一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的冷凍保存方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的冷凍保存方法。它先將組織勻漿處理成乳糜狀，然后加入冷凍液混勻，分裝到含有蔗糖、DMSO和谷胱甘肽的冷凍管中，之后放置在冷凍保存盒中-80℃超低溫冰箱過夜，最后放入液氮中長期保存。解凍時依次經(jīng)過解凍液、培養(yǎng)液離心洗滌，之后組織塊可直接接種培養(yǎng)或經(jīng)蛋白酶消化成單個細(xì)胞后培養(yǎng)。本發(fā)明先將組織用勻漿機(jī)處理成乳糜狀，有利于冷凍保護(hù)劑滲透進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)水分脫出；同時冷凍液中添加的非滲透性保護(hù)劑蔗糖，也有利于組織細(xì)胞內(nèi)的水分脫出；加入抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽，有助于減輕氧自由基對細(xì)胞內(nèi)蛋白的破壞作用。解凍后組織塊在培養(yǎng)瓶內(nèi)直接接種，貼壁存活率在96%以上。
【專利說明】一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的冷凍保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物冷凍保存技術(shù)，具體是一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的冷凍保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域，成為科研或生產(chǎn)中不可或缺的技術(shù)手段。目前，動物機(jī)體幾乎所有的組織經(jīng)簡單機(jī)械或蛋白酶處理后接種到培養(yǎng)瓶中，在適宜的培養(yǎng)條件下都能增殖擴(kuò)繁(SpierRE.Large-scale mammalian cell culture: methods, applications and products.CurrOpinBiotechnol.1991 Jun:2(3):375-9)。然而研究表明，這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)的傳代次數(shù)不能過多，否則會出現(xiàn)細(xì)胞生長緩慢、老化以及生物學(xué)功能逐漸喪失等不良現(xiàn)象。因此，如果試驗或生產(chǎn)中要重復(fù)進(jìn)行、多次培養(yǎng)細(xì)胞時，那就需要不斷采集新鮮組織。
[0003]由于細(xì)胞培養(yǎng)時所取組織應(yīng)該盡可能無細(xì)菌或病毒污染、同時具有較強(qiáng)的增殖活性，所以取樣時通常將組織放在含抗生素的液體如磷酸鹽緩沖液(PBS )或生理鹽水中保存，盡快(3-4小時內(nèi))送回實驗室處理。如果取樣現(xiàn)場距離實驗室較遠(yuǎn)或交通不方便的情況下，組織在液體中保存時間過長，那么會造成細(xì)胞活性降低，接種后細(xì)胞生長緩慢；而且由于取樣通常并不是在無菌環(huán)境中，時間過長也會造成液體中細(xì)菌大量增殖，培養(yǎng)后容易發(fā)生污染。因此，如果能將組織進(jìn)行冷凍保存，在下次細(xì)胞培養(yǎng)時直接解凍、復(fù)蘇組織而不需再次取樣，這樣就極大地避免了麻煩及浪費，也能夠最大限度地利用材料；而且如果所取樣品為珍稀、甚至是瀕危滅絕動物的稀缺組織，冷凍保存組織的意義就更不可估量。
[0004]組織冷凍保存時，滲透性冷凍保護(hù)劑如二甲基亞砜(DMS0)、乙二醇或甘油等必須滲透進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中才能起到保護(hù)作用，防止組織細(xì)胞內(nèi)冰晶的生成。然而如果組織過大，則不利于冷凍保護(hù)劑穿透進(jìn)入，影響冷凍保存效果。盡管目前有組織塊冷凍保存成功的報道(孫蘇軍，安志興，彭新榮， 張涌.山羊乳腺組織塊冷凍保存實驗，西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，33(4):5-8)，但該冷凍方法操作過程非常繁瑣、費時，具體表現(xiàn)為:先加基礎(chǔ)液，冰上預(yù)冷15min，放入組織塊后在搖床上平衡6h ;分兩次添加DMSO ;冷凍時0°C平衡lh, _20°C平衡2h。同時保存組織塊的數(shù)量較少(每管僅凍存6塊)，而且復(fù)蘇后組織塊的存活率(最高存活率為89.8%)還需進(jìn)一步提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決細(xì)胞培養(yǎng)時組織取樣存在的問題，改善目前組織塊冷凍保存方法存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的冷凍保存方法。本發(fā)明在冷凍前先將組織處理成小的組織塊，這步處理實際上等同于細(xì)胞培養(yǎng)時的組織塊剪碎處理，組織塊解凍后就可直接接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)或經(jīng)蛋白酶消化成單個細(xì)胞后培養(yǎng)。該方法操作步驟簡單、花費時間短，一次能凍存較多數(shù)量的組織塊，復(fù)蘇后組織塊貼壁存活率高達(dá)96%以上。[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的冷凍保存方法，其特征是，先將新取的動物組織勻漿處理成乳糜狀，然后加入冷凍液混勻，分裝到冷凍管中，之后放置在冷凍保存盒中-80°C超低溫冰箱過夜，最后放入液氮中長期保存。
