檢測口蹄疫病毒通用型的rt-pcr引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一對(duì)檢測口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物及試劑盒，所述引物的上游引物核苷酸序列為5’-CTGGGCCCTTCTTCTTC-3’，下游引物核苷酸序列為5’-GCTGTTTCTCTGCTCTCTC-3’，所述試劑盒包括所述的引物。采用本發(fā)明檢測口蹄疫O型、A型、亞I病毒，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】檢測口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒分子生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一對(duì)檢測口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒引起的一種急性高度接觸性傳染病，主要侵害偶蹄動(dòng)物，如牛、豬、羊等。其特征是發(fā)熱、皮膚或粘膜發(fā)生水泡潰瘍，尤其是在口腔和蹄叉部位。
[0003]口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)屬于小 RNA病毒科,約有8500個(gè)核苷酸組成。病毒基因組由一個(gè)開放性閱讀框(0RF)、一個(gè)5'端非編碼區(qū)(NCR)和3'端非編碼區(qū)(NCR)組成，ORF編碼由4種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)、RNA聚合酶(3D)、蛋白酶(L、2A、3C)以及其他非結(jié)構(gòu)蛋白(如3A等)組成。口蹄疫病毒包括7個(gè)血清型和60余個(gè)亞型，7個(gè)血清型為:A型、亞洲I型、O型、C型、南非I型、II型、III型，各型之間無交叉保護(hù)反應(yīng)，同一血清不同分離株之間也存在廣泛的抗原變異；由于亞型分類越來越復(fù)雜，現(xiàn)在由用于分析基因組遺傳衍化關(guān)系的基因型代替。
[0004]口蹄疫在亞洲主要流行有A、0型、C型、亞洲I型4個(gè)血清型，截至目前，我國僅見O型、A型、亞洲I型三個(gè)血清型的口蹄疫。A型在1960—1975年曾流行20多省。目前，A型口蹄疫病毒在我國已廣為擴(kuò)散，是僅次于O型口蹄疫的世界主要流行毒株。廣西地處我國沿海地區(qū)西南部， 東部毗鄰廣東，西南與越南為界，是我國邊疆省區(qū)之一。而越南口蹄疫疫情復(fù)雜，O型、亞洲I型、A型時(shí)有發(fā)生。2013年2月，農(nóng)業(yè)部確認(rèn)廣東省茂名市某豬場發(fā)生生豬A型口蹄疫疫情。因此建立有效的診斷方法對(duì)邊境口蹄疫疫情的防控與監(jiān)測具有重要意義。
[0005]O型、亞洲I型、A型口蹄疫病毒與其他血清型的口蹄疫病毒在致病性上并無明顯差異，癥狀基本相同，主要引起口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰和潰爛。由于口蹄疫傳播速度快、感染率高、對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重。目前對(duì)于各型口蹄疫病毒的實(shí)驗(yàn)室檢查主要包括:間接夾心聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、反向間接血凝試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA檢測、正向間接血凝試驗(yàn)等。這些方法的目的是檢測相應(yīng)的抗體，屬于血清學(xué)檢測方法，鑒于口蹄疫病毒的高度變異性以及交叉性，其特異性難以保證，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性，因此建立有效的診斷方法對(duì)防治口蹄疫具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一對(duì)檢測口蹄疫O型、A型、亞I型病毒通用型的RT-PCR引物及試劑盒，具有較高的靈敏度和特異性，且檢測成本低，有良好的應(yīng)用前景。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0008]一對(duì)檢測口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物，所述引物的上游引物核苷酸序列為5' -CTGGGCCCTTCTTCTTC-3'，下游引物核苷酸序列為 5' -GCTGTTTCTCTGCTCTCTC-3'。[0009]一種檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，所述試劑盒包括以上所述的引物。
[0010]以上所述檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，所述試劑盒還包括:RNA提取試劑、RT反應(yīng)試劑、PCR反應(yīng)試劑、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。
[0011]所述RNA提取試劑包括=Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇；
[0012]所述RT反應(yīng)試劑包括:5Xbuffer緩沖液、dNTPs、HIR和下游引物Wd ；
[0013]所述PCR 反應(yīng)試劑包括:Taq DNA 酶、10 Xbuffer 緩沖液、dNTPs、MgCl2 和 cDNA ；
[0014]所述陰性對(duì)照包括:DEPC水；
[0015]所述陽性對(duì)照包括:口蹄疫O型全病毒、口蹄疫A型全病毒和口蹄疫亞I型全病毒。
[0016]所述口蹄疫O型全病毒可為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫O型全病毒，所述口蹄疫A型全病毒可為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫A型全病毒，所述口蹄疫亞I型全病毒可為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫亞I型全病毒。
[0017]本發(fā)明的具體原理是利用口蹄疫O型、A型、亞I型病毒的同源性，應(yīng)用0LIG6.0軟件，合成一對(duì)靶核苷酸序列的特異性引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增出特異性的目的帶。試驗(yàn)方法及過程如下:
[0018]1.引物設(shè)計(jì):
