patatin-like磷脂酶及其編碼基因與用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種patatin-like磷脂酶及其編碼基因與用途；本發(fā)明所述的來源于深海宏基因組的patatin-like磷脂酶基因，該基因大小為912bp，序列如SEQ?ID?NO.1所示，編碼303個氨基酸，序列如SEQ?ID?NO.2所示，蛋白分子量為33kDa，等電點為6.21。本發(fā)明克隆得到了深海plp基因，并首次分析了其產(chǎn)物及摸索出通過基因工程大量制備該酶蛋白的方法。所述PLP蛋白可水解對硝基苯酚乙酸酯pNPA、對硝基苯酚丁酸酯pNPB、對硝基苯酚辛酸酯pNPO、對硝基苯酚癸酸酯pNPDE、對硝基苯酚月桂酸酯pNPDO。本發(fā)明提供的PLP可水解脂類物質(zhì)，具有工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價值。
【專利說明】patat in-1 i ke磷脂酶及其編碼基因與用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種patatin-like磷脂酶及其編碼基因與用途。
【背景技術(shù)】
[0002]酶是一種生物催化劑，周圍環(huán)境(溫度、pH、有機(jī)試劑等)對它的活性影響很大，很多酶在一些比較苛刻的反映條件下(高溫、低溫或者強(qiáng)酸堿環(huán)境)均會失去活性，這就限制了其應(yīng)用范圍。極端微生物產(chǎn)生的極端酶一直以來都是研究的熱點。極端微生物酶的發(fā)現(xiàn)，正好彌補(bǔ)了這一不足。其中來源于嗜熱微生物的嗜熱酶具有獨特的生物穩(wěn)定性和催化活性。利用嗜熱酶作為生物催化劑的優(yōu)點為:(I)酶制劑的制備成本低。(2)對反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)低，從而減少了能量的消耗。(3)高溫反應(yīng)條件降低了中溫微生物污染反應(yīng)體系的危險，從而提高了產(chǎn)物純度。(4)高溫反映條件提高了反應(yīng)速率和產(chǎn)率。由于嗜熱酶具有催化效率高和底物專一性強(qiáng)，且酶穩(wěn)定性極好等特性，因而能夠在苛刻的工業(yè)生產(chǎn)過程中發(fā)揮重要的作用。
[0003]酯類降解酶是所有能夠催化酯類化合物水解的酶類的總稱。根據(jù)作用底物脂肪酸側(cè)鏈的不同，該類酶可分為3大類，即脂肪酶、酯酶及磷脂酶。脂肪酶水解脂肪酸側(cè)鏈長度大于10個碳的甘油三酯；酯酶水解脂肪酸側(cè)鏈小于10個碳的甘油三酯；而磷脂酶的水解底物為不同類型的磷脂。酯 類降解酶可以催化不同酯類的水解合成反應(yīng)，在生物體內(nèi)具有重要的生理功能，而且還具有較高的應(yīng)用價值。酯類降解酶在食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、化學(xué)化工、環(huán)境保護(hù)及能源開發(fā)等許多工業(yè)領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用。比如，脂肪酶可用于作家庭或工業(yè)用清潔劑的添加劑；酯酶可應(yīng)用于奶制品的增香、無脂肪肉的生產(chǎn)、清除有機(jī)磷殺蟲劑的污染等；磷脂酶可用于抗炎藥物、抗腫瘤藥物的研制和生產(chǎn)，還可用于油脂脫膠。
[0004]酯降解酶來源豐富，由于微生物來源酯降解酶具有種類繁多、容易大量快速制備和成本低等特點，已經(jīng)成為當(dāng)前業(yè)應(yīng)用的最重要途徑。但是大部分野生菌株的酯降解酶生產(chǎn)能力往往很有限，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求此外，為了適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)過程中苛刻的反映條件(高溫、高壓、高酸、高離子濃度以及重金屬離子超標(biāo)的極端環(huán)境)。比如在油脂工業(yè)，在進(jìn)行高品質(zhì)油脂生產(chǎn)過程中，需要對油脂進(jìn)行脫膠處理以除去磷脂，進(jìn)而提高油脂的純度和質(zhì)量。而高品質(zhì)油脂生產(chǎn)通常采用物理和化學(xué)方法以及酶法進(jìn)行脫膠。其中酶法脫膠由于工藝相對簡單、效率高、環(huán)境污染小等優(yōu)點而受到廣泛的青睞。此外，在乳制品加工行業(yè)，酯類降解酶的水解催化作用能夠在不改變原有奶酪質(zhì)量的同時提高產(chǎn)量。在烘焙工業(yè)中，該類酶可以替代或者增強(qiáng)傳統(tǒng)的乳化劑，通過對面粉的極性脂類物質(zhì)的酶解作用提高產(chǎn)品的乳化質(zhì)量。油脂脫膠化過程需要較高的溫度(70-80°C)，常規(guī)酶(豬胰磷脂酶在60°C以內(nèi)表現(xiàn)最佳活力)，由于反應(yīng)溫度的限制，使脫膠過程的效率和成本都不能達(dá)到最佳程度。
