檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的rt-pcr引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一對檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的RT-PCR引物及試劑盒。所述引物的上游引物核苷酸序列為5′-ATGTGGGATAGGGTGGACA-3′，下游引物核苷酸序列為5′-AAGAACCAGAAAAGACACCCAA-3′，所述試劑盒包括所述的引物。采用本發(fā)明能檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型是否呈陽性，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速簡便、檢測成本低等優(yōu)點。
【專利說明】檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的RT-PCR引物及試劑
合
Si
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物病毒分子生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一對檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的RT-PCR引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine!^productive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種急性傳染病，臨床主要特征為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困難等，在發(fā)病過程中會出現(xiàn)兩耳皮膚發(fā)紺發(fā)紫，故又稱為“藍(lán)耳病”。本病于1996年在我國首次報道。
[0003]依據(jù)PRRSV結(jié)構(gòu)基因序列的不同可以將其分為歐洲型(以Lelystad Virus株為代表)和美洲型(以ATCCVR-232株為代表)兩種基因型，而依據(jù)其致病力的不同，又可將其中的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒分為經(jīng)典豬藍(lán)耳病病毒和高致病性豬藍(lán)耳病病毒兩種亞型，高致病性豬藍(lán)耳病病毒包括高致病性豬藍(lán)耳病病毒江西株(JXAl-R株)、高致病性豬藍(lán)耳病病毒湖南株(HuM-Fl 12株)、高致病性豬藍(lán)耳病病毒天津株(TJ株)。歐洲地區(qū)主要流行歐洲型，美洲及亞 太地區(qū)則以美洲型為主。盡管PRRSV可以引起同一疾病，但是歐、美兩型毒株之間的基因組序列及抗原性存在很大差異，血清學(xué)實驗表明有一定的交叉反應(yīng)。目前，我國分離獲得的毒株大多數(shù)屬于美洲型，近年來，有學(xué)者通過分子生物學(xué)和血清學(xué)方法鑒定了歐洲型PRRSV，表明我國豬群中已經(jīng)存在歐洲型PRRSV。由于臨床癥狀復(fù)雜，且多為混合感染，因此需要建立一種快速簡便、特異性強(qiáng)的鑒別診斷方法，對國內(nèi)豬群中的PRRSV進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測、跟蹤病原，了解歐洲型、美洲型毒株在我國不同地區(qū)的流行和分布規(guī)律，更好的預(yù)防、控制PRRSV的流行和散發(fā)。
[0004]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于擴(kuò)增特定的DNA片段。隨著PCR技術(shù)研究和應(yīng)用的深化，該技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，幾乎所有已知的DNA和RNA序列的病毒均可用PCR和RT-PCR方法進(jìn)行特異性檢測、診斷，如口蹄疫、豬瘟、藍(lán)耳、偽狂犬病、細(xì)小病毒感染、傳染性法氏囊病、禽流感等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一對檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的RT-PCR引物及試劑盒，經(jīng)一次反應(yīng)便能檢測樣本是呈豬藍(lán)耳病病毒歐洲型陽性，或者是呈豬藍(lán)耳病美洲型疽皇陽性，或者上述病毒均呈陽性，具有較高的靈敏度和特異性，且檢測成本低，有良好的應(yīng)用前景。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0007]一對檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的RT-PCR引物，所述引物的上游引物核苷酸序列為5 ' -ATGTGGGATAGGGTGGACA-3 '，下游引物核苷酸序列為5' -AAGAACCAGAAAAGACACCCAA-3,。[0008]一種檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的試劑盒，所述試劑盒包括以上所述的引物。[0009]以上所述檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的試劑盒，所述試劑盒還包括:RNA提取試劑、RT反應(yīng)試劑、PCR反應(yīng)試劑、電泳檢測試劑、陰性對照和陽性對照。
