xysporum)在鹽脅迫下孢子萌發(fā)才能啟動(dòng),在高鹽水平下才能侵染番爺并形成萎蔫和黃化等癥狀。[0005]因此，提聞木霉對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)能力，如提聞木霉的耐低溫或聞溫以及對(duì)鹽脅迫和高滲透壓的耐受性，就可以提高其對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力，這對(duì)于木霉在生物防治上的應(yīng)用來(lái)說(shuō)意義重大。利用基因工程技術(shù)對(duì)木霉進(jìn)行遺傳改良，提高其抗逆性是一條很有潛力的途徑。但是，目前對(duì)木霉菌株的基因工程改良主要集中在提高木霉相關(guān)水解酶的表達(dá)，如幾丁質(zhì)酶(chitinases)、纖維素酶(celIulases)、木聚糖酶(xyIanase)、葡聚糖酶(glucanase)和蛋白酶(proteinases)等,對(duì)木霉抗逆性方面的改良則幾乎沒(méi)有。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供CBFl基因在提高綠色木霉(Trichoderma viride)的高溫耐受性的應(yīng)用，并提供一種高溫耐受性好的轉(zhuǎn)CBFl基因綠色木霉工程菌的構(gòu)建方法。
[0007]CBFl基因在提高綠色木霉(Trichoderma viride)的高溫耐受性中的應(yīng)用。綠色木霉一般在20~30°C范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，能夠產(chǎn)生豐富的孢子，在37°C左右的高溫下，生長(zhǎng)減弱，產(chǎn)孢能力下降。本發(fā)明中的轉(zhuǎn)CBFl基因綠色木霉工程菌在37°C高溫下培養(yǎng)處理后，比野生型的非轉(zhuǎn)基因出發(fā)菌株明顯提高了產(chǎn)孢能力。
[0008]具體的，所述CBFl基因序列如SEQ ID N0.1所示:
[0009]I atgaactcat tttcagcttt ttctgaaatg tttggctccg attacgagcc tcaaggcgga
[0010]61 gattattgtc cgacgttggc cacgagttgt ccgaagaaac cggcgggtcg taagaagttt
[0011]121 cgtgaaactc gtcacccaat ttacagagga gttcgtcaaa gaaactccgg taagtgggtg
[0012]181 tctgaagtga gagagccaaa caagaaaacg aggatttggc tcgggacttt ccaaaccgct
[0013]241 gagatggcag ctcgtgctca cgacgtcgct gcattagccc tccgtggccg atcagcatgt
[0014]301 ctcaacttcg ctgactcggc ttggcggcta cgaatccctg agtcaacatg cgccaaggat
[0015]361 atccaaaaag cggctgctga agcggcgttg gcttttcaag atgagacgtg tgatacgacg
[0016]421 accacggatc atggcctgga catggaggag acgatggtgg aagctattta tacaccggaa
[0017]481 cagagcgaag gtgcgtttta tatggatgag gagacaatgt ttgggatgcc gagtttgttg
[0018]541 gataatatgg ctgaaggcat gcttttaccg ccgccgtctg ttcagtggaa tcataattat
[0019]601 gacggcgaag gagatggtga cgtgtcactt tggagttact aa
[0020]本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)CBFl基因綠色木霉工程菌的構(gòu)建方法，所述方法包括:
[0021](I)將序列如SEQ ID N0.1所示的CBFl基因與載體pENTR混合，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列正確后，得到pENTR-CBFl ；
[0022](2)將pENTR-CBFl與載體ImpGWB502通過(guò)LR重組反應(yīng)將CBFl基因轉(zhuǎn)移，經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)后，得到表達(dá)載體ImpGWB502-CBFl ；
[0023](3)將表達(dá)載體ImpGWB502_CBFl轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，經(jīng)PCR鑒定，獲得帶有目的質(zhì)粒ImpGWB502-CBFl 的農(nóng)桿菌；
