從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法及進(jìn)行克隆非人動(dòng)物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法以及一種對(duì)非人動(dòng)物進(jìn)行克隆的方法。所述從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法包括以下步驟：將所述血液加入到分離液上層后利用密度梯度離心的方式進(jìn)行離心，以便獲得單個(gè)核細(xì)胞；將所述單個(gè)核細(xì)胞接種于含有貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基的體外培養(yǎng)設(shè)備，以便獲得貼壁細(xì)胞；以及將所述貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以便獲得體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。該方法獲得的體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞可以直接用于手工克隆非人動(dòng)物，不僅操作過(guò)程簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)、成本較低，且該方法對(duì)動(dòng)物應(yīng)激刺激少、傷害小，可以保證動(dòng)物的完整外觀、改善動(dòng)物福利。
【專利說(shuō)明】從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法及進(jìn)行克隆非人動(dòng)物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法及克隆非人動(dòng)物的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]體細(xì)胞核移植又稱克隆，是動(dòng)物細(xì)胞工程最常用的技術(shù)手段。通過(guò)電擊法或直接顯微注射法將分化程度較高的體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至卵母細(xì)胞中，再經(jīng)過(guò)化學(xué)激活，使其重新編程發(fā)育成胚胎，將其移植回代孕母體內(nèi)，出生完整個(gè)體。傳統(tǒng)的體細(xì)胞核移植技術(shù)需要昂貴、精密的顯微操作系統(tǒng)，對(duì)操作人員的技術(shù)要求很高，不適用于大規(guī)模的克隆動(dòng)物生產(chǎn)。
[0003]2001年，丹麥科學(xué)家Gabor Vajta首次提出了手工克隆技術(shù)，該技術(shù)最大的關(guān)鍵點(diǎn)是利用刀片實(shí)現(xiàn)“切割去核”，從而完全擺脫顯微操作系統(tǒng)，降低了克隆這項(xiàng)技術(shù)的儀器投入以及人工支出成本，使克隆這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于未來(lái)的產(chǎn)業(yè)化成為可能。目前體細(xì)胞核移植的囊胚率在20%-30%之間，而手工克隆動(dòng)物囊胚率能提高至40%-60%。
[0004]由此，目前用于體細(xì)胞移植的供核細(xì)胞來(lái)源仍有待改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問(wèn)題之一。
[0006]本發(fā)明是發(fā)明人基于如下事實(shí)發(fā)現(xiàn)的:近年來(lái)，克隆動(dòng)物越來(lái)越具有其廣闊的應(yīng)用前景，例如可用于優(yōu)質(zhì)畜種的培育，以有利于瀕危動(dòng)物種質(zhì)資源保存；生產(chǎn)各類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由此獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有遺傳物質(zhì)均一性、表型一致性等特點(diǎn)，更適用于藥理學(xué)各項(xiàng)研究；將克隆運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因，可高效率得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，縮短實(shí)驗(yàn)周期，大量獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在體細(xì)胞核移植的過(guò)程中，供體細(xì)胞種類繁多，包括具有多潛能性的胚胎干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以及終端分化細(xì)胞成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等。胚胎干細(xì)胞來(lái)源于囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)可超過(guò)上百代，但是操作繁瑣，不適于大規(guī)模建系傳代，并且由于其來(lái)源的特殊性，無(wú)法得到成體動(dòng)物的相關(guān)信息，對(duì)于優(yōu)質(zhì)種系克隆具有一定局限性；而骨骼來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁細(xì)胞，主要是通過(guò)分離動(dòng)物股骨中的骨髓而得到目標(biāo)細(xì)胞，但采用此方法收集的樣品，需要將動(dòng)物先處死以方便進(jìn)行采集；其它來(lái)源的用于供核細(xì)胞，在不同程度上都會(huì)對(duì)動(dòng)物個(gè)體造成組織、器官創(chuàng)傷。目前成纖維是最為常用的克隆體細(xì)胞類型，但是對(duì)于豬、牛、羊等大動(dòng)物，基本都是采集其耳緣組織在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)，但是由于其本身的生長(zhǎng)環(huán)境因素等原因，樣品采集很難保證無(wú)菌，后期在體外培養(yǎng)制備過(guò)程中細(xì)菌、真菌污染的概率很高。
[0007]為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激刺激少、傷害小，保證動(dòng)物外觀完整的從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法。該方法包括以下步驟:將所述血液加入到分離液上層后利用密度梯度離心的方式進(jìn)行離心，以便獲得單個(gè)核細(xì)胞；將所述單個(gè)核細(xì)胞接種于含有貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基的體外培養(yǎng)設(shè)備，以便獲得貼壁細(xì)胞；以及將所述貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以便獲得體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中提取、培養(yǎng)細(xì)胞的方法制備的體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞用于手工克隆體細(xì)胞核移植，囊胚效率在最高可達(dá)55%，平均囊胚率在40%左右。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法不僅操作過(guò)程簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)、成本較低，且該方法對(duì)動(dòng)物應(yīng)激刺激少、傷害小，可以保證動(dòng)物的完整外觀、改善動(dòng)物福利。
[0008]另外，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征:
[0009]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述血液來(lái)自外周血。由于外周血采集操作相對(duì)簡(jiǎn)單、對(duì)動(dòng)物應(yīng)激刺激少、傷害小，由此不僅可以改善動(dòng)物福利，且血液與外界相對(duì)較為封閉，后期細(xì)胞培養(yǎng)污染率基本為零，提高了細(xì)胞成活率。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述分離液為中性粒細(xì)胞分離液。由此，可以有效地通過(guò)利用密度梯度離心的方式將血液中的各種細(xì)胞成分按照密度的大小進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)離心操作血液被分為若干層，每層中含有不同的血液細(xì)胞成分，從而有效地得到單個(gè)核細(xì)胞。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述中性粒細(xì)胞分離液的密度為1.077g/mL，其中，所述中性粒細(xì)胞分離液含有57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸鈉。由此，含有上述成分的中性粒細(xì)胞分離液提高了分離血液中不同細(xì)胞成分的分離效率，從而可以有效地從其中單核細(xì)胞層獲得血液中的單個(gè)核細(xì)胞。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述單個(gè)核細(xì)胞是從所述分離液離心后中間層收集的。利用密度梯度離心的方式將血液加入上述分離液中進(jìn)行離心分離后，血液在上述分離液中被分為若干層，每層中分別含有不同細(xì)胞成分，由此，可以直接從中間層收集單個(gè)核細(xì)胞，不僅實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程簡(jiǎn)單、易于實(shí)驗(yàn)，且分層后的每層中的細(xì)胞成分單一，由此提高了單個(gè)核細(xì)胞的分離效率。