[0005]因此需要我們一方面對現(xiàn)有的酯降解酶進(jìn)行改造，以適應(yīng)生產(chǎn)的需要，另一方面需要我們繼續(xù)從環(huán)境中尋找特殊的、新的酶源。在人類極少涉足的深海環(huán)境中蘊(yùn)藏有豐富的生物基因資源。隨著我國深海探測技術(shù)進(jìn)步和深海微生物研究的深入，各種深海極端酶已成為獲取新型生物催化劑的重要來源。特別的，深海熱液區(qū)域環(huán)境條件特殊，存在極高的海水壓力(可達(dá)300atm)，噴口處更有高達(dá)400°C的海水溫度并存在急劇的溫度變化(4-4000C ) 0瓜伊馬斯海盆是加利福尼亞灣眾多半封閉海盆中的一個，它大致在最近350萬年內(nèi)由海底擴(kuò)張形成。兩個斷陷位于比較平的盆地底內(nèi)，由一轉(zhuǎn)換斷層水平錯開約20公里。富饒的表層水和來自下加利福尼亞及墨西哥大陸的內(nèi)陸性輸入導(dǎo)致海底沉淀物深達(dá)400多米。相比于其他已知的深海熱泉，瓜伊馬斯海盆的獨特性在于其不斷積聚的沉積物中有機(jī)物質(zhì)在高溫條件下被熱解成類石油產(chǎn)物如汽油酯、芳香烴以及浙青物質(zhì)，因此在這個環(huán)境中存在著大量的生物。特別的，近年來微生物環(huán)境基因組學(xué)技術(shù)體系的建立使從不可培養(yǎng)微生物樣品中直接獲得酶資源成為可能。
[0006]前期我們已構(gòu)建瓜伊馬斯深海宏基因組文庫，進(jìn)一步地，通過構(gòu)建亞克隆文庫，篩選得到一個大小為3.3kb的亞克隆子。測序分析表明，該DNA片段包含4個開放閱讀框，通過同源序列比對，確定其中一個閱讀框為patatin-like磷脂酶(命名為:PLP)。PLP在序列上與目前已報道的酶同源性較低，最高不到45 其中與Caldithrix abyssi中的patatin、Brevibacillus Iaterosporus中的酯酶具同源性最高,而這些酶的特征目前還未被詳細(xì)報道。此外，根據(jù)目前已報道的文獻(xiàn)和已構(gòu)建的進(jìn)化樹分析，該酶為一個新酶。PLP與目前已報道的Mahella australiensis DSM15567 (No:F4A375)具有較近的親緣關(guān)系，而后者屬于Thermoanaerobacterales,且PLP來源于瓜伊馬斯熱液口樣品，因此推測PLP具有較好的熱穩(wěn)定性。
[0007]對于從深海宏基因組來源分離得到的patatin-like磷脂酶，目前報道較少。Pacawadee等于2008年通過構(gòu)建泰國溫泉樣品宏基因組文庫，篩選得到具有脂肪降解活性的patatin-like磷脂酶。該酶對p-nitrophenyl butyrate具有較高的特異性,最適溫度為70°C，經(jīng)70°C處理2h還具有較高的熱穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種來源于深海瓜伊馬斯海盆宏基因組文庫的patatin-like磷脂酶及其編碼基因與用途；該酶能有效的水解對硝基苯酚乙酸酯pNPA、對硝基苯酚丁酸酯PNPB、對硝基苯酚辛酸酯pNPO、對硝基苯酚癸酸酯pNPDE、對硝基苯酚月桂酸酯pNPDO，尤其對對硝基苯酚丁酸酯pNPB和對硝基苯酚癸酸酯pNPDE催化效率最高，而且該patatin-like磷脂酶為嗜熱酶，適合用于需要較高反應(yīng)溫度的工業(yè)生產(chǎn)中。宏基因組文庫的構(gòu)建方法為現(xiàn)有技術(shù)。
[0009]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0010]第一方面，本發(fā)明涉及一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì):
[0011](a)由如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0012](b)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有patatin-like磷脂酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0013]優(yōu)選的,所述蛋白質(zhì)為重組patatin-like磷脂酶,所述重組patatin-like磷脂酶能夠水解對硝基苯酚乙酸酯pNPA、對硝基苯酚丁酸酯pNPB、對硝基苯酚辛酸酯pNPO、對硝基苯酚癸酸酯pNPDE、對硝基苯酚月桂酸酯pNPDO中的一種或幾種。更優(yōu)選用于水解對硝基苯酹丁酸酯pNPB和對硝基苯酹癸酸酯pNPDE ;本發(fā)明的patatin-like磷脂酶對對硝基苯酚丁酸酯PNPB和對硝基苯酚癸酸酯pNPDE水解的催化效率最高。
[0014]第二方面，本發(fā)明涉及一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。
