一種包含ERβ的重組病毒的改造方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含ERβ的重組病毒的改造方法，其包含病毒載體以及選自如下的基因構(gòu)建體：1）人ERβ基因或其功能片段基因，或其簡并性序列；和2）含有人ERβ基因或其功能性片段基因，或其簡并性序列的嵌合基因。本發(fā)明還涉及人ERβ基因或其功能性片段基因的基因構(gòu)建體用于制備人乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病基因治療的藥物及對該基因治療藥物進行改造得到的具有靶向性的基因治療藥物。本發(fā)明還涉及一種利用所述重組病毒或其改造物進行乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病的靶向基因治療的方法。
【專利說明】—種包含ERP的重組病毒的改造方法及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及哺乳動物乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌腫瘤疾病的基因治療領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】
[0003]乳腺癌是一種嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位,近年來發(fā)病率呈直線上升并呈低齡趨勢,大中城市尤為突出，已成為城市女性的第一殺手。從病理學(xué)角度，乳腺癌是一種異質(zhì)性腫瘤，在組織形態(tài)、免疫表型、生物學(xué)行為及治療反應(yīng)上存在著極大的差異。2004年Nielsen等提出了三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)的概念。三陰性乳腺癌是指雌激素受體α(estrogen receptor, ER α ),孕激素受體(progesterone receptor, PR)與人表皮生長因子受體 2 (human epidermal growth factorreceptor-2, HER-2)均陰性的乳腺癌，具有獨特的生物學(xué)行為及臨床病理特征，占全部乳腺癌總數(shù)的10%~15%，具有惡性程度高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移快、對內(nèi)分泌治療不敏感、需要化療、預(yù)后差、死亡率高等特點，目前國內(nèi)外仍缺乏針對這類特殊類型乳腺癌的有效治療手段。大量研究證實，ERa表達與乳腺癌細胞的分化程度、惡性程度、轉(zhuǎn)移部位密切相關(guān)，現(xiàn)已公認為乳腺癌分類、評估預(yù)后、指導(dǎo)內(nèi)分泌治療的重要指標。ERa陽性乳腺癌中，60%的患者對他旲昔分術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療有效,40 %的患者對內(nèi)分泌治療原發(fā)抗拒；而ERa陰性乳腺癌中，只有10%的患者對內(nèi)分泌治療有效。且ERa陰性的病人術(shù)后易有復(fù)發(fā)，不論淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移，ERa陰性者預(yù)后較陽性者差。
[0004]ER^是1996年瑞典的Kuiper等在研究孤兒核受體時，從鼠前列腺癌細胞cDNA文庫中首先發(fā)現(xiàn)的一種雌激素受體新亞型，與ERa同屬于核受體超家族成員，但在基因、結(jié)構(gòu)、功能、作用機制、分布等方面均有不同，對雌激素靶器官和組織的生理、病理產(chǎn)生不同的影響。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ER^·可通過多種機制產(chǎn)生抑瘤作用，具有對抗乳腺癌發(fā)展的保護性作用，可能成為一個腫瘤抑制基因。通過轉(zhuǎn)染在ERa陽性乳腺癌細胞系MCF-7、T47D和ERa陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231、SK-BR-3中表達ERP可改變C_myc、細胞周期蛋白A、Dl和Cdk2、p21wafl/cipl、p27kipl、FasL等相關(guān)蛋白因子的表達，引起細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，從而顯著抑制腫瘤細胞的生長，降低腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移能力，并抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的形成。此外，通過轉(zhuǎn)染在乳腺癌細胞中表達ERi3還可引起血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(TOGFP)表達下調(diào)，減少微血管密度，顯著抑制腫瘤血管發(fā)生，協(xié)同其抑制腫瘤細胞生長的作用，可進一步提高體內(nèi)抑瘤效果。因此，向腫瘤細胞中導(dǎo)入ER3基因并表達可通過多種機制產(chǎn)生顯著的抑瘤效果。