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所述單個(gè)核細(xì)胞接種于含有貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基的體外培養(yǎng)設(shè)備，以便獲得貼壁細(xì)胞進(jìn)一步包括:首先，將用PBS清洗后的單個(gè)核細(xì)胞利用第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基在37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí),所述第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)包括低糖-MEM、15%FBS、I X非必需氨基酸、10ng/mL的bFGF和30IU/mL肝素；接著，將培養(yǎng)基更換為第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)在37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所述第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基包括MEM- a、15%FBS、I X非必需氨基酸和10ng/mL的bFGF。由此，經(jīng)過(guò)分離的單個(gè)核細(xì)胞可以首先在適宜的營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行初步適應(yīng)性體外培養(yǎng)，該單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)含有低糖-MEM的第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為含有MEM- α的第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，從而可以得到貼壁性良好的細(xì)胞，并且顯微鏡下呈長(zhǎng)梭形成長(zhǎng)，其細(xì)胞核較大，生長(zhǎng)較快，因此適合用于手工克隆體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述體外培養(yǎng)設(shè)備是明膠包被的培養(yǎng)皿或明膠包被的培養(yǎng)板。由于，明膠是是多細(xì)胞生物的細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)成份，可以促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和增殖、特異性形態(tài)和功能表達(dá)，常用于各種細(xì)胞的原代細(xì)胞的體外培養(yǎng)。由此不僅可以提高單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)設(shè)備中的貼壁效率，并且與其它促貼壁類試劑相比，實(shí)驗(yàn)成本較低。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所述貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)進(jìn)一步包括，將所述貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)2-20代。由此，可以將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活性良好、細(xì)胞核較大的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步用于手工克隆體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)。
[0016]本發(fā)明的另一目的在于提供一種對(duì)非人動(dòng)物進(jìn)行克隆的方法，包括:利用上述從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法，制備體細(xì)胞移植的供體細(xì)胞；以及基于所述體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞，通過(guò)手工克隆，進(jìn)行克隆非人動(dòng)物。由此，可以利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的上述從血液中分離、培養(yǎng)的細(xì)胞，通過(guò)手工克隆，獲得非人動(dòng)物。由于通過(guò)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法不僅實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)、成本較低，且該方法對(duì)動(dòng)物應(yīng)激刺激少、傷害小，可以保證動(dòng)物的完整外觀、改善動(dòng)物福利，因此將獲得的體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞用于非人動(dòng)物克隆具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0017]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0019]圖1為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法示意圖。
[0020]圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的利用從血液中分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行非人細(xì)胞克隆的方法示意圖。
[0021]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的豬前腔靜脈密度梯度分離后培養(yǎng)7d后通過(guò)200倍相差顯微鏡觀察到的細(xì)胞圖。
[0022]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的豬前腔靜脈密度梯度分離后培養(yǎng)7d后通過(guò)200倍相差顯微鏡觀察到的細(xì)胞圖，其中部分細(xì)胞呈接觸抑制生長(zhǎng)。
[0023]圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中分離細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)傳代至Pl代通過(guò)100倍相差顯微鏡觀察到的細(xì)胞圖。
[0024]圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中分離細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)傳代至Pl代通過(guò)200倍相差顯微鏡觀察到的細(xì)胞圖。
[0025]圖7:顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的將分離、培養(yǎng)的細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植，第5天通過(guò)100倍霍夫曼顯微鏡觀察到的囊胚形態(tài)圖。
[0026]圖8:顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的流式細(xì)胞分析結(jié)果圖:
[0027]8A為表面標(biāo)記了⑶29的卵母細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果圖；
[0028]8B為表面標(biāo)記了⑶90的卵母細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果圖；
[0029]8C為表面標(biāo)記了⑶34的卵母細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果圖；
[0030]8D為表面標(biāo)記了⑶45的卵母細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果圖。
[0031]圖9為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法基于本發(fā)明實(shí)施例的體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞，并通過(guò)手工克隆得到的非人動(dòng)物。

【具體實(shí)施方式】
[0032]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0033]此外，術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。
[0034]本發(fā)明是發(fā)明人基于如下事實(shí)發(fā)現(xiàn)的:近年來(lái)，克隆動(dòng)物越來(lái)越具有其廣闊的應(yīng)用前景，例如可用于優(yōu)質(zhì)畜種的培育，以有利于瀕危動(dòng)物種質(zhì)資源保存；生產(chǎn)各類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由此獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有遺傳物質(zhì)均一性、表型一致性等特點(diǎn)，更適用于藥理學(xué)各項(xiàng)研究；將克隆運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因，可高效率得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，縮短實(shí)驗(yàn)周期，大量獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在體細(xì)胞核移植的過(guò)程中，供體細(xì)胞種類繁多，包括具有多潛能性的胚胎干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以及終端分化細(xì)胞成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等。胚胎干細(xì)胞來(lái)源于囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)可超過(guò)上百代，但是操作繁瑣，不適于大規(guī)模建系傳代，并且由于其來(lái)源的特殊性，無(wú)法得到成體動(dòng)物的相關(guān)信息，對(duì)于優(yōu)質(zhì)種系克隆具有一定局限性；而骨骼來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁細(xì)胞，主要是通過(guò)分離動(dòng)物股骨中的骨髓而得到目標(biāo)細(xì)胞，但采用此方法收集的樣品，需要將動(dòng)物先處死以方便進(jìn)行采集；其它來(lái)源的用于供核細(xì)胞，在不同程度上都會(huì)對(duì)動(dòng)物個(gè)體造成組織、器官創(chuàng)傷。目前成纖維是最為常用的克隆體細(xì)胞類型，但是對(duì)于豬、牛、羊等大動(dòng)物，基本都是采集其耳緣組織在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)，但是由于其本身的生長(zhǎng)環(huán)境因素等原因，樣品采集很難保證無(wú)菌，后期在體外培養(yǎng)制備過(guò)程中細(xì)菌、真菌污染的概率很高。