[0024](4)將帶有目的質(zhì)粒ImpGWB502-CBFl的農(nóng)桿菌接種于含100 μ g/mL壯觀霉素+50 μ g/mL利福平的LB固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)2~3天后，挑取單菌落接于含100 μ g/mL壯觀霉素+50 μ g/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28°C、200r/min培養(yǎng)至菌體OD6tltl為1.0時(shí)，用MM液體培養(yǎng)基將菌液稀釋0D_至0.15，再加入200 μ mol/mL的乙酰丁香酮，于28°C、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)5~6h，至OD6tltl為0.5~0.6，得到農(nóng)桿菌菌液；
[0025](5)步驟(4)所得農(nóng)桿菌菌液與等體積的濃度為I X IO6~I X IO7個(gè)/mL的綠色木霉孢子混懸液混合后，涂布于含200 μ mol/mL乙酰丁香酮的MM固體培養(yǎng)基上,24°C共培養(yǎng)48h，篩選陽(yáng)性克隆并經(jīng)PCR鑒定，獲得所述轉(zhuǎn)CBFl基因綠色木霉工程菌；
[0026]所述MM液體培養(yǎng)基組成如下:IOmM葡萄糖，0.5%甘油，200 μ M乙酰丁香酮，2.5mMNaCl, 2mM MgSO4,0.45mM CaCl2,9mM FeSO4,4mM(NH4)2SO4,溶劑為 ρΗ5.3 的磷酸緩沖液；所述MM固體培養(yǎng)基組成如下:15g/L瓊脂，IOmM葡萄糖，0.5%甘油，200 μ M乙酰丁香酮，2.5mMNaCl, 2mM MgSO4,0.45mM CaCl2,9mM ?6504，4禮(順4)2504，溶劑為口冊(cè).3 的磷酸緩沖液。
[0027]本發(fā)明中克隆了植物的轉(zhuǎn)錄因子CBFl基因，構(gòu)建了該基因的真菌表達(dá)雙元載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入到綠色木霉(T.viride)中，獲得的轉(zhuǎn)CBFl基因的綠色木霉菌株的抗高溫脅迫能力有了提高。至今，還沒(méi)有應(yīng)用CBFl基因提高木霉抗逆能力的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明對(duì)提聞木霉的適應(yīng)環(huán)境的能力，進(jìn)而提聞生物防治能力，擴(kuò)大木霉在農(nóng)田中的使用，有著重要的應(yīng)用前景。
[0028]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:按照本發(fā)明方法可以對(duì)綠色木霉實(shí)施基因工程并構(gòu)建轉(zhuǎn)CBFl基因的工程菌，轉(zhuǎn)CBFl基因的綠色木霉菌可以提高對(duì)溫度的耐受性范圍，高溫下存活率提高和產(chǎn)孢能力增強(qiáng)。這樣，轉(zhuǎn)CBF基因的木霉就可以擴(kuò)大其應(yīng)用的環(huán)境，定殖能力和存活率提高，提高該菌在植物病害的生物防治、土壤的生物修復(fù)和改良、生物肥料制備等方面的應(yīng)用效果 。
(四)【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為CBFl基因PCR擴(kuò)增片段電泳結(jié)果圖；
[0030]圖2為ImpGWB502-CBFl與載體構(gòu)建示意圖；
[0031]圖3為CBFl轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果；M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1:野生型菌株；2~8:轉(zhuǎn)化子菌株；
[0032]圖4為CBFl轉(zhuǎn)化子與野生型在4°C、PDA平板上的生長(zhǎng)情況；WT:野生型；CBF1_4、CBF1-13:轉(zhuǎn)化子；
[0033]圖5為野生型木霉與轉(zhuǎn)化子在PDA平板上的產(chǎn)孢情況；WT:野生型；CBF1_4、CBF1-9、CBF1-12:轉(zhuǎn)化子。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0035]實(shí)施例1:
[0036]一、CBFl基因克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建
[0037]提取擬南芥mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到CBFl基因片段。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)CBFl基因(GenBank:FJ169262.1)序列設(shè)計(jì)引物，在基因的起始密碼子前加入CACC核苷酸序列，便于克隆。引物對(duì)為:
[0038]CBFl-FOl CACCATGAACTCATTTTCGACTTT,
[0039]CBF1-R642 TTAGTAACTCCAAAGTGACACGT
[0040]經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，得到的目標(biāo)克隆CBFl基因片段長(zhǎng)度為642bp (序列見(jiàn)SEQ IDN0.1), PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1，對(duì)目的片段進(jìn)行切膠回收、純化?；厥债a(chǎn)物用于下一步驟。