[0007]具體包括以下步驟:
(1)冷凍液組分與配制
每 100ml 冷凍液含有:二甲基亞砜(DMSO) 9-11ml、Supercool X-1000 0.8-1.5 ml、胎牛血清(FBS) 15-20 ml、谷胱甘肽 0.15-0.25g、蔗糖 1-2g 和 DMEM/F12 液 75.2-67.5ml ;冷凍液經(jīng)0.22微米濾膜過濾后4°C保存；
(2)組織勻漿處理
在無菌超凈臺內(nèi)首先將組織放在平皿中修剪成1.0-1.2cm3的塊狀，然后用PBS液徹底沖洗5-8遍，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾3-5下，讓組織塊稍微干燥后，放入組織勻漿機(jī)的無菌試管內(nèi)，180-200轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理3-5分鐘，這時組織塊成乳糜狀；
(3)組織塊的冷凍
冷凍時，先用吸管將乳糜狀組織塊放入離心管內(nèi)，根據(jù)組織塊的體積加入8-10倍量的冷凍液混勻，然后按每管5毫升分裝到凍存管中，之后放置在冷凍保存盒中_80°C超低溫冰箱過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)入液氮中長期保存(注:從加入冷凍液到將冷凍保存盒放置在超低溫冰箱中整個操作時間在5-8分鐘內(nèi)完成，且室溫維持在22-25°C)。
[0008]解凍方法:解凍時依次經(jīng)過解凍液、培養(yǎng)液離心洗滌，之后組織塊可直接接種培養(yǎng)或經(jīng)蛋白酶消化成單個細(xì)胞后培養(yǎng)。
[0009](1)解凍液組分與配制
每100ml解凍液含有:FBS 10-15ml、谷胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖2-3g和DMEM/F12液90-85ml，經(jīng)0.22微米濾膜過濾后4°C保存；
(2)解凍時，先將凍存管從液氮中取出，放在38-39°C水浴中溶解，用吸管吸取組織塊放入離心管中，加入4-5倍量解凍液輕輕混勻后靜置3-5分鐘，然后離心(800轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘)去掉上清液,之后再加入4-5倍量培養(yǎng)液輕輕混勻后離心(800轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘)并去掉上清液，這時可將組織塊直接接種到培養(yǎng)瓶中或經(jīng)蛋白酶消化成單個細(xì)胞，加入培養(yǎng)液后放CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:(1)本發(fā)明先將組織用勻漿機(jī)處理成乳糜狀，這種處理不僅比已報道的徒手切塊剪碎省時、省力，而且使單個組織塊更均勻、細(xì)小(每塊直徑在
0.1-0.2 mm之間)，有利于冷凍保護(hù)劑DMSO滲透進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)水分脫出；同時冷凍液中添加的非滲透性保護(hù)劑蔗糖，也有利于組織細(xì)胞內(nèi)的水分脫出，所以冷凍時能有效地防止組織細(xì)胞內(nèi)冰晶的生成。(2)本發(fā)明在冷凍液和解凍液中加入抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽，有助于減輕氧自由基對細(xì)胞內(nèi)蛋白的破壞作用，將冷凍損傷降到最低。解凍后組織塊如果在培養(yǎng)瓶內(nèi)直接接種，貼壁存活率在96%以上，高于已報道的89.8%。如果用蛋白酶消化成單個細(xì)胞后經(jīng)臺盼藍(lán)染色，活細(xì)胞率為92.8%，與新鮮組織消化后活細(xì)胞率為94.6%差異不顯著；(4)本發(fā)明方法已在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所內(nèi)部推廣使用，普遍認(rèn)為是一種省時省力的組織冷凍保存方法。
【專利附圖】

【附圖說明】[0011]圖1為實施例1貼壁約90-100%的肌肉細(xì)胞生長圖片(相差顯微鏡下放大100倍觀察)。
[0012]圖2為實施例2貼壁約90-100%的乳腺細(xì)胞生長圖片(相差顯微鏡下放大100倍觀察)。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
1、冷凍液配制