[0035]由此在本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法。該方法包括以下步驟:將所述血液加入到分離液上層后利用密度梯度離心的方式進(jìn)行離心，以便獲得單個(gè)核細(xì)胞；將所述單個(gè)核細(xì)胞接種于含有貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基的體外培養(yǎng)設(shè)備，以便獲得貼壁細(xì)胞；以及將所述貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以便獲得體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中提取、培養(yǎng)細(xì)胞的方法制備的體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞用于手工克隆體細(xì)胞核移植，囊胚效率在最高可達(dá)55%，平均囊胚率在40%左右。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法不僅操作過(guò)程簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)、成本較低，且該方法對(duì)動(dòng)物應(yīng)激刺激少、傷害小，可以保證動(dòng)物的完整外觀、改善動(dòng)物福利。
[0036]下面結(jié)合附圖1和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明:
[0037]SlOl:將血液加入到分離液上層后利用密度梯度離心的方式進(jìn)行離心，以便獲得單個(gè)核細(xì)胞
[0038]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，分離血液中細(xì)胞的方式并不受特別限制，只要可以達(dá)到所采用的血液采集的方式對(duì)動(dòng)物刺激傷害小的目的，可以采用本領(lǐng)域常用的血液采集方法，根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施例，可以通過(guò)尾靜脈、耳緣靜脈等方式進(jìn)行血液采集，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體示例，可以從豬身上通過(guò)使用50mL的注射器直接抽取豬前腔靜脈血方式提取外周血。由于外周血采集操作相對(duì)簡(jiǎn)單、對(duì)動(dòng)物應(yīng)激刺激少、傷害小，由此不僅可以改善動(dòng)物福利，且血液與外界相對(duì)較為封閉，后期細(xì)胞培養(yǎng)污染率基本為零，提高了細(xì)胞成活率。
[0039]本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)上述獲得的外周血進(jìn)行保存的方式并不受特別限制，只要可以防止所采集獲得的外周血在進(jìn)行分離步驟前凝固，可以采用本領(lǐng)域常用的抗凝方式，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，可以采用向所采集的外周血中加入肝素進(jìn)行抗凝。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，向1mL所采集的外周血中加入125IU肝素可以有效的防止所采集的外周血凝固。此夕卜，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，加入肝素的外周血是置于4攝氏度條件下進(jìn)行保存運(yùn)輸?shù)?。由此，不僅可以防止所采集的外周血凝固，而且可以防止外周血中的有效活性細(xì)胞成分降解，從而利于下一步的分離細(xì)胞操作。
[0040]由于血液中含有紅細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞等各種細(xì)胞，因此需要將上述細(xì)胞進(jìn)行分離，從其中提取體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞用，從而用于手工克隆。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從血液中分離單個(gè)核細(xì)胞的方式并不受特別限制，可以采用本領(lǐng)域常用的各種細(xì)胞分離方式，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以利用將上述所采集的外周血加入分離液上層和密度梯度離心的方法對(duì)上述外周血液進(jìn)行分離。由此，可以有效地利用分離液和密度梯度離心的方式將血液中的各種細(xì)胞成分按照密度的大小進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)離心操作血液被分為若干層，每層中含有不同的血液細(xì)胞成分，從而有效地得到單個(gè)核細(xì)胞。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所采用的對(duì)上述外周血液進(jìn)行分離的分離液并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述分離液為中性粒細(xì)胞分離液，所述中性粒細(xì)胞分離液的密度為1.077g/mL,并且具所述中性粒細(xì)胞分離液的具體成分為57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸鈉。由此，含有上述成分的中性粒細(xì)胞分離液提高了分離血液中不同細(xì)胞成分的分離效率，從而可以有效地從上述經(jīng)過(guò)分層外周血的單核細(xì)胞層獲得血液中的單個(gè)核細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，經(jīng)過(guò)離心后的血液成分依據(jù)不同的密度被分為若干層，試管中從上到下的分層包括但不限于血漿層、細(xì)胞層、分離液層、中性粒細(xì)胞層、其余的分離液層和紅細(xì)胞沉淀層，其中所述單個(gè)核細(xì)胞處于中間云浮狀細(xì)胞層。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，收集所分離的單個(gè)核細(xì)胞的方法并不受特別限制，可以為本領(lǐng)域常用的各種收集方法，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以采用移液吸管將中間云浮狀細(xì)胞層中的單個(gè)核細(xì)胞吸取出來(lái)，并進(jìn)一步對(duì)吸取出來(lái)的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行清洗，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，清洗的次數(shù)可以為2-3次。由此，可以提高對(duì)血液細(xì)胞的分離效率，從而得到高質(zhì)量的單個(gè)核細(xì)胞。
[0042]S102:將單個(gè)核細(xì)胞接種于體外培養(yǎng)設(shè)備，以便獲得貼壁細(xì)胞
[0043]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將上述分離出并且清洗的單個(gè)核細(xì)胞接種于含有貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基的體外培養(yǎng)設(shè)備，以便獲得貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)分離出的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的方式并不受特別限制，只要可以使得上述單個(gè)核細(xì)胞貼壁正常生長(zhǎng)，可以采用本領(lǐng)域常用的各種體外培養(yǎng)方法，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，首先將經(jīng)過(guò)清洗的單個(gè)核細(xì)胞利用第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基在37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基的成分不受特別限制，只要含有足夠的營(yíng)養(yǎng)并且適合剛從血液分離出來(lái)的單個(gè)核細(xì)胞在體外培養(yǎng)設(shè)備中進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)，可以采用本領(lǐng)域常用的各種貼壁培養(yǎng)基，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含低糖-MEM、15%FBS、[I X ]非必需氨基酸、10ng/mL的bFGF和30IU/mL肝素。