[0015]優(yōu)選的，所述核酸序列具體為:核酸序列如SEQ ID N0.1所示；或能與SEQ ID N0.1所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。
[0016]優(yōu)選的，所述核酸序列來源深海瓜伊馬斯海盆宏基因組文庫。
[0017]第三方面，本發(fā)明還涉及一種含有上述核酸序列的重組載體。
[0018]第四方面，本發(fā)明還涉及一種上述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
[0019] 第五方面，本發(fā)明還涉及一種上述的核酸序列在制備重組patatin-like磷脂酶中的用途。
[0020]優(yōu)選的，所述制備包括如下步驟:構(gòu)建含所述核酸序列的重組載體，將所述的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌，誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到重組patatin-like磷脂酶。
[0021]第六方面，本發(fā)明還涉及一種重組patatin-like磷脂酶，是通過如下方法制備而得的:構(gòu)建含如權(quán)利要求4所述核酸序列的重組載體，將所述的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得重組基因工程菌，誘導(dǎo)培養(yǎng)，即得所述重組patatin-like磷脂酶。
[0022]第七方面，本發(fā)明還涉及一種上述的重組patatin-like磷脂酶在油脂脫膠中的用途。
[0023]第八方面,本發(fā)明還涉及一種上述的重組patatin-like磷脂酶在制備溶血磷脂中的用途。
[0024]所述patatin-like磷脂酶完整基因序列的克隆方法如下:設(shè)計含NdeI和NotI酶切位點的引物I和引物2，以具有酯類降解活性的亞克隆DNA為模板克隆patatin-like磷月旨酶全長基因序列，引物I的序列如SEQ ID N0.3所不，引物2的序列如SEQ ID N0.4所不；PCR反應(yīng)在50 μ L體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，30循環(huán)后，最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并按OMEGA生物小量膠回收試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，命名PCR產(chǎn)物為pip。
[0025]所述patatin-like磷脂酶基因的工程菌的構(gòu)建和表達(dá)方法如下:對回收的pip片段及載體pET-28a(+)分別進(jìn)行雙酶切(NdeI和NotI)后割膠回收，割膠回收后的pip片段連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。在含卡那霉素抗性的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接入含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10~14h后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證插入目的片段的質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，測序正確的質(zhì)粒命名為pET-28a(+)-plp。將重組質(zhì)粒pET-28a (+) -pip轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，獲得含有重組質(zhì)粒pET_28a (+) -pip的重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET-28a(+) -pip。將重組菌體 BL21 (DE3) /pET_28a(+) -pip 接入含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接至含卡那霉素抗性的新鮮LB液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)至0D600約為0.6，添加終濃度0.1mM的IPTG (異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)，在20°C條件下進(jìn)行誘導(dǎo)12h。