[0041]基因克隆和載體構(gòu)建采用Gateway?克隆技術(shù)(Invitrogen公司)。將擴(kuò)增得到的CBFl基因片段和載體pENTR?/ D-TOPO" (Invitrogen)混合后25°C溫育5min，轉(zhuǎn)化大腸
桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列正確后，得到pENTR-CBFl。
[0042]pENTR-CBFl和雙元目標(biāo)表達(dá)載體ImpGWB502 (日本Sumie Ishiguro教授提供)之間通過(guò)LR重組反應(yīng)(LR Mix, Invitrogen)將CBFl基因轉(zhuǎn)移，LR反應(yīng)產(chǎn)物和大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞混合轉(zhuǎn)化，得到陽(yáng)性菌落克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)后得到表達(dá)載體ImpGWB502-CBFl，將該載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，進(jìn)行下一步的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉轉(zhuǎn)基因。
[0043]LR反應(yīng)體系:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.CBFl基因在提高綠色木霉(Trichoderma viride)的高溫耐受性中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述CBFl基因序列如SEQID N0.1所示。
3.—種轉(zhuǎn)CBFl基因綠色木霉工程菌的構(gòu)建方法，所述方法包括: (1)將序列如SEQID N0.1所示的CBFl基因與載體pENTR混合，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列正確后，得到pENTR-CBFl ； (2)將pENTR-CBFl與載體ImpGWB502通過(guò)LR重組反應(yīng)將CBFl基因轉(zhuǎn)移，經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)后，得到表達(dá)載體ImpGWB502-CBFl ； (3)將表達(dá)載體ImpGWB502-CBFl轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，經(jīng)PCR鑒定，獲得帶有目的質(zhì)粒ImpGWB502-CBFl 的農(nóng)桿菌； (4)將帶有目的質(zhì)粒ImpGWB502-CBFl的農(nóng)桿菌接種于含100μ g/mL壯觀霉素+50 μ g/mL利福平的LB固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)2~3天后，挑取單菌落接于含100 μ g/mL壯觀霉素+50 μ g/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28°C、200r/min培養(yǎng)至菌體OD6tltl為1.0時(shí)，用MM液體培養(yǎng)基將菌液稀釋OD6tltl至0.15，再加入200 μ mol/mL的乙酰丁香酮，于28°C、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)5~6h，至OD6tltl為0.5~0.6，得到農(nóng)桿菌菌液； (5)步驟(4)所得農(nóng)桿菌菌液與等體積的濃度為IX IO6~I X IO7個(gè)/mL的綠色木霉孢子混懸液混合后，涂布于含200 μ mol/mL乙酰丁香酮的MM固體培養(yǎng)基上,24°C共培養(yǎng)48h,篩選陽(yáng)性克隆并經(jīng)PCR鑒定，獲得所述轉(zhuǎn)CBFl基因綠色木霉工程菌； 所述麗液體培養(yǎng)基組成如下:10mM葡萄糖，0.5%甘油，200μΜ乙酰丁香酮,2.5mMNaCl, 2mM MgSO4,0.45mM CaCl2,9mM FeSO4,4mM(NH4)2SO4,溶劑為 ρΗ5.3 的磷酸緩沖液；所述MM固體培養(yǎng)基組成如下:15g/L瓊脂，IOmM葡萄糖，0.5%甘油，200 μ M乙酰丁香酮，2.5mMNaCl, 2mM MgSO4,0.45mM CaCl2,9mM ?6504，4禮(順4)2504，溶劑為口冊(cè).3 的磷酸緩沖液。
【文檔編號(hào)】C12R1/885GK103525853SQ201310456814
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】朱廷恒, 王渭霞, 陳勇, 汪琨, 崔志峰 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)