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，48小時(shí)后將所述第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基更換為第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)在37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所述第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基額可以包含MEM-a、15%FBS、[IX]非必需氨基酸和10ng/mL的bFGF。其中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，48小時(shí)后將所述第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基更換為第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基的方式并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以先將所述第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，然后采用PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗以便去除殘留的第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基，再將第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基加入到已經(jīng)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，清洗的次數(shù)可以為1-2次。其中，ΜΕΜ-α是一種改良的MEM培養(yǎng)基，添加了多種非必需氨基酸和維他命Β12、C等；而使用低糖-MEM可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，48h后改用ΜΕΜ-α可以減少貼壁的血細(xì)胞，從而有利于貼壁的有核細(xì)胞生長(zhǎng)。由此，經(jīng)過(guò)分離的單個(gè)核細(xì)胞可以首先在適宜的營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行初步適應(yīng)性體外培養(yǎng)(即利用含有低糖-MEM的第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí))，將培養(yǎng)基更換為更適合已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)的含有MEM- α的第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，從而使得上述從外周血液中分出的單個(gè)核細(xì)胞可以在營(yíng)養(yǎng)成分組成合適并且充足的貼壁培養(yǎng)基中進(jìn)行適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所采用的體外培養(yǎng)設(shè)備并不受特別限制，只要適合從血液中分離出的單個(gè)核細(xì)胞生長(zhǎng)，可以采用本領(lǐng)域常用的各種培養(yǎng)設(shè)備并根據(jù)需要進(jìn)行選擇，例如35mm培養(yǎng)皿、60mm培養(yǎng)皿、10mm培養(yǎng)皿、6孔板和4孔板，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所采用的體外培養(yǎng)可以是明膠包被的培養(yǎng)皿或明膠包被的培養(yǎng)板。由于，明膠是是多細(xì)胞生物的細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)成份，可以促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和增殖、特異性形態(tài)和功能表達(dá)，常用于各種細(xì)胞的原代細(xì)胞的體外培養(yǎng)。由此不僅可以提高單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)設(shè)備中的貼壁效率，并且降低了實(shí)驗(yàn)成本。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，采用第而貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方式并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以采用2-3天進(jìn)行一次換液操作從而可以保持貼壁的單個(gè)核細(xì)胞始終處于營(yíng)養(yǎng)成分適合且充足的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法獲得的單個(gè)核細(xì)胞貼壁性良好，生長(zhǎng)較快，顯微鏡下呈長(zhǎng)梭形成長(zhǎng)，其細(xì)胞核仁較大、且清晰可見(jiàn)，因此適合用于手工克隆體細(xì)胞核移植(見(jiàn)圖3)。
[0045]S103:將貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以便獲得體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞
[0046]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞成團(tuán)狀接觸抑制裝生長(zhǎng)時(shí)(見(jiàn)圖4)，可以進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以將所述貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)2-20代。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將上述呈團(tuán)狀接觸抑制裝生長(zhǎng)的貼壁的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)的方式并不受特別限制，可以為本領(lǐng)域常用的各種傳代方法，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以采用如下步驟:棄去原培養(yǎng)基；加入PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞2次；棄去PBS緩沖液后將細(xì)胞消化液加入細(xì)胞，并將細(xì)胞放置于37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化；加入貼壁培養(yǎng)基2并與經(jīng)過(guò)消化的單個(gè)核細(xì)胞混合均勻，以便獲得細(xì)胞懸液；將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到經(jīng)過(guò)明膠包被的培養(yǎng)設(shè)備中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過(guò)本發(fā)明實(shí)施例的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的方法獲得單個(gè)核細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，增殖性好(見(jiàn)圖5和圖6)。其中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所采用的消化液并不受特別限制，在顯微鏡下觀察只要可以使得貼壁細(xì)胞逐漸變圓變亮，并逐漸脫離細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備從而漂浮于細(xì)胞消化液中，可以采用本領(lǐng)域常用的各種細(xì)胞消化液，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，細(xì)胞消化液可以為0.05%胰酶-200mg/L EDTA0由此，可以將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、活性良好、細(xì)胞核較大的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步用于手工克隆體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)。
[0047]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)非人動(dòng)物進(jìn)行克隆的方法，包括:利用上述從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法，制備體細(xì)胞移植的供體細(xì)胞；以及基于所述體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞，通過(guò)手工克隆，進(jìn)行克隆非人動(dòng)物。由此，可以利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的上述從血液中分離、培養(yǎng)的細(xì)胞，通過(guò)手工克隆，獲得非人動(dòng)物。由于通過(guò)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法不僅實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)、成本較低，且該方法對(duì)動(dòng)物應(yīng)激刺激少、傷害小，可以保證動(dòng)物的完整外觀、改善動(dòng)物福利，因此將獲得的體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞用于非人動(dòng)物克隆具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0048]下面結(jié)合附圖2和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的利用從血液中分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行非人細(xì)胞克隆的方法做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明:
[0049]S201:卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)以及表面分子鑒定
[0050]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，采集卵母細(xì)胞的方式并不受特別限制，只要可以得到健康的卵細(xì)胞，可以采用本領(lǐng)域常用的各種方法，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，可以包括以下步驟:將收集的卵巢放置在裝有生理鹽水的容器內(nèi)并保持35攝氏度恒溫；然后將上述卵巢放置于裝有胚胎洗滌液的培養(yǎng)皿中，利用刀片將卵泡劃破，以便使得卵細(xì)胞流出；以及將上述卵細(xì)胞收集于預(yù)先平衡的含有卵細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)設(shè)備中培養(yǎng)至卵細(xì)胞成熟。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將卵細(xì)胞培養(yǎng)至成熟的條件不受特別限制，可以為本領(lǐng)域常用的各種卵細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，為了達(dá)到PH值相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，預(yù)先將培養(yǎng)基放置在5%濃度的二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行平衡，然后將卵細(xì)胞收集于預(yù)先平衡的含有胚胎成熟培養(yǎng)基(IVM)四孔板中，每個(gè)孔50個(gè)胚胎，并將上述載有卵細(xì)胞的四孔版置于38.5攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中成熟42h。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述胚胎洗滌液并不受特別限制，可以是本領(lǐng)域常用的各種對(duì)胚胎進(jìn)行洗滌的液體，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所采用的胚胎洗滌液(ASP)中包含:10%v/v的10XTCM199、0.17mg/mL的碳酸氫鈉、0.20mg/mL的丙酮酸鈉、3.60mg/mL赫佩斯鈉鹽、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、3.00 μ g/mL的兩性霉素B、30IU/mL的肝素、2%的血清。由此，可以去除卵巢切割物中的碎片，從而降低所培養(yǎng)目的細(xì)胞的污染幾率，提高細(xì)胞存活率。
[0051 ] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，胚胎成熟培養(yǎng)基(IVM)并不受特別限制，可以為本領(lǐng)域常用的對(duì)胚胎進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例，所采用的胚胎成熟培養(yǎng)基(IVM)包含:[IX]的TCM199、5IU/mL的人絨毛膜促性腺激素、lIU/mL的孕馬血清、0.10mg/mL的谷氨酰胺、0.05mg/mL慶大霉素、10%卵泡液、10%v/v血清。由此，通過(guò)使卵細(xì)胞在該培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)42小時(shí)的培養(yǎng)，可以促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，排出第一極體，從而提高成熟效率(第一極體排出率)，約大于80%。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)所獲得的卵母細(xì)胞進(jìn)行鑒定的方法不受特別限制，可以為本領(lǐng)域常用的各種細(xì)胞鑒定方法，包括但不限于細(xì)胞表面分子標(biāo)記法、流式細(xì)胞法等。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，利用 CD29、CD90、CD34、CD45、FITC Mouse IgGl 和 PE Mouse IgG17種不同的抗體對(duì)所獲得的卵母細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記，然后利用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀以及WinMDI2.8軟件進(jìn)行分析，以便確定所獲得的細(xì)胞是否為間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0053]S202:卵母細(xì)胞脫卵丘及去核
[0054]將上述培養(yǎng)成熟的卵細(xì)胞從含有胚胎成熟培養(yǎng)基(IVM)的四孔板中轉(zhuǎn)移至透明質(zhì)酸酶中，以便脫去卵丘顆粒細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將培養(yǎng)成熟的卵細(xì)胞從含有胚胎成熟培養(yǎng)基(IVM)的四孔板中轉(zhuǎn)移至透明質(zhì)酸酶中的轉(zhuǎn)移操作并不受特別限制，可以是本領(lǐng)域常用的轉(zhuǎn)移卵細(xì)胞的技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，利用移液槍將成熟完全的卵母細(xì)胞從含有胚胎成熟培養(yǎng)基(IVM)的四孔板中至透明質(zhì)酸酶中。其中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所采用的透明質(zhì)酸酶的濃度并不受特別限制，只要可以脫去卵丘顆粒細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)細(xì)胞的濃度以及試劑的種類進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所采用的透明質(zhì)酸酶的濃度可以為lmg/mL。透明質(zhì)酸酶主要作用是溶解卵丘細(xì)胞間透明質(zhì)酸，從而使卵丘細(xì)胞分散，由此，可以采用適當(dāng)?shù)臐舛葘⑸鲜雠囵B(yǎng)成熟的卵細(xì)胞中的卵丘細(xì)胞分散以便進(jìn)一步去除。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，脫去卵丘顆粒細(xì)胞的操作并不受特別限制，可以采用本領(lǐng)域常用的各種技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施利，發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，采用具有槍頭的移液槍來(lái)回吸打含有卵母細(xì)胞的透明質(zhì)酸酶，可以利用槍頭的小口徑反復(fù)對(duì)卵細(xì)胞進(jìn)行吸打，從而脫去成熟卵細(xì)胞外周與之進(jìn)行代謝聯(lián)系的卵丘顆粒細(xì)胞。
[0055]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，去除卵細(xì)胞核的方法并不受特別限制，可以為本領(lǐng)域常用的各種去核方法，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例，可以先將上述去除了卵丘細(xì)胞的裸露卵母細(xì)胞放置于蛋白酶中，以便將卵母細(xì)胞表層的透明帶消化松散，然后將其轉(zhuǎn)移至第二胚胎操作液操作滴中，并根據(jù)極體定位的方法，將第一極體連同部分卵母細(xì)胞質(zhì)切除。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第二胚胎操作液可以包括10%v/v的[10X]TCM199、0.17mg/mL的碳酸氫鈉、0.20mg/mL的丙酮酸鈉、3.60mg/mL的赫佩斯鈉鹽、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、2.5μ g/mL細(xì)胞松馳素和20%血清。由此，可以有效地去除卵母細(xì)胞核。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，放置上述經(jīng)過(guò)去核的卵母細(xì)胞的方式并不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)后續(xù)操作需要進(jìn)行選擇，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，將上述去核的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到第一胚胎操作液操作滴中待用。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一胚胎操作液可以包括 10%v/v 的[10X]TCM199、0.17mg/mL 的碳酸氫鈉、0.20mg/mL 的丙酮酸鈉、3.60mg/mL的赫佩斯鈉鹽、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、2%的血清。由此，所獲得的經(jīng)過(guò)去核的卵母細(xì)胞在含有最適合的胚胎操作液環(huán)境中存活。
[0057]S203:卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞融合