[0026]所述PLP的純化及酶學(xué)性質(zhì)如下:將上述活得的重組菌株的發(fā)酵液離心后收集菌體，用 5 倍體積 binding buffer (含 20mmol/L 咪唑,0.3mol/L NaCl, 50mmoI /T, KH2PO4,pH7.6)重懸菌體，冰上超聲破碎菌體，裂解的菌體首先經(jīng)4000rpm，4°C離心lOmin，收集上清；上清再置于4°C, 13000rpm,離心20min,收集沉淀,得到包涵體。
[0027]將得到的包涵體首先溶于IOOmM Tris-HCl (pH7.5), IOOmM EDTA, 10 % TritonX-100,處理約lh，12000rpm離心lOmin，收集沉淀，并重復(fù)操作一次。然后將沉淀溶于5mMGly-NaOH(pH)，8M尿素，室溫處理過夜，然后置于4°C，12000rpm離心15min收集上清。對收集的上清進(jìn)行透析復(fù)性，復(fù)性緩沖液為5mM EDTA, 20mM Gly ρΗ9.0，20πιΜβ巰基乙醇。復(fù)性條件為4°C, 1:10比例,透析48小時，中途更換2次buffer。對透析后的樣品置于4°C,12000rpm離心20min收集上清，然后對復(fù)性后樣品更換緩沖液為lxPBS，得到純化的PLP。通過SDS-PAGE分析純化后的PLP的純度和分子量大小，并測定純化PLP的酶活及最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH以及有機(jī)試劑和金屬離子對酶活的影響。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:本發(fā)明提供的來源于深海熱液口瓜伊馬斯海盆宏基因組文庫中的patatin-like磷脂酶作為嗜熱酶，能水解對硝基苯酚乙酸酯pNPA、對硝基苯酚丁酸酯pNPB、對硝基苯酚辛酸酯pNPO、對硝基苯酚癸酸酯pNPDE、對硝基苯酚月桂酸酯PNPD0，催化效率高。以對硝基苯酚丁酸酯pNPB為底物，該酶的最適反應(yīng)pH為9.0，最適反應(yīng)溫度為70°C，其最適反應(yīng)溫度較現(xiàn)有技術(shù)中的大多數(shù)patatin-like磷脂酶要高，非常適合用于需要較高反應(yīng)溫度的工業(yè)生產(chǎn)中(比如油脂的脫膠)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯:
[0030]圖1為pET-28a (+) -pip重組質(zhì)粒物理圖譜；
[0031]圖2為patati n-like磷脂酶基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中I為用引物I和引物2擴(kuò)增得到的pip基因片段；2為Ikb DNA Marker ；
[0032]圖3為重組patatin-like磷脂酶基因表達(dá)圖譜，泳道I為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker ;泳道2為陰性對照，不加IPTG培養(yǎng)的BL21 (DE3)/pET_28a(+)-pip菌株；泳道3為復(fù)性后patatin-like磷脂酶(PLP)；
[0033]圖4為重組PLP最適反應(yīng)溫度結(jié)果圖(以對硝基苯酚丁酸酯pNPB為底物反應(yīng));
[0034]圖5為重組PLP溫度穩(wěn)定性結(jié)果圖(以對硝基苯酚丁酸酯pNPB為底物反應(yīng))；
[0035]圖6為重組PLP的最適合反應(yīng)pH結(jié)果圖(以對硝基苯酚丁酸酯pNPB為底物反應(yīng))；
[0036]圖7為重組PLP pH穩(wěn)定性結(jié)果圖(以對硝基苯酚丁酸酯pNPB為底物反應(yīng))；
[0037]圖8為重組PLP底物特異性示意圖；
[0038]圖9為有機(jī)試劑對重組PLP酶活的影響結(jié)果圖(以對硝基苯酚丁酸酯pNPB為底物反應(yīng))。
【具體實施方式】
[0039]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0040]實施例1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增pip基因及擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
[0041]設(shè)計含NdeI和NotI酶切位點的引物I和引物2，以具有酯類降解活性的亞克隆DNA為模板克隆patatin-like磷脂酶全長基因序列，引物I的序列如SEQ ID N0.3所示，引物2的序列如SEQ ID N0.4所示；PCR反應(yīng)在50 μ L體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，30循環(huán)后，最后72°C延伸IOmin0擴(kuò)增產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)明顯陽性擴(kuò)增帶，即大小與理論大小相近的DNA片段，切下含目的基因的凝膠塊，放入一潔凈1.5mL EP管中，按OMEGA生物小量膠回收試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，純化后的產(chǎn)物以0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果?；厥蘸驪CR產(chǎn)物命名為pip。由圖2可知，PCR擴(kuò)增的pip基因片段，經(jīng)電泳顯示主要為一條帶，為后續(xù)步驟打下基礎(chǔ)。