將9毫升DMSO, I毫升Supercool X-1000、18毫升FBS,0.2克谷胱甘肽、1.2克蔗糖溶解在72毫升DMEM/F12液中，經(jīng)0.22微米濾膜過濾后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0014]2、解凍液配制
將12毫升FBS、0.2克谷胱甘肽、3克蔗糖溶解在88毫升DMEM/F12液中，經(jīng)0.22微米濾膜過濾后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0015]3、肌肉組織樣品處理
從屠宰場剪取成年魯西黃牛后肢外側(cè)肌肉組織，放在含1%青鏈霉素液的PBS液中2小時內(nèi)帶回實驗室。在無菌超凈臺內(nèi)首先將肌肉組織放在平皿中，修剪成I cm3塊狀，然后用PBS液沖洗8遍，沖洗時操作者左手持彎眼科鑷夾住組織塊，右手持彎眼科剪用其外側(cè)鈍端反復(fù)擺攤開組織塊內(nèi)部，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾3下，讓組織塊稍微干燥后接著放入組織勻漿機(jī)的無菌試管內(nèi)，180轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理5分鐘，這時組織塊成乳糜狀。
[0016]4、組織塊的冷凍與解凍
冷凍時室溫為25°C，先用吸管將乳糜狀的組織塊放入50毫升離心管內(nèi)，每管內(nèi)組織塊為3毫升,然后加入30毫升冷凍液輕輕混勻,之后按每管5毫升分裝到凍存管中,放置在冷凍保存盒中_80°C超低溫冰箱過夜，整個操作時間在5分鐘內(nèi)完成。次日將凍存管轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。
[0017]68天后解凍組織塊，先將凍存管從液氮中取出，放在38°C水浴中溶解，然后用吸管吸取組織塊放入50毫升離心管中，加入25毫升解凍液輕輕混勻后靜置4分鐘，之后離心(800轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘)去掉上清液，再加入25毫升培養(yǎng)液(添加10% FBS,0.5%青鏈霉素混合液的DMEM/F12液)輕輕混勻后離心(800轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘)并去掉上清液。
[0018]5、解凍后細(xì)胞培養(yǎng)
用吸管將組織塊直接接種到T75培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)瓶的對側(cè)加入25毫升培養(yǎng)液后放CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，2小時后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)液充分浸潤組織塊并繼續(xù)培養(yǎng)。70小時后有細(xì)胞從組織中游離出來，98小時后有約10-20%細(xì)胞貼壁，這時在相差顯微鏡下統(tǒng)計組織塊貼壁存活率為96.2%，之后換入新鮮培養(yǎng)液，7天后有約90-100%細(xì)胞貼壁(如圖1所示)。
[0019]實施例2
1、冷凍液配制
將11毫升DMS0U.2毫升Supercool X_1000、20毫升FBS、0.15克谷胱甘肽、I克蔗糖溶解在67.8毫升DMEM/F12液中，經(jīng)0.22微米濾膜過濾后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020]2、解凍液配制
將12毫升FBS、0.15克谷胱甘肽、2克蔗糖溶解在88毫升DMEM/F12液中，經(jīng)0.22微米濾膜過濾后4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0021]3、乳腺組織樣品處理
從屠宰場剪取荷斯坦奶牛乳腺組織，放在含1%青鏈霉素液的PBS液中3小時內(nèi)帶回實驗室。在無菌超凈臺內(nèi)首先將乳腺組織放在平皿中，修剪成1.2 cm3塊狀，然后用PBS液沖洗6遍，沖洗時操作者左手持彎眼科鑷夾住組織塊，右手持彎眼科剪用其外側(cè)鈍端反復(fù)擺攤開組織塊內(nèi)部，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾5下，讓組織塊稍微干燥后接著放入組織勻漿機(jī)的無菌試管內(nèi)，190轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理3分鐘，這時組織塊成乳糜狀。
[0022]4、組織塊的冷凍與解凍
冷凍時室溫為23°C，先用吸管將乳糜狀的組織塊放入50毫升離心管內(nèi)，每管內(nèi)3.5毫升，然后加入32毫升冷凍液混勻，之后按每管5毫升分裝到凍存管中，放置在冷凍保存盒中-80°C超低溫冰箱過夜，整個操作時間在8分鐘內(nèi)完成。次日將凍存管轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。