[0058]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，首先將S103中獲得的體細(xì)胞分散于上述第一胚胎操作液操作滴中，由此，體細(xì)胞在該第一胚胎操作液操作滴中呈單個(gè)細(xì)胞分布狀；然后將S202中獲得的經(jīng)過(guò)去核的卵母細(xì)胞在植物凝集素中放置一段時(shí)間后轉(zhuǎn)移到上述含有體細(xì)胞的第一胚胎操作液操作滴中，其中根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)例，將S202中獲得的經(jīng)過(guò)去核的卵母細(xì)胞在lmg/mL植物凝集素中放置I?2秒，由此可以使胞質(zhì)表面帶有粘性，從而使得單個(gè)體細(xì)胞和經(jīng)過(guò)去核的卵母細(xì)胞在第一胚胎操作液操作滴中進(jìn)行充分的貼合。
[0059]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將去核的卵母細(xì)胞(胞質(zhì))與供體細(xì)胞進(jìn)行融合的方法并不受特別限制，可以是本領(lǐng)域常用的各種細(xì)胞融合技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以將胞質(zhì)-體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至載有融合操作液的融合槽中，通過(guò)電擊進(jìn)行融合。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，融合槽中的融合操作液可以包含3M甘露醇、lmg/mL聚乙烯醇和0.1mM硫酸鎂。由此卵母細(xì)胞和體細(xì)胞可以處于最適合的環(huán)境條件中接受電擊，從而提高融合效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)卵母細(xì)胞-體細(xì)胞進(jìn)行融合的條件并不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體細(xì)胞情況和設(shè)備情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，電擊卵母細(xì)胞與體細(xì)胞進(jìn)行融合的條件可以為100V直流電電擊9 μ s，4V交流電電擊。通過(guò)使用交流電可使胞質(zhì)去極化，從而可以使其可懸掛于電極絲上，而通過(guò)直流電脈沖，可使細(xì)胞膜形成一個(gè)瞬時(shí)的穿孔，從而使胞質(zhì)與供體細(xì)胞膜結(jié)合并融合。由此，胞質(zhì)與體細(xì)胞可以在最適合的條件下接受電擊，從而得到充分的融合，以便獲得重構(gòu)克隆胚胎。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將電擊完的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至胚胎操作液I操作滴中，并將操作盤放置在38.5攝氏度熱臺(tái)上等待I小時(shí)，從而提高胚胎后期發(fā)育效率。
[0060]S204:激活重構(gòu)胚，形成胚胎
[0061]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將由S203步驟中獲得的融有體細(xì)胞的胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至載有激活操作液的融合槽內(nèi)，并懸掛S202步驟中所獲得的去核卵母胞質(zhì)，然后進(jìn)行電擊。其中利用交流電使重構(gòu)胚去極化，從而使其可懸掛于電極絲上，第二個(gè)胞質(zhì)也是通過(guò)去極化作用，可以使其可與重構(gòu)胚接觸。通過(guò)上述方法，使得一個(gè)體細(xì)胞融合了兩個(gè)胞質(zhì)，而胞質(zhì)的成份增加，能提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于后期的胚胎發(fā)育。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述激活操作液可以為3M的甘露醇、lmg/mL聚乙烯醇、0.1mM的硫酸鎂和0.05mM的氯化鈣。
[0062]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行電擊的條件并不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體細(xì)胞情況和設(shè)備情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例，電擊的條件可以為43V直流電電擊80 μ s，然后采用4V交流電電擊。由此,通過(guò)使用交流電可使重構(gòu)胚去極化,從而可以使其可懸掛于電極絲上，而通過(guò)直流電脈沖，可使細(xì)胞膜形成一個(gè)瞬時(shí)的穿孔，從而使重構(gòu)胚與胞質(zhì)細(xì)胞膜結(jié)合并融合；然后將電擊后的胚胎轉(zhuǎn)移至第一胚胎操作液操作滴中，待兩個(gè)胞質(zhì)融合。由此，可以提高胚胎的穩(wěn)定性。
[0063]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)上述經(jīng)過(guò)融合的細(xì)胞進(jìn)行激活的方式不受任何限制，可以為本領(lǐng)域常用的各種激活技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，將經(jīng)過(guò)融合的胚胎進(jìn)行化學(xué)激活，其中根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例，將經(jīng)過(guò)融合的胚胎轉(zhuǎn)移至化學(xué)激活滴中進(jìn)行化學(xué)激活。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，上述進(jìn)行化學(xué)激活的化學(xué)激活滴含有胚胎培養(yǎng)基(IVC)以及5 μ g/mL的細(xì)胞松馳素，10 μ g/mL的放線菌酮。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，胚胎培養(yǎng)基(IVC)可以包含6.31mg/mL的氯化鈉、2.llmg/mL的碳酸氫鈉、0.75mg/mL的氯化鉀、0.05mg/mL的磷酸二氫鉀、0.05mg/mL的硫酸鎂、0.62mg/mL的乳酸|丐、0.02mg/mL的丙酮酸鈉、0.50mg/mL的內(nèi)消旋肌醇、0.01g/mL的酹紅、0.05mg/mL的谷氨酰胺、0.55mg/mL的亞牛碘酸、0.04mg/mL的慶大霉素、3g/L的牛血清白蛋白、[IX]的非必需氨基酸和[0.5X]的必需氨基酸。由此可以使得上述經(jīng)過(guò)融合的細(xì)胞在最適合的培養(yǎng)基成分中被激活。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，將經(jīng)過(guò)融合的胚胎轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)基中進(jìn)行化學(xué)激活是在38.5攝氏度、5% 二氧化碳與5%氧氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行的。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，將經(jīng)過(guò)融合的胚胎轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)基中并在38.5攝氏度、5% 二氧化碳與5%氧氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。由此，可以使得上述經(jīng)過(guò)激活的細(xì)胞在最適合生長(zhǎng)的環(huán)境條件下進(jìn)行適應(yīng)性生長(zhǎng)，從而提高胚胎成活率。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將上述經(jīng)過(guò)激活和適應(yīng)性生長(zhǎng)的胚胎從上述化學(xué)激活滴中轉(zhuǎn)移至打孔的含胚胎培養(yǎng)基的四孔板中，并在38.5攝氏度、5% 二氧化碳與5%氧氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)120h或144h。通過(guò)打孔可以使多個(gè)無(wú)透明帶重構(gòu)胚可在同一個(gè)液孔中培養(yǎng)，各自有自己獨(dú)立的發(fā)育空間，并且在同一液孔可以發(fā)生緊密的信息交換，有利于胚胎發(fā)育。由此，上述經(jīng)過(guò)激活和適應(yīng)性生長(zhǎng)的胚胎可以進(jìn)一步在適宜的條件和環(huán)境下進(jìn)行生長(zhǎng)，從而提高胚胎的成活率。
[0065]S205:胚胎植入
[0066]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將上述經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的胚胎植入待孕動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)，經(jīng)過(guò)足夠的孕期克隆出非人動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將上述經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的胚胎植入待孕動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)的方式并不受特別限制，可以為本領(lǐng)域慣常采用的胚胎植入技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，將發(fā)育到120h的囊胚(見(jiàn)圖7)通過(guò)手術(shù)移植入待孕母體的子宮角內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，胚胎在母體內(nèi)發(fā)育114天左右，通過(guò)自然分娩或者剖腹產(chǎn)出克隆非人動(dòng)物，出生動(dòng)物見(jiàn)圖9。
[0067]實(shí)施例1從血液獲得單個(gè)核細(xì)胞