[0010]所述RNA提取試劑包括=Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇；
[0011]所述RT反應(yīng)試劑包括:5Xbuffer緩沖液、dNTPs、HIR和下游引物E-Sd ；
[0012]所述PCR 反應(yīng)試劑包括:Taq DNA 酶、10 Xbuffer 緩沖液、dNTPs、MgCl2 和 cDNA ；
[0013]所述電泳檢測試劑包括:50倍稀釋的TAE電泳緩沖液；
[0014]所述陰性對照包括:DEPC水；
[0015]所述陽性對照包括:豬藍(lán)耳病病毒歐洲型、豬藍(lán)耳病病毒美洲型。
[0016]所述豬藍(lán)耳病病毒歐洲型可為豬藍(lán)耳病病毒歐洲型(LV株)，如:廣西大學(xué)傳染病與分子病毒學(xué)保存豬藍(lán)耳病病毒歐洲型(LV株);所述豬藍(lán)耳病病毒美洲型可為經(jīng)典豬藍(lán)耳病病毒或高致病性豬藍(lán)耳病病毒，如:高致病性豬藍(lán)耳病病毒(JXAl-R株)，優(yōu)選高致病性豬藍(lán)耳病疫苗JXAl-R株。
[0017]本發(fā)明的具體原理是利用豬藍(lán)耳病病毒歐洲型和美洲型Nsp2基因的同源性，應(yīng)用0LIG6.0軟件，合成一對靶核苷酸序列的特異性引物，通過RT-PCR擴(kuò)增后分別產(chǎn)生不同長度的目的片段，擴(kuò)增豬藍(lán)耳病病毒歐洲型特異性核酸目的片段長度為574bp，擴(kuò)增豬藍(lán)耳病病毒美洲型特異核酸目的片段為667bp，從而達(dá)到檢測樣本是否呈豬藍(lán)耳病病毒歐洲型陽性，或者呈豬藍(lán)耳病病毒美洲型陽性，或者上述病毒均呈陽性的目的。試驗方法及過程如下:
[0018]1.引物設(shè)計:
[0019]PCR反應(yīng)中有兩條引物，即Y端引物和:V引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)(常以信息鏈為基準(zhǔn))，5'端引物與位于待擴(kuò)增片段5'端上的一小段DNA序列相同；3'端引物與位于待擴(kuò)增片段3'端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物長度一般為16-25bp左右，引物之間、引物內(nèi)無互補(bǔ)序列。通過對豬藍(lán)耳病病毒歐洲型及美洲型的代表株VR2332基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的片段，設(shè)計多對引物，通過匹配、篩選最優(yōu)引物組合如下:
[0020]上游引物E-Su 序列:5' -ATGTGGGATAGGGTGGACA-3'
[0021 ]下游引物 E-Sd 序列:5' -AAGAACCAGAAAAGACACCCAA-3'
[0022]2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化:
[0023]將滅活的待檢樣品用Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分別分裝后儲存于_20°C備用。
[0024]2.1引物用量的優(yōu)化在反應(yīng)體系其他條件相同的情況下，將引物對的用量分別從
0.1 μ L至1.8μ L加入體系,通過實驗結(jié)果分析比較,確定最優(yōu)引物用量為0.5μ L。
[0025]2.2氯化鎂濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系其他條件相同的情況下通過實驗結(jié)果分析比較，確定氯化鎂的濃度為25mM最佳。
[0026]2.3反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)的優(yōu)化通過實驗結(jié)果對比分析，選擇200U/ μ L反轉(zhuǎn)錄酶作為反應(yīng)體系最佳用量。
[0027]2.4Taq DNA聚合酶(Taq酶)的優(yōu)化通過實驗結(jié)果對比分析，選擇5U/ μ L酶作為反應(yīng)體系最佳用量。
[0028]2.5dNTPs濃度的優(yōu)化通過使用不同濃度的dNTPs進(jìn)行檢測，反轉(zhuǎn)錄時選擇10mM，PCR擴(kuò)增時選擇2.5mM作為反應(yīng)體系最佳用量。
[0029]利用上述引物和各成分的最終濃度，最后確定采用的RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，所需各組及相應(yīng)濃度見表1。