[0023]134天后解凍組織塊，先將凍存管從液氮中取出，放在39°C水浴中溶解，然后用吸管吸取組織塊放入離心管中，加入20毫升解凍液輕輕混勻后靜置3分鐘，之后離心(800轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘)去掉上清液，再加入20毫升培養(yǎng)液(添加10% FBS,5 ng/mL表皮生長因子、0.5%青鏈霉素混合液的DMEM/F12液)輕輕混勻后離心(800轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘)并去掉上清液。
[0024]5、解凍后細(xì)胞培養(yǎng)
在離心管內(nèi)加入5毫升0.25%胰酶消化液，用吸管反復(fù)吹打組織塊后放在培養(yǎng)箱內(nèi)，以后每隔5分鐘用吸管反復(fù)吹打組織塊，15分鐘后組織塊呈柔軟的絲線狀，這時在離心管內(nèi)加入20毫升培養(yǎng)液，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾后離心(800轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘)去掉上清液，然后重新加入培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度約為5 X IO5個/毫升，同時用臺盼藍(lán)染色統(tǒng)計活細(xì)胞率為92.8% (注:冷凍前已進(jìn)行新鮮乳腺組織的消化處理，檢測活細(xì)胞率為94.6%)。之后按每個T75培養(yǎng)瓶加入25毫升細(xì)胞混合液放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，18小時后有約10-20%細(xì)胞貼壁，48小時后換入新鮮培養(yǎng)液，96小時后有約90-100%細(xì)胞貼壁(如圖2所示)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的冷凍保存方法，其特征是，先將新取的動物組織勻漿處理成乳糜狀，然后加入冷凍液混勻，分裝到冷凍管中，之后放置在冷凍保存盒中-80°C超低溫冰箱過夜，最后放入液氮中長期保存；所述冷凍液的組分為:每100ml冷凍液含有:二甲基亞砜 9-llml、Supercool X-1000 0.8-1.5 ml、胎牛血清 15-20 ml、谷胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖l-2g和DMEM/F12液75.2-67.5ml ;冷凍液經(jīng)0.22微米濾膜過濾后4°C保存。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的冷凍保存方法，其特征是， (1)在無菌超凈臺內(nèi)首先將組織放在平皿中修剪成1.0-1.2cm3的塊狀，然后用PBS液徹底沖洗5-8遍，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾3-5下，讓組織塊稍微干燥后，放入組織勻漿機(jī)的無菌試管內(nèi)，180-200轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理3-5分鐘，這時組織塊成乳糜狀； (2)冷凍時，先用吸管將乳糜狀組織塊放入離心管內(nèi)，根據(jù)乳糜狀組織塊的體積加入8-10倍量的冷凍液混勻，然后按每管5毫升分裝到凍存管中，之后放置在冷凍保存盒中-80°C超低溫冰箱過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。
3.一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的解凍方法，其特征是，解凍時先將權(quán)利要求1或2所述的凍存管從液氮中取出，依次經(jīng)過解凍液離心洗滌、培養(yǎng)液離心洗滌，之后組織塊可直接接種培養(yǎng)或經(jīng)蛋白酶消化成單個細(xì)胞后培養(yǎng)；所述解凍液的組分為:每100ml解凍液含有:胎牛血清10_15ml、谷胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖2_3g和DMEM/F12液90_85ml，經(jīng)0.22微米濾月旲過濾后4 C保存。
4.如權(quán)利要求3所述的用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織塊的解凍方法，其特征是，解凍時，先將權(quán)利要求I或2所述的凍存管從液氮中取出，放在38-39°C水浴中溶解，用吸管吸取組織塊放入離心管中，加入4-5倍量解凍液輕輕混勻后靜置3-5分鐘,然后離心去掉上清液,之后再加入4-5倍量培養(yǎng)液輕輕混勻后離心并去掉上清液，這時可將組織塊直接接種到培養(yǎng)瓶中或經(jīng)蛋白酶消化成單個細(xì)胞，加入培養(yǎng)液后放CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N5/071GK103478118SQ201310465591
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】譚秀文, 游偉, 靳青, 劉桂芬, 劉曉牧, 宋恩亮, 萬發(fā)春 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所