[0068]預(yù)先向15mL的錐形離心管內(nèi)加入125IU肝素，并通過(guò)震蕩使其均勻分布于錐形離心管的管壁。通過(guò)采用50mL的注射器直接抽取豬前腔靜脈血方式將小型豬的外周血約12mL收集于上述加入了肝素15mL的錐形離心管內(nèi)。將該載有外周血的錐形離心管置于4攝氏度冰盒中運(yùn)輸會(huì)實(shí)驗(yàn)室。
[0069]另取兩個(gè)15mL的錐形離心管，并向其中分別加入5mL的中性粒細(xì)胞分離液(含有57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸鈉)后，利用移液槍小心地沿15mL的錐形離心管壁并貼近中性粒細(xì)胞分離液液面緩慢加入5mL的所采集的抗凝外周血，并保證該抗凝外周血不與下層的中性粒細(xì)胞分離液混合，然后在400g條件下水平離心30分鐘。
[0070]離心后，利用移液槍分別從兩個(gè)離心管收集中間層云浮狀單個(gè)核細(xì)胞，并合并放置于一個(gè)新的50mL的錐形離心管。將20mL的PBS加入到前述含有單個(gè)核細(xì)胞50mL的錐形離心管中，并利用巴氏滴管反復(fù)吹打進(jìn)行清洗。清洗后，將含有單個(gè)核細(xì)胞的PBS混懸液在300g條件下離心10分鐘。離心后，取出50mL的錐形離心管，去除上清液后再向含有單個(gè)核細(xì)胞沉淀的50mL的錐形離心管中加入20mL的PBS，并再次利用巴氏滴管反復(fù)吹打進(jìn)行第二次清洗。第二次清洗后，將含有單個(gè)核細(xì)胞的PBS混懸液再次在300g條件下離心10分鐘。然后重復(fù)上述第二次清洗步驟，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行第三次清洗。
[0071]實(shí)施例2單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)
[0072]向?qū)嵤├?中得到的經(jīng)過(guò)3次清洗并棄去離心后PBS上清液的細(xì)胞沉淀中加入2mL含有低糖-MEM、15%FBS、[IX]非必需氨基酸、10ng/mL bFGF和30IU/mL肝素的第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基，并利用巴氏滴管將單個(gè)核細(xì)胞沉淀吹打均勻分散于第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基中。將含有單個(gè)核細(xì)胞的第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至明膠包被的35mm培養(yǎng)皿中，然后放置在37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0073]經(jīng)過(guò)48小時(shí)的培養(yǎng)，向載有單個(gè)核細(xì)胞的35mm培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，棄去第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基后，加入PBS進(jìn)行漂洗。棄去PBS后，向載有單個(gè)核細(xì)胞的35mm培養(yǎng)皿中加入含有MEM-α、15%FBS、[1X]非必需氨基酸和10ng/mL bFGF的第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。并且在第72和96小時(shí)分別對(duì)載有單個(gè)核細(xì)胞的35mm培養(yǎng)皿采用第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行換液處理。該單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)5-7天后，置于光學(xué)顯微鏡性進(jìn)行觀察，鏡下單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)皿底面上呈成纖維狀貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)(見(jiàn)圖3)，且細(xì)胞核較大，細(xì)胞核仁清晰可見(jiàn)。
[0074]實(shí)施例3單個(gè)核細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
[0075]當(dāng)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞在顯微鏡下觀察呈團(tuán)狀接觸抑制裝生長(zhǎng)時(shí)(見(jiàn)圖4)，棄去培養(yǎng)皿中第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基；然后加入PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞2次；棄去PBS緩沖液后，向載有貼壁的單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加入200 μ L0.05%胰酶-200mg/L EDTA,并將細(xì)胞放置于37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化，當(dāng)在顯微鏡下觀察到貼壁細(xì)胞逐漸變圓變亮并逐漸脫離培養(yǎng)皿而漂浮于細(xì)胞胰酶中時(shí)，向培養(yǎng)皿中加入ImL第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基，并通過(guò)巴氏滴管吹打使得單個(gè)核細(xì)胞與加入的新鮮第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基混合均勻，以便獲得細(xì)胞懸液；然后將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到經(jīng)過(guò)明膠包被的培養(yǎng)設(shè)備中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。進(jìn)過(guò)傳代培養(yǎng)的貼壁單個(gè)核細(xì)胞在顯微鏡下觀察，細(xì)胞后期生長(zhǎng)旺盛，增殖性好(見(jiàn)圖5和圖6)。將傳代培養(yǎng)的第2-20代單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞懸液直接移至1.5mL離心管中待用，用于手工克隆。
[0076]實(shí)施例4卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)及表面分子鑒定
[0077]將從屠宰場(chǎng)收集的豬卵巢放置在裝有生理鹽水的容器內(nèi)以保持滲透壓平衡，并以35攝氏度恒溫條件運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室。將卵巢放置于裝有胚胎洗滌液(ASP)的培養(yǎng)皿中(其中胚胎洗滌液(ASP)含有10%v/v的10XTCM199、0.17mg/mL的碳酸氫鈉、0.20mg/mL的丙酮酸鈉、3.60mg/mL赫佩斯鈉鹽、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、3.00 μ g/mL的兩性霉素B、30IU/mL的肝素、2%的血清)，用刀片將卵泡劃破以使得卵泡中的卵細(xì)胞流出。為了達(dá)到pH值相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境,預(yù)先將培養(yǎng)基放置在5%濃度的二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行平衡，然后將流出的卵細(xì)胞以每孔50個(gè)胚胎的密度收集于預(yù)先平衡的胚胎成熟培養(yǎng)基(IVM)的四孔板中，其中胚胎成熟培養(yǎng)基(IVM)含有[IX]的TCM199、5IU/mL的人絨毛膜促性腺激素、lIU/mL的孕馬血清、0.10mg/mL的谷氨酰胺、0.05mg/mL慶大霉素、10%卵泡液、10%v/v血清。然后將載有胚胎的四孔板置于38.5攝氏度二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)42h至成熟。
[0078]將貼壁的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行消化處理，并在350g條件下離心3分鐘，棄去上清液后，向沉淀中加入2mL PBS進(jìn)行吹打洗滌；然后再次以350g離心3分鐘，棄去上清液后向離心管中的沉淀加入700 μ L PBS,吹打混勻后將所得到的懸浮液平均分配加入到7個(gè)新的2mL離心管中，即每管加入100 μ L細(xì)胞懸浮液；然后分別向每一個(gè)離心管中加入5 μ L?20μ L 抗體 7 個(gè)不同的抗體:CD29、CD90、CD34、CD45、FITC Mouse IgGl 和 PE Mouse IgGl,旋渦充分混勻后，避光孵育15分鐘；然后對(duì)標(biāo)記了表面抗原的細(xì)胞進(jìn)行2次洗滌，條件均為加入ImL PBS，上下晃勻后以350g離心3分鐘，棄上清；然后再以0.4mL多聚甲醇(4%濃度溶于PBS)溶解洗滌后的細(xì)胞沉淀，使用BD FACSCalibur對(duì)其進(jìn)行上機(jī)分析，利用WinMDI2.8軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行讀取，結(jié)果參見(jiàn)圖8。圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的細(xì)胞高表達(dá)CD29和⑶90表面抗原，而不表達(dá)⑶34和⑶45表面抗原。圖8的結(jié)果顯示所獲得的卵母細(xì)胞高表達(dá)⑶29和⑶90表面抗原，不表達(dá)⑶34和⑶45表面抗原，其中所獲得的卵母細(xì)胞的⑶29和CD90的陽(yáng)性率分別為99.27%和98.62，而CD34和CD45的陽(yáng)性率分別為0.43%和0.45%。
[0079]實(shí)施例5豬卵母細(xì)胞脫卵丘及去核
