一種水稻人工微染色體的構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一套水稻人工微染色體和一種水稻人工微染色體的構(gòu)建方法--水稻端粒序列及含中心粒的BAC克隆在構(gòu)建水稻人工微染色體的應(yīng)用。本發(fā)明提供了構(gòu)建含中心粒序列、端粒序列、篩選標(biāo)記、報(bào)告基因等元件的水稻人工微染色體的技術(shù)方案。本發(fā)明通過組裝染色體必備元件：中心粒、端粒、篩選標(biāo)記、報(bào)告基因等，構(gòu)建了一套水稻人工微染色體。本發(fā)明為研究中心粒、端粒等的行為和功能，同時(shí)為多基因或大片段DNA遺傳轉(zhuǎn)化提供新一代的載體，具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
【專利說明】一種水稻人工微染色體的構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中水稻人工微染色體的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]作為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，基因工程技術(shù)從發(fā)展至今已經(jīng)經(jīng)歷了三十多年，并取得了重大的成就，但是其應(yīng)用仍存在諸多問題及挑戰(zhàn)。隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，研究也越來越深入，并進(jìn)入了后基因組研究時(shí)代，并且各種動(dòng)植物基因組序列的面試，也為基因工程技術(shù)提供了更廣闊的信息平臺(tái)，大大推動(dòng)了農(nóng)牧業(yè)、食品、環(huán)保等領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)程。
[0003]植物基因工程技術(shù)主要是將外源基因構(gòu)建到可表達(dá)的重組載體中，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)或者通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化到宿主基因組中表達(dá)，最終改變植物性狀。隨著研究的 不斷發(fā)展，局限性也愈發(fā)明顯，歸納來有這幾方面：
[0004]一是在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，由于外源基因（DNA)隨機(jī)插入到宿主基因組中，從而導(dǎo)可能致自身基因插入失活；二是外源基因的表達(dá)可能受其插入位點(diǎn)上游或下游調(diào)節(jié)元件的影響；三是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法實(shí)現(xiàn)多基因的共轉(zhuǎn)化難度較大；四是在轉(zhuǎn)基因過程中，由于外源基因會(huì)以多拷貝形式整合，可能會(huì)引起表達(dá)量低、基因沉默及轉(zhuǎn)基因的不穩(wěn)定等情況； 轉(zhuǎn)化的隨機(jī)性經(jīng)常將轉(zhuǎn)基因置于染色體不同位置或不同染色體上，多個(gè)基因很難協(xié)調(diào)表達(dá)。
[0005]雖然插入失活和位置效應(yīng)可以通過現(xiàn)有的篩選技術(shù)盡量消除，而多基因轉(zhuǎn)化則大大地限制了對(duì)數(shù)量性狀基因及代謝途徑中多個(gè)基因協(xié)同作用的研究。如何有效地實(shí)施基因疊加（genestacking)，則是未來轉(zhuǎn)基因研究的主要挑戰(zhàn)和目標(biāo)。有效地實(shí)施基因疊加就需要尋找新的轉(zhuǎn)基因載體，如將外源基因通過游離病毒載體進(jìn)行表達(dá)，或者通過工程細(xì)胞器、 人工微小染色體等進(jìn)行多基因的疊加。
[0006]植物人工染色體是一種采用遺傳工程技術(shù)，從植物染色體中分離控制染色體復(fù)制的主要組件，包括：端粒、著絲粒及自主復(fù)制序列等，加上人工選擇標(biāo)記、外源基因克隆位點(diǎn)等遺傳轉(zhuǎn)化等構(gòu)件進(jìn)行組裝，形成能自主復(fù)制、獨(dú)立分離的、能攜帶大的基因組DNA片段的人工微染色體載體。具備染色體的部分功能，也具有載體功能，由于人工染色體微小，不能與宿主染色體配對(duì)，在細(xì)胞周期中以附加體形式存在。植物人工染色體可以在附加染色體上提供穩(wěn)定的多基因表達(dá)，為解決多個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)化的問題提供了解決方法，是新一代的轉(zhuǎn)基因載體。例如，微染色體可以同時(shí)表達(dá)多種抗性基因（抗蟲、抗細(xì)菌、抗真菌、抗除草劑、抗逆），還可以表達(dá)提聞作物品質(zhì)的基因。