[0042]實施例2、表達(dá)載體的構(gòu)建[0043]對回收的pip片段及載體pET_28a(+)分別進(jìn)行雙酶切(NdeI和NotI)后割膠回收，割膠回收后的PlP片段連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞中。在含卡那霉素抗性的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接入含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10~14h后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗證插入目的片段的質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，測序正確的質(zhì)粒命名為pET-28a (+) -pip。將重組質(zhì)粒pET_28a (+) -pip轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，獲得含有重組質(zhì)粒 pET-28a(+) -pip 的重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET_28a(+) -pip。
[0044]實施例3、重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
[0045]挑取含重組質(zhì)粒的單個DH5a大腸桿菌分別接種于3mL LB液體培養(yǎng)基中(含Kan30 μ g/L)，置37°C搖床振蕩培養(yǎng)過夜，次日提取質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，分別取100 μ L菌液用玻棒均勻地涂布到含Kan (終濃度為30 μ g/L)的LB平板的表面，37°C倒置培養(yǎng)過夜。然后待菌長出，隨機(jī)挑取含重組質(zhì)粒的單菌落，接種于3mL含Kan的LB培養(yǎng)液中37°C過夜培養(yǎng)，次日按I %的接種量分別轉(zhuǎn)接到3mL含Kan的LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl為1.2，一根含重組質(zhì)粒培養(yǎng)管中不加誘導(dǎo)劑做陰性對照，另外I根培養(yǎng)管中加入終濃度為0.5mM IPTG，于30°C繼續(xù)培養(yǎng)3h。各取0.5mL培養(yǎng)物，1000Orpm室溫離心lmin，收集菌體，加60 μ L的無菌水懸菌，然后再加入20 μ L4X SDS上樣緩沖液，震蕩處理，蛋白純化時的樣液直接取30μ L加10 μ L4 X SDS上樣緩沖液，混勻后于100°C水浴5min，1000Orpm室溫離心5min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，由圖3可知，與對照相比，用0.5mM的IPTG誘導(dǎo)3h后，在大約35KDa處的一條條帶的量明顯增多，這個大小與預(yù)期結(jié)果一致。
[0046]實施例4、重組PLP的純化
[0047]所述PLP的純化及酶學(xué)性質(zhì)如下:將上述活得的重組菌株的發(fā)酵液離心后收集菌體，用 5 倍體積 binding buffer (含 20mmol/L 咪唑,0.3mol/L NaCl, 50mmoI /T, KH2PO4,pH7.6)重懸菌體，冰上超聲破碎菌體，裂解的菌體首先經(jīng)4000rpm，4°C離心lOmin，收集上清；上清再置于4°C, 13000rpm,離心20min,收集沉淀,得到包涵體。
[0048]將得到的包涵體首先溶于IOOmM Tris-HCl (pH7.5), IOOmM EDTA, 10 % TritonX-100,處理約lh，12000rpm離心lOmin，收集沉淀，并重復(fù)操作一次。然后將沉淀溶于5mMGly-NaOH(pH)，8M尿素，室溫處理過夜，然后置于4°C，12000rpm離心15min收集上清。對收集的上清進(jìn)行透析復(fù)性，復(fù)性緩沖液為5mM EDTA, 20mM Gly ρΗ9.0，20πιΜβ巰基乙醇。復(fù)性條件為4°C, I:10比例,透析48小時，中途更換2次buffer。對透析后的樣品置于4°C,12000rpm離心20min收集上清，然后對復(fù)性后樣品更換緩沖液為lxPBS，得到純化的PLP。通過SDS-PAGE分析純化后的PLP的純度和分子量大小，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)復(fù)性后的PLP蛋白較純，可用于后續(xù)的研究。