[0080]將上述培養(yǎng)成熟的卵細(xì)胞用移液槍從含有胚胎成熟培養(yǎng)基(IVM)的四孔板中轉(zhuǎn)移至lmg/mL透明質(zhì)酸酶中，用槍頭來(lái)回吸打從而脫去卵丘顆粒細(xì)胞。然后先將上述去除了卵丘細(xì)胞的裸露卵母細(xì)胞放置于蛋白酶中，以便將覆蓋在卵母細(xì)胞表層的透明帶消化松散，繼而將其轉(zhuǎn)移至第二胚胎操作液操作滴中，并根據(jù)極體定位的方法，將第一極體連同部分卵母細(xì)胞質(zhì)切除。將去核的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到第一胚胎操作液操作滴中待用，從而所獲得的經(jīng)過(guò)去核的卵母細(xì)胞可以在含有最適合的胚胎操作液環(huán)境中存活。其中第一胚胎操作液可以包括 10%v/v 的[10X]TCM199、0.17mg/mL 的碳酸氫鈉、0.20mg/mL 的丙酮酸鈉、3.60mg/mL的赫佩斯鈉鹽、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、2%的血清。
[0081]實(shí)施例6卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞融合
[0082]將實(shí)施例3獲得的體細(xì)胞放置在第一胚胎操作液操作滴中，并使得體細(xì)胞在該操作滴中呈單個(gè)細(xì)胞分布狀。將實(shí)施例5獲得的經(jīng)過(guò)去核的卵母細(xì)胞在lmg/mL植物凝集素中放置I秒?2秒，然后與上述實(shí)施例3獲得的體細(xì)胞合并放入至前述第一胚胎操作液操作滴中，從而使得單個(gè)體細(xì)胞和經(jīng)過(guò)去核的卵母細(xì)胞在第一胚胎操作液操作滴中進(jìn)行充分的貼合。將去核卵母細(xì)胞(胞質(zhì))-體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至載有融合操作液的融合槽中，通過(guò)電擊進(jìn)行融合，以便獲得重構(gòu)克隆胚胎。其中融合槽中的融合操作液包含3M甘露醇、lmg/mL聚乙烯醇和0.1mM硫酸鎂。電擊卵母細(xì)胞與體細(xì)胞進(jìn)行融合的條件為10V直流電電擊9 μ s，4V交流電電擊。陸續(xù)電擊完所有卵母細(xì)胞與體細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)移到第一胚胎操作液操作滴中，將操作盤放置在38.5攝氏度熱臺(tái)上等待I小時(shí)。
[0083]實(shí)施例7激活重構(gòu)胚，形成胚胎
[0084]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將實(shí)施例6中融有體細(xì)胞的胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至載有激活操作液的融合槽內(nèi)(其中激活操作液含有3Μ的甘露醇、lmg/mL聚乙烯醇、0.1mM的硫酸鎂和0.05mM的氯化鈣)，并懸掛實(shí)施例5中所獲得的去核胞質(zhì)，然后進(jìn)行電擊，以便使重構(gòu)胚與胞質(zhì)融合:其中利用交流電使重構(gòu)胚去極化，從而使其可懸掛于電極絲上，第二個(gè)胞質(zhì)也是通過(guò)去極化作用，可以使其可與重構(gòu)胚接觸。電擊的條件為43V直流電電擊80μ S，然后采用4V交流電電擊，4V交流電一直到電擊結(jié)束后關(guān)閉。由此，通過(guò)使用交流電可使重構(gòu)胚去極化，從而可以使其可懸掛于電極絲上，而通過(guò)直流電脈沖，可使細(xì)胞膜形成一個(gè)瞬時(shí)的穿孔，從而使重構(gòu)胚與胞質(zhì)細(xì)胞膜結(jié)合并融合；然后將電擊后的胚胎轉(zhuǎn)移至第一胚胎操作液操作滴中，待兩個(gè)胞質(zhì)融合。
[0085]將經(jīng)過(guò)融合的胚胎轉(zhuǎn)移至化學(xué)激活滴中進(jìn)行化學(xué)激活，上述進(jìn)行化學(xué)激活的化學(xué)激活滴含有胚胎培養(yǎng)基(IVC)以及5 μ g/mL的細(xì)胞松馳素和10 μ g/mL的放線菌酮。其中，胚胎培養(yǎng)基(IVC)包含6.31mg/mL的氯化鈉、2.llmg/mL的碳酸氫鈉、0.75mg/mL的氯化鉀、0.05mg/mL的磷酸二氫鉀、0.05mg/mL的硫酸鎂、0.62mg/mL的乳酸|丐、0.02mg/mL的丙酮酸鈉、0.50mg/mL的內(nèi)消旋肌醇、0.01g/mL的酹紅、0.05mg/mL的谷氨酰胺、0.55mg/mL的亞牛碘酸、0.04mg/mL的慶大霉素、3g/L的牛血清白蛋白、[IX]的非必需氨基酸和[0.5X]的必需氨基酸。將經(jīng)過(guò)融合的胚胎轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)基中在38.5攝氏度、5% 二氧化碳與5%氧氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行化學(xué)激活，激活時(shí)間為4小時(shí)。
[0086]將上述經(jīng)過(guò)激活和適應(yīng)性生長(zhǎng)的胚胎從上述化學(xué)激活滴中轉(zhuǎn)移至打孔的含胚胎培養(yǎng)基的四孔板中，并在38.5攝氏度、5% 二氧化碳與5%氧氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)120h。
[0087]實(shí)施例8胚胎植入
[0088]上述經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的胚胎植入待孕動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)，經(jīng)過(guò)足夠的孕期克隆出非人動(dòng)物。首先將發(fā)育到第120h的囊胚(見(jiàn)圖7)通過(guò)手術(shù)移植入待孕母豬體的子宮角內(nèi)。胚胎在母豬受體內(nèi)發(fā)育114天左右，通過(guò)自然分娩或者剖腹產(chǎn)出克隆非人動(dòng)物，出生動(dòng)物見(jiàn)圖9。
[0089]在本說(shuō)明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0090]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種從血液中分離、培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將所述血液加入到分離液上層后利用密度梯度離心的方式進(jìn)行離心，以便獲得單個(gè)核細(xì)胞； 將所述單個(gè)核細(xì)胞接種于含有貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基的體外培養(yǎng)設(shè)備，以便獲得貼壁細(xì)胞；以及 將所述貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以便獲得體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液來(lái)自外周血。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離液為中性粒細(xì)胞分離液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述中性粒細(xì)胞分離液的密度為1.077g/mL， 其中，所述中性粒細(xì)胞分離液含有57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單個(gè)核細(xì)胞是從所述分離液離心后中間層收集的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述單個(gè)核細(xì)胞接種于含有貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基的體外培養(yǎng)設(shè)備，以便獲得貼壁細(xì)胞進(jìn)一步包括: 首先，將用PBS清洗后的單個(gè)核細(xì)胞利用第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基在37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，所述第一貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基包括低糖-MEM、15%FBS、I X非必需氨基酸、10ng/mL 的 bFGF 和 30IU/mL 肝素； 接著，將培養(yǎng)基更換為第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)在37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所述第二貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基包括MEM-a、15%FBS、1X非必需氨基酸和10ng/mL的bFGF。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述體外培養(yǎng)設(shè)備是明膠包被的培養(yǎng)皿或明膠包被的培養(yǎng)板。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)進(jìn)一步包括，將所述貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)2-20代。
9.一種對(duì)非人動(dòng)物進(jìn)行克隆的方法，其特征在于，包括: 利用根據(jù)權(quán)利要求1?8任一項(xiàng)所述的方法，制備體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞；以及 基于所述體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞，通過(guò)手工克隆，進(jìn)行克隆非人動(dòng)物。
【文檔編號(hào)】C12N15/877GK104513807SQ201310461790
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】楊珍珍, 徐穎, 林木飛, 杜玉濤 申請(qǐng)人:深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司, 深圳華大基因科技有限公司