[0005]基因治療是近年來興起的一種治療腫瘤的新方法。所謂基因治療是指運用分子生物學(xué)方法，將具有治療作用的目的基因?qū)胫涟屑毎?，賦予或增加其某種功能，從而達到治療疾病的目的。腫瘤是一種多基因參與的分子疾病，基因治療或許可為ERa陰性乳腺癌的治療提供一較為有效的治療策略。腺病毒載體具有高效低毒、容量大、易于分離等優(yōu)點而成為基因治療中應(yīng)用最為廣泛的載體。目前世界上進入III期臨床試驗的基因治療制品有80%是采用腺病毒載體。與逆轉(zhuǎn)錄病毒家族載體不同，腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是非整合型的，以附加體的形式存在，不隨宿主細胞分裂而復(fù)制，是典型的一過性表達載體，因此它安全性高、致瘤性低。
[0006]近年來，已經(jīng)有大量的熒光材料被開發(fā)出來作為熒光生物成像的探針，包括:熒光蛋白、有機染料、金屬復(fù)合物以及半導(dǎo)體量子點。這些傳統(tǒng)的熒光染料一般都是基于單光子激發(fā)，由高能量的光激發(fā)出低能量的熒光。這些單光子激發(fā)染料存在以下缺點:(i)長時間的暴露在高能量的激發(fā)光下會造成生物體的DNA損傷和細胞死亡；(ii)來自生物組織的毛發(fā)、血液、組織和皮膚產(chǎn)生的本底熒光使得生物探針的信噪比很低；(iii)對生物組織的穿透能力低。稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子(UCNPs)是以無機基質(zhì)為主體，鑭系摻雜元素為客體，且摻雜元素嵌入主體晶格的內(nèi)部而合成的納米晶。
[0007]這種性能獨特的UCNPs在做生物標記成像時具有獨特的優(yōu)勢:發(fā)射峰窄；發(fā)光易調(diào)控；光學(xué)穩(wěn)定性好；壽命長；毒性低；對組織損傷小；組織穿透性強；降低本底輻射干擾。UCNPs能夠?qū)⑦B續(xù)吸收的兩個或多個泵浦光子轉(zhuǎn)換成短波長輻射，實現(xiàn)上轉(zhuǎn)換過程。
[0008]在含有摻雜元素的客體中，又存在敏化劑-活化劑體系，敏化劑(如Yb3+)首先接收近紅外光(NIR)，又通過非輻射能量傳遞，將能量傳遞給活化劑(如Er3+，Tm3+)，使其躍遷到更高的能級，最終活化劑以輻射的形式釋放出能量，發(fā)射出可見光。目前，氟化物化學(xué)性能穩(wěn)定，聲子能量低(~350CHT1)，發(fā)光效率較高，成為最常用的基質(zhì)。在980nm近紅外光下，以NaYF4作為基質(zhì)，吸收橫截面較大的Yb3+作為敏化劑，Er3+、Tm3+等稀土元素作為活化劑所合成UCNPs，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。最近已經(jīng)有研究報道了 UCNPs在生物成像和藥物研究中的一些新的應(yīng)用。因此，UCNPs已經(jīng)成為了一類新型的生物成像標記染料。本項目首次制備出激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均在近紅外區(qū)的具有腫瘤靶向性及治療作用的上轉(zhuǎn)換納米熒光探針FA-Ad5-ER β -UCNP,并將其導(dǎo)入乳腺腫瘤細胞MDA-MB-231中，體外實驗考察其對ERa陰性乳腺癌細胞的靶向基因治療作用，并對其抑瘤機制進行系統(tǒng)的研究。另外，借助雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡體外監(jiān)測以實時優(yōu)化感染效率，為后期將探針應(yīng)用于深層腫瘤組織的診斷和監(jiān)控治療研究提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0009](I)上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ERP -UCNP的構(gòu)建及表征