[0049]實施例5、酶活測定[0050]脂肪酶活性測定是根據(jù)水解酯類化合物生成的對硝基苯酚的含量來測定酶活。具體步驟:在滅菌的Eppendorf管中加入終濃度為IXPBS緩沖液(900uL)、50uLlmM底物，50uL純化的蛋白(體系為lmL)。立即在相應(yīng)溫度下水浴，開始計時。反應(yīng)10min后，立即加入250uLlM三氯乙酸以終止反應(yīng)，然后再加入250yL10%碳酸鈉進(jìn)行顯色，然后在410nm處測定其光吸收值。每個反應(yīng)做3個平行對照。酶活力根據(jù)以下方法進(jìn)行計算:1個酶活力單位是指在特定條件下，在I分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化I微摩爾底物的酶量。
[0051 ] 實施例6、反應(yīng)溫度對PLP活性的影響
[0052]以ImM pNPB為底物，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法將反應(yīng)物分別置于4°C，30°C，40°C，50 V ,60 °C, 70 V，85 V和95 V條件下反應(yīng)3min后，終止反應(yīng)，檢測反應(yīng)液在410nm處光吸收值。結(jié)果如圖4所示，在所選擇的各溫度下具有酶活性，隨著溫度升高，酶活性逐漸增大，在70°C時達(dá)到最高，隨著溫度進(jìn)一步升高，酶活有所降低。說明PLP最適反應(yīng)溫度為70°C。在較寬范圍內(nèi)^O-S(TC)都具有較高的酶活性，說明它在高溫催化方面具有良好的應(yīng)用前景，有成為工業(yè)用酶的潛質(zhì)。
[0053]實施例7、溫度對PLP酶穩(wěn)定性的影響
[0054]將酶液在不同溫度下(50°C，60°C，7(TC )分別進(jìn)行處理，每隔30min后取出樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法測定酶活性。結(jié)果如圖5所示，在經(jīng)50°C條件下處理120min后依然能殘留73%的活性，而經(jīng)60°C處理60min后，殘留活性能保持在85%以上，經(jīng)120min處理后，該蛋白依然能保留約70%的活性；而經(jīng)70°C處理120min后，該酶活力有所降低，但依然具有約60%以上的活性。
[0055]實施例8、pH值對PLP酶活性的影響
[0056]以ImM pNPB為底物，在上述測得的最適溫度條件下按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法將反應(yīng)物在不同pH(pH3.0-10.0)的緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，緩沖系統(tǒng)如下:pH3.0為50mMglycine-HCl, ρΗ4.0 到 6.0 為 50mM HAc-NaAc 緩沖液，pH6.0 到 8.0 為 50mM 磷酸鈉緩沖液，ρΗ8.0 到 9.0 為 Tris-HCl (50mM), pH9.0 到 10.0 為 glycine-Na0H(50mM)。結(jié)果如圖 6所示，在所能檢測的pH條件下，PLP在甘氨酸-鹽酸緩沖液pH3.0中活性較高，但pH為4.0時，活性反而降低，隨著PH值逐漸升高，PLP活性逐漸增大，在Tris-HCl緩沖液pH9.0時活性最高，隨著PH進(jìn)一步升高，酶活有所降低，在pH為10.0時該酶依然保持80%的活性，說明該酶是一個偏堿性酶。
[0057]實施例9、pH對PLP酶穩(wěn)定性的影響
[0058]將酶液在不同pH(pH7.0，pH8.0，pH9.0)下分別處理，每隔30min后取出樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法測定酶活性。結(jié)果如圖7所示，在經(jīng)PH70-9.0條件處理120min后，活力雖然有損失，但依然能保持較高的活力，尤其以在PH9.0的Tris-HCl中最穩(wěn)定，處理120min后能殘留約87%的活力。說明該酶具有良好的pH穩(wěn)定性。
[0059]實施例10、PLP底物特異性檢測[0060]選擇6種底物(對硝基苯酚乙酸酯pNPA(pNPC2)、對硝基苯酚丁酸酯pNPB (pNPC4)、對硝基苯酚辛酸酯pNPO (pNPC8)、對硝基苯酚癸酸酯pNPDE (pNPCIO)、對硝基苯酚月桂酸酯pNPDO (pNPC12)、對硝基苯酚棕櫚酸酯pNPP (pNPC16))，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法將反應(yīng)物置于最適條件下反應(yīng)10min后，終止反應(yīng)，檢測反應(yīng)液在410nm處光吸收值，結(jié)果如圖8所示，將水解pNPC4的活力確定為100%，PLP水解pNPC2、pNPC8、pNPC10、pNPC12、PNPC16 的相對活力分別為 72.10%,69%,95%,28%,5%0[0061 ] 實施例11、有機(jī)試劑對PLP酶活的影響