[0007]植物人工染色體的研究起步較晚，主要參照動(dòng)物和人類中人工染色體的構(gòu)建方法。目前，植物人工染色體構(gòu)建策略主要有2種，一種是以自身染色體為基礎(chǔ)，通過必要的加工產(chǎn)生，如端粒介導(dǎo)的染色體截?cái)嗉夹g(shù)；第二種以染色體的功能元件為基礎(chǔ)組裝產(chǎn)生。 從著絲粒入手，這種方法主要是基于雙著絲粒染色體的產(chǎn)生，通過著絲粒衛(wèi)星DNA序列和其它宿主序列的克隆結(jié)合轉(zhuǎn)基因的方法形成雙著絲粒染色體；另外，通過克隆著絲粒并在體外拼接形成新染色體的方法已有成功的報(bào)道，在玉米人工微小染色體研究中，Carlson等在體外將標(biāo)記基因、篩選基因及著絲粒重復(fù)序列連接成環(huán)，通過粒子轟擊將這段DNA序列轉(zhuǎn)化到玉米細(xì)胞中，在細(xì)胞中完成微小染色體的組裝，這種染色體在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中可以穩(wěn)定遺傳。Ananiev等將玉米的著絲粒序列、端粒序列及選擇標(biāo)記基因等在體外連接，通過粒子轟擊的方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，最終組裝成為微小染色體。
[0008]無論是基于天然染色體改造的自上而下策略，還是將克隆的染色體功能元件人工組裝的自下而上策略，在哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞研究中都有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，而在植物中的研究都只是處于起步階段，特別是在主要糧食作物-水稻上，De Novo構(gòu)建水稻人工微染色體還沒有成功的報(bào)道。
[0009]雖然目前植物人工染色體的研究離實(shí)際應(yīng)用還有很大距離，要成為轉(zhuǎn)基因載體還需要解決很多問題也是未來植物基因工程的重要發(fā)展方向，但隨著人們研究的深入和技術(shù)的發(fā)展，其廣闊的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)價(jià)值會(huì)更加受到人們的重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種水稻人工微染色體的構(gòu)建方法和一套水稻人工微染色體。
[0011]本發(fā)明提供了水稻端粒序列及含中心粒的亞克隆在構(gòu)建水稻人工微染色體的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明提供了構(gòu)建含中心粒序列、端粒序列、篩選標(biāo)記、報(bào)告基因等元件的水稻人工染色體的技術(shù)方案。
[0013]本發(fā)明通過組裝染色體必備元件：中心粒、端粒、篩選標(biāo)記、報(bào)告基因等，構(gòu)建了一套水稻人工微染色體。本發(fā)明為研究中心粒、端粒等的行為和功能，同時(shí)為多基因或大片段 DNA遺傳轉(zhuǎn)化提供新一代的載體，具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖I為高密度膜雜交結(jié)果展示圖
[0015]圖2篩選標(biāo)記基因S少與正反向端粒序列裝載流程簡(jiǎn)圖
[0016]圖3為Tn5_Transposon的拼接流程簡(jiǎn)圖
[0017]圖4為獲得的RACl的PCR驗(yàn)證電泳圖譜
[0018]圖5為RACs示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0019]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0020]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0021]pUC57、pUC19、pH7WGI2D、EZ-Tn5pM0DTM_2〈MCS> 載體及菌種均可以從商業(yè)途徑得到。
[0022]實(shí)施例I、含有水稻中心粒的BAC克隆篩選
[0023]I日本晴BAC文庫（AGI)高密度雜交膜的制備
[0024]I)利用機(jī)器手將日本晴BAC文庫保存在384孔培養(yǎng)板中的克隆點(diǎn)到Hybond-N+雜交膜上。[0025]2)將膜置于X-gal / IPTG / Chl LB固體選擇培養(yǎng)基上，37°C，培養(yǎng)24h左右。
[0026]3)將膜從LB固體選擇培養(yǎng)基上揭下，將膜放在由以下溶液浸泡的濾紙上，長(zhǎng)有克隆的一面朝上。
[0027]
盤子
a)
b)
c)
d)
e)
f) g)
盒子
a)
b)
c)
d)
溶液 10% SDS 變性液II 中和液II 中和液II 2xSSC, 0.1%SDS 2xSSC 0.4M NaOH 溶液 5xSSC, 0.1%SDS 5xSSC, 0.1%SDS 2xSSC
時(shí)間 4min 5 min 5min 5 min 5min 5min 5min 時(shí)間 20min 20min IOmin IOmin
2xSSC
[0028]4)處理后將膜放在濾紙上 ，空氣干燥。
[0029]5) 80 V烤箱烘烤膜此。