[0010]對重組腺病毒進行葉酸修飾，形成葉酸-重組腺病毒(FA-Ad5-ER β )。用溶劑熱法合成(^-此冊(似￥?4:￥13，1'111)后，采用聚丙烯酸(PAA)進行配體交換反應(yīng)，對共摻雜了 Yb，Tm的NaYF4納米晶體粒子進行了有效的表面修飾，形成上轉(zhuǎn)換熒光納米探針(PAA-UCNPs)。利用PAA上的羧基和葉酸修飾的重組腺病毒(FA-Ad5-ERi3 )上的氨基進行反應(yīng)，構(gòu)建激發(fā)和發(fā)射均在近紅外區(qū)的上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ERi3 -UCNP。
[0011]重組腺病毒包括腺病毒載體及如下的基因構(gòu)建體
[0012]I)人ERi3基因，或其簡并性序列；和
[0013]2)人ERi3基因功能性片段ERP-DBDmut或其簡并性序列的嵌合基因。
[0014](2)考察FA-Ad5-ERP-UCNP對ERa陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的作用及機制研
究
[0015]FA-Ad5-ERP-UCNP體外感染ERP低表達、ERa陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231，通過雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡檢測熒光陽性細胞百分率以優(yōu)化感染條件，提高病毒感染效率。并用顯微鏡進行熒光成像分析，考察藥物的靶向性。進一步，通過藥理學(xué)檢測手段，研究轉(zhuǎn)染ERβ基因的乳腺癌細胞的生長情況，如細胞增值、運動能力、細胞周期以及細胞凋亡，以探索ERi3的抑瘤效率及作用機制。并進一步用實時定量PCR和Western Blot的方法考察腫瘤微血管密度、細胞周期、細胞凋亡相關(guān)的基因表達，以探索其抑瘤機制。
[0016](3)FA-Ad5-ERP-UCNP介導(dǎo)ERP基因靶向診斷和治療ERa陰性乳腺癌
[0017]將MDA-MB-231乳腺癌細胞接種于裸鼠腋窩皮下，建立人乳腺癌細胞移植瘤裸鼠模型。以PBS為空白對照，F(xiàn)A-Ad5-UCNP為空載體對照，F(xiàn)A-Ad5_ERβ -UCNP為實驗組，尾靜脈注射給藥。通過上轉(zhuǎn)換熒光在體成像系統(tǒng)實時在位監(jiān)測ERi3基因的表達，考察FA-Ad5-ERi3-UCNP的感染效率。不斷優(yōu)化給藥方案，提高腫瘤感染效率。同時，利用該系統(tǒng)實時在位跟蹤考察FA-Ad5-ERi3 -UCNP對腫瘤的靶向診斷作用，跟蹤腫瘤的生長狀態(tài)以考察治療效果。進一步用藥理學(xué)和細胞生物學(xué)以及免疫組化等常規(guī)方法考察腫瘤微血管密度、細胞周期、細胞凋亡以及與之相關(guān)的基因表達，以探索其抑瘤機制。
[0018]上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標記的靶向基因治療藥物FA-Ad5_ERi3 -UCNP用途:用于制備針對哺乳動物腫瘤疾病的靶向基因治療藥物的疫苗。人的乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌均可治療。
[0019]本發(fā)明的技術(shù)摘要如圖3所示。
[0020]有益效果:
[0021](1)首次將ERi3基因?qū)牖铙w腫瘤模型中，考察其對ERa陰性乳腺癌的抑制生長作用，并對其抑瘤機制進行系統(tǒng)的研究。
[0022](2)目前，大多數(shù)基因治療的給藥方案都是瘤內(nèi)注射，這限制了基因治療方法應(yīng)用于一些深層腫瘤的治療。本項目利用葉酸的靶向作用，通過靜脈注射給藥，實現(xiàn)對三陰性乳腺癌的靶向基因治療。
[0023](3)傳統(tǒng)的基因治療方法存在轉(zhuǎn)染效率低下，轉(zhuǎn)染效率及治療結(jié)果要等到后期的藥理學(xué)實驗結(jié)束之后才能獲知的缺陷。本項目借助上轉(zhuǎn)換納米熒光探針在體成像系統(tǒng)無損實時在位監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染范圍、腫瘤組織血氧等以實時優(yōu)化治療方案，并實現(xiàn)對深層腫瘤組織的診斷和監(jiān)控治療。
[0024]【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖LpAdxs1-ERP重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；
[0026]圖2FA-Ad5_ERβ -UCNP 構(gòu)建的流程圖；
[0027]圖3本發(fā)明的技術(shù)摘要附圖。
【具體實施方式】
[0028]實施例1上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標記的靶向基因治療藥物FA-Ad5_ERi3 -UCNP的構(gòu)建及表征