[0019]PCR反應(yīng)中有兩條引物，即Y端引物和:V引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)(常以信息鏈為基準(zhǔn))，5'端引物與位于待擴(kuò)增片段5'端上的一小段DNA序列相同；3'端引物與位于待擴(kuò)增片段3'端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物長度一般為16-25bp左右，引物之間、引物內(nèi)無互補(bǔ)序列。通過對(duì)口蹄疫O型、A型、亞I型病毒三型基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的片段，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，通過匹配、篩選最優(yōu)引物組合如下:
[0020]上游引物Wu 序列:5' -CTGGGCCCTTCTTCTTC-3'；
[0021]下游引物Wd 序列:5' -GCTGTTTCTCTGCTCTCTC-3'。
[0022]2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化:
[0023]將滅活的待檢樣品用Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分別分裝后儲(chǔ)存于_20°C備用。
[0024]2.1引物用量的優(yōu)化在反應(yīng)體系其他條件相同的情況下，將引物對(duì)的用量分別從
0.1 μ L至1.8μ L加入體系,通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較,確定最優(yōu)引物用量為0.5μ L。
[0025]2.2氯化鎂濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系其他條件相同的情況下通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較，確定氯化鎂的濃度為25mM最佳。
[0026]2.3反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)的優(yōu)化通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析，選擇200U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶作為反應(yīng)體系最佳用量。
[0027]2.4Taq DNA聚合酶(Taq酶)的優(yōu)化通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析，選擇5U/ μ L酶作為
反應(yīng)體系最佳用量。
[0028]2.5dNTPs濃度的優(yōu)化通過使用不同濃度的dNTPs進(jìn)行檢測，反轉(zhuǎn)錄時(shí)選擇10mM，PCR擴(kuò)增時(shí)選擇2.5mM作為反應(yīng)體系最佳用量。 [0029]利用上述引物和各成分的最終濃度，最后確定采用的RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，所需各組及相應(yīng)濃度見表1。[0030]表1檢測口蹄病毒通用型反應(yīng)體系
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)檢測口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的上游引物核苷酸序列為5 ' -CTGGGCCCTTCTTCTTC-3 '，下游引物核苷酸序列為.5' -GCTGTTTCTCTGCTCTCTC-3'。
2.一種檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測口蹄疫病毒通用型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括:RNA提取試劑、RT反應(yīng)試劑、PCR反應(yīng)試劑、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測口蹄疫O型、A型、亞I型病毒通用型的試劑盒，其特征在于: (1)所述RNA提取試劑包括=Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇； (2)所述RT反應(yīng)試劑包括:5Xbuffer緩沖液、dNTPs、HIR和下游引物Wd； (3)所述PCR 反應(yīng)試劑包括:Taq DNA 酶、IOXbuffer 緩沖液、dNTPs,MgCl2 和 cDNA ； (4)所述陰性對(duì)照包括:DEPC水； (5)所述陽性對(duì)照包括:口蹄疫O型全病毒、口蹄疫A型全病毒和口蹄疫亞I型全病毒。
5.一種如權(quán)利要求4所述檢測口蹄疫病毒通用型試劑盒的使用方法，包括以下步驟: (1)病毒RNA的提取: 取待檢樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各500μ L于1.5ml滅菌無RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液進(jìn)行裂解，充分振蕩，室溫放置10分鐘；加入300 μ L氯仿，搖勻放置10分鐘；低溫高速離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘；緩慢取出上層液體600 μ L放置于新的EP管；加入等量異丙醇輕輕混勻，-20°C放置30分鐘；低溫高速離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，棄去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取Iml于管內(nèi)洗滌沉淀，充分吸棄洗滌；將EP管倒置于吸水紙上，盡量吸干液體，放置于37°C溫箱中15分鐘，管內(nèi)無可見水珠時(shí)取出；加入25 μ L DEPC水，_20°C保存?zhèn)溆茫? (2)RT操作程序: 取 5Xbuffer 緩沖液 5μ L、dNTPs 2 μ L, M-MLV 0.5 μ L、HIR 0.5 μ L、下游引物 Wd.2μ L,RNA 15 μ L,將上述液體置于同一EP管內(nèi)，混勻后放于PCR儀按如下程序操作:42 V.60 min,95 V 5 min ； (3)PCR操作程序: 上游引物 Wu0.5yL、下游引物 Wd 0.5μ L, Taq DNA 酶 0.2 μ L、10 Xbuffer 緩沖液.2.5 μ L、dNTPs 2 μ L、MgCl22 μ L、DEPC 水 12.3 μ L, cDNA 5 μ L，將上述液體置于同一 EP 管內(nèi)，混勻后放于PCR儀按如下程序操作，擴(kuò)增條件:94 V 30s, 51 V 30 s，72 V 30 s，35個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103627817SQ201310461862
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】馮淑萍, 顏健華, 胡巧云, 其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開姓名 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心