[0062]在最適反應(yīng)pH條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法，反應(yīng)體系中分別加入5% (v/v)的甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、1%SDS、0.1mM EDTA,0.1mM PMSF，于4°C處理I小時后再加入ImMpNPB,于最適反應(yīng)溫度條件下反應(yīng)10min后再檢測酶活，結(jié)果如圖9所示，1% SDS能使PLP完全失去活性，而PLP對其它有機(jī)試劑均具有較好的耐受性，經(jīng)處理I小時，其殘留活力均在80%以上。
[0063]實施例12、金屬離子對PLP酶活的影響
[0064]在最適反應(yīng)pH條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法，反應(yīng)體系中分別加入終濃度5mM的不同金屬離子(Ca2+，Cu2+，A13+，Co2+，F(xiàn)e3+，Ni2+，Zn2+，Mg2+)于 4°C處理 I 小時后再加入ImM pNPB，于最適反應(yīng)溫度條件下反應(yīng)3min后再檢測酶活。以對硝基苯酚丁酸酯pNPB為底物反應(yīng)時，5mM金屬離子對重組PLP酶活的影響結(jié)果如表1所示。
[0065]表1
【權(quán)利要求】
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì): (a)由如SEQID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)SEQID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有patatin-like磷脂酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為重組patatin-like磷脂酶，所述重組patatin-like磷脂酶能夠水解對硝基苯酚乙酸酯、對硝基苯酚丁酸酯、對硝基苯酚辛酸酯、對硝基苯酚癸酸酯、對硝基苯酚月桂酸酯中的一種或幾種。
3.一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為:核酸序列如SEQIDN0.1所示；或能與SEQ ID N0.1所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。
5.如權(quán)利要求3所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列來源于深海熱液口瓜伊馬斯海盆宏基因 組文庫。
6.一種含有權(quán)利要求3所述核酸序列的重組載體。
7.一種利用權(quán)利要求6所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
8.—種如權(quán)利要求3所述的核酸序列在制備重組patatin-like磷脂酶中的用途。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述制備包括如下步驟:構(gòu)建含所述核酸序列的重組載體，將所述的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得重組基因工程菌，誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到重組patatin-like磷脂酶。
10.一種重組patatin-like磷脂酶,其特征在于,所述重組patatin-like磷脂酶是通過如下方法制備而得的:構(gòu)建含如權(quán)利要求3所述核酸序列的重組載體，將所述的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得重組基因工程菌，誘導(dǎo)培養(yǎng)，即得所述重組patatin-like磷脂酶。
11.一種如權(quán)利要求10所述的重組patatin-like磷脂酶在油脂脫膠中的用途。
12.—種如權(quán)利要求10所述的重組patatin-like磷脂酶在制備溶血磷脂中的用途。
【文檔編號】C12N15/63GK103540576SQ201310462237
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】徐俊, 付玲, 肖湘, 王風(fēng)平 申請人:上海交通大學(xué)