[0029]對重組腺病毒進行葉酸修飾，形成葉酸-重組腺病毒(FA-Ad5_ERi3 )。用紫外可見分光光度計分別對FA、Ad5和FA-Ad5-ERi3進行光吸收分析，以確認是否成功構(gòu)建FA-Ad5-ER0。并用SDS-PAGE法確定FA是否成功地連接到了 Ad5-ER0上。
[0030]用溶劑熱法合成OA-UCNP (NaYF4: Yb，Tm),并用高分辨透射電子顯微鏡(HR-TEM)、能量彌散X射線分析(EDXA)、X射線衍射(XRD)對其形貌、粒徑、組成及晶相結(jié)構(gòu)進行分析。采用聚丙烯酸(PAA)進行配體交換反應(yīng)，對共摻雜了 Yb，Tm的NaYF4納米晶體粒子進行了有效的表面修飾，形成上轉(zhuǎn)換熒光納米探針(PAA-UCNPs)，并用同樣的方法進行分析。利用PAA上的羧基和葉酸修飾的重組腺病毒(FA-Ad5-ERi3 )上的氨基進行反應(yīng)，構(gòu)建了上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ER0 -UCNP。用TEM對FA-Ad5_ERβ -UCNP進行分析，以確認是否成功構(gòu)建FA-Ad5-ER0 -UCNP，如圖2所示。并用980nm激發(fā)對其上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜進行分析。
[0031]具體實驗方法，如圖1所示:
[0032]A.葉酸(FA)的活化。
[0033]①稱取22mg FA溶于3ml DMSO中，再加入15.47mg 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與
15.3mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，待溶解后添加0.05ml三乙醇胺(TEA)。
[0034]②置于水浴中40度過夜。
[0035]③4000rpm離心2O分鐘
[0036]④取Iml上清液加入4ml丙酮及2~3滴氨水，至析出FA晶體。
[0037]⑤將丙酮吹干得到FA晶體，溶于Iml Tris0
[0038]B.葉酸(FA)修飾重組腺病毒。
[0039]活化后的FAlml加入Iml重組腺病毒(Ad5_ER β )(濃度為2 X 108pfu/ml)中，4度反應(yīng)4小時,形成葉酸-重組腺病毒(FA-Ad5-ER3 )。
[0040]C.Sephadex G25柱層析分離純化葉酸-重組腺病毒(FA-Ad5_ER β )。
[0041]D.0A-UCNP (NaYF4:Yb, Tm)的制備。
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種包含ERi3的重組病毒的改造方法，其特征在于，對重組腺病毒進行葉酸修飾，形成葉酸-重組腺病毒，用溶劑熱法合成OA-UCNP (NaYF4:Yb, Tm)后，采用聚丙烯酸(PAA)進行配體交換反應(yīng)，對共摻雜了 Yb，Tm的NaYF4納米晶體粒子進行了有效的表面修飾，形成上轉(zhuǎn)換熒光納米探針(PAA-UCNPs);利用PAA上的羧基和葉酸修飾的重組腺病毒(FA-Ad5-ERi3 )上的氨基進行反應(yīng)，構(gòu)建激發(fā)和發(fā)射均在近紅外區(qū)的上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ER0 -UCNP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包含ERβ的重組病毒的改造方法，其特征在于，重組腺病毒包括腺病毒載體及如下的基因構(gòu)建體 1)人ERi3基因，或其簡并性序列；和 2)人ERi3基因功能性片段ERP-DBDmut或其簡并性序列的嵌合基因。
3.權(quán)利要求1或2中上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ERi3-UCNP的應(yīng)用，其特征在于，用于制備針對哺乳動物腫瘤疾病的靶向基因治療藥物的疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ER^-UCNP的應(yīng)用，其特征在于，其中所述哺乳動物是人。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的上轉(zhuǎn)換納米熒光粒子標記的靶向基因治療藥物FA-Ad5-ERi3 -UCNP的應(yīng)用，其特征在于，其中所述腫瘤類型為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌。
【文檔編號】C12N15/861GK103623428SQ201310466728
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】涂真珍 申請人:南京郵電大學(xué)