[0030]表1檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的RT-PCR反應(yīng)體系
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一對檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的上游引物核苷酸序列為Y -ATGTGGGATAGGGTGGACA-3 '，下游引物核苷酸序列為5' -AAGAACCAGAAAAGACACCCAA-3,。
2.一種檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括:RNA提取試劑、RT反應(yīng)試劑、PCR反應(yīng)試劑、電泳檢測試劑、陰性對照和陽性對照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的試劑盒，其特征在于: (1)所述RNA提取試劑包括=Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇； (2)所述RT反應(yīng)試劑包括:5Xbuffer緩沖液、dNTPs、HIR和下游引物E-Sd； (3)所述PCR 反應(yīng)試劑包括:Taq DNA 酶、IOXbuffer 緩沖液、dNTPs,MgCl2 和 cDNA ； (4)所述電泳檢測試劑包括:50倍稀釋的TAE電泳緩沖液； (5)所述陰性對照包括:DEPC水； (6)所述陽性對照包括:豬藍(lán)耳病病毒歐洲型、豬藍(lán)耳病病毒美洲型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測豬藍(lán)耳病病毒歐洲型與美洲型的試劑盒，其特征在于，所述豬藍(lán)耳病病毒歐洲型為豬藍(lán)耳病病毒歐洲型LV株；所述豬藍(lán)耳病病毒美洲型為高致病性豬藍(lán)耳病病毒JXAl-R株。
6.一種如權(quán)利要求4-5中 任一所述檢測口蹄疫A型病毒試劑盒的使用方法，包括以下步驟: (1)病毒RNA的提取: 取待檢樣品、陽性對照、陰性對照各500μ L于1.5ml滅菌無RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液進(jìn)行裂解，充分振蕩，室溫放置10分鐘；加入300 μ L氯仿，搖勻放置10分鐘；低溫高速離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘；緩慢取出上層液體600 μ L放置于新的EP管；加入等量異丙醇輕輕混勻，_20°C放置30分鐘；低溫高速離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，棄去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取Iml于管內(nèi)洗滌沉淀，充分吸棄洗滌；將EP管倒置于吸水紙上，盡量吸干液體，放置于37°C溫箱中15分鐘，管內(nèi)無可見水珠時取出；加入25 μ L DEPC水，_20°C保存?zhèn)溆茫? (2)RT操作程序:
取 5Xbuffer 緩沖液 5 μ L、dNTPs 2 μ L, M-MLV 0.5 μ L、HIR 0.5 μ L、下游引物 E-Sd（2 μ L,RNA 15 μ L,將上述液體置于同一EP管內(nèi)，混勻后放于PCR儀按如下程序操作:42 V（60 min,95 V 5 min ； (3)PCR操作程序: 上游引物E-Su 0.5 μ L、下游引物E-Sd 0.5 μ L,Taq DNA酶0.2 μ LUOXbuffer 緩沖液（2.5 μ L、dNTPs 2μ L、MgCl22y L、DEPC 水 12.3μ L, cDNA 5 μ L，將上述液體置于同一 EP 管內(nèi)，混勻后放于PCR儀按如下程序操作，擴(kuò)增條件:94 V 30s ,57 V 30 s，72 V 30 s,（35個循環(huán)，72 °C延伸7 min ； (4)電泳操作程序: 稱Ig瓊脂糖放于錐形瓶中，加入50倍稀釋的TAE電泳緩沖液100 mL，于微波爐中熔解，在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將7μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加上2yL染色液混勻后點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以120V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果?！?br> 【文檔編號】C12Q1/68GK103571972SQ201310462259
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】顏健華, 甘甲忠, 黃宇, 熊毅, 曾永芳, 馮淑萍, 李軍, 張紅云 申請人:廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心, 玉林市動物疫病預(yù)防控制中心