[0030]6)膜可立刻用于雜交或4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0031]2RCS1和RCS2探針的制備
[0032]I)人工合成水稻著絲粒重復(fù)序列RCS1(含有栽培稻著絲粒特異的逆轉(zhuǎn)座子 CRR(Centromere-specific retrotransposon of rice)序列兀件）和 RCS2 (含有著絲粒串聯(lián)重復(fù)序列CentO)，克隆于質(zhì)粒pUC57中。
[0033]2)取I ii g探針質(zhì)粒DNA，沸水浴變性5min。
[0034]3)加入4 ill DIG-High prime, ddH20補(bǔ)齊至總體積20 ii I,混勻并離心。
[0035]4) 37 °C,標(biāo)記探針 20h。
[0036]5) 650C，終止酶反應(yīng)10min。
[0037]3Southern 雜交
[0038]I)預(yù)熱適量的DIG Easy Hyb (IOmL / IOOcm2膜），溫度37~42°C，將膜放在干凈的雜交管中，在雜交爐中預(yù)雜交膜30min。
[0039]2)變性DIG標(biāo)記的探針，100°C水浴5min，然后快速置于冰浴中。注意DIG-11-dUTP 是堿不穩(wěn)定性的，DNA探針不能用堿變性。
[0040]3)將變性的DIG標(biāo)記探針加到預(yù)熱的DIG Easy Hyb中，(3. 5mL / IOOcm2膜），并混合均勻，避免產(chǎn)生氣泡。
[0041]4)倒出預(yù)雜交液，加入含探針的雜交液，溫育4h或過夜，并不停溫和轉(zhuǎn)動(dòng)。
5CN 103525859 A
書
明
說
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[0042]4 洗膜
[0043]I)用 2 X SSC 和 10% SDS 洗兩次，每次 5min，溫度 15 ~25°C。
[0044]2)用0. 5X SSC^PO. 10% SDS (預(yù)熱到?jīng)_洗溫度65~68°C )洗兩次，每次15min。
[0045]5 顯色
[0046]I)雜交及嚴(yán)格的洗膜之后,用Washing buffer沖洗膜I~5min。
[0047]2)在 10OmT, Blocking solution 中，溫育 30min。
[0048]3)在 2OmL Antibody solution 中，溫育 30min。
[0049]4)用 10OmT, Washing buffer 沖洗膜兩次，每次 15min。
[0050]5)在 20mL Detection buffer 中平衡 2 ~5min。
[0051]6)在IOmL Color substrate solution(現(xiàn)用現(xiàn)配）中顯色雜交膜,避光顯色,顯色過程不要晃動(dòng)。
[0052]7)當(dāng)期望的點(diǎn)或帶的強(qiáng)度出現(xiàn)時(shí)，終止反應(yīng),用50mL滅菌的ddH20或TE-buffer 洗膜，5min以終止反應(yīng)，記錄結(jié)果并照相（圖I)。
[0053]結(jié)果統(tǒng)計(jì)：利用日本晴BAC文庫（AGI)，使用探針RCS1、RCS2篩選含有中心粒的陽性克隆，共獲得了 50個(gè)陽性克?。ū?)(信號(hào)較弱的已刪除）。
[0054]表1Centromeric BACs(BAC-C1-50)
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種構(gòu)建水稻人工染色體的方法，其特征在于該方法的下面幾個(gè)步驟：A :正反向端粒序列裝載至篩選標(biāo)記基因兩側(cè)；B :選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因的融合表達(dá)載體構(gòu)建；C ：Tn5-Transposon DNA 的獲得D :應(yīng)用轉(zhuǎn)座子插入法將Tn5-Transposon DNA插入到含有中心粒的BAC克隆中。
2.表1所述BAC克隆在水稻人工微染色體構(gòu)建中的應(yīng)用。
3.含有序列表中序列I所示DNA的正反向重組載體在水稻人工微染色體構(gòu)建中的應(yīng)用。
4.應(yīng)用權(quán)利I技術(shù)方法構(gòu)建的水稻人工微染色體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3中構(gòu)建的水稻人工微染色體研究中心粒、端粒等的行為和功能。
6.根據(jù)權(quán)利要求3中構(gòu)建的水稻人工微染色體，在其DNA序列中插入目的基因、報(bào)告基因等功能兀件。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103525859SQ201310465888
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】傅彬英, 黃立鈺, 王文生, 黎志康 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所