用于檢測生物材料的系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測生物材料的系統(tǒng)和方法。涉及一種通過采用捕獲試劑和探針來鑒別目標(biāo)生物材料的方法。每種捕獲試劑對于一種目標(biāo)是特異性的。每種探針被設(shè)計成辨別目標(biāo)的類型。捕獲試劑和探針均被一種或多種可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記。
【專利說明】用于檢測生物材料的系統(tǒng)和方法
[0001]相關(guān)申請的交叉參考
[0002]本申請要求享有于2012年8月21曰提交的美國臨時申請N0.61/691，541的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過參考并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003]隨著生物工程技術(shù)的進(jìn)展，能夠通過檢測病變細(xì)胞、病原體基因或者突變基因的存在來診斷疾病和健康狀況。對于一些疾病，檢測突變基因的存在不僅對于診斷目的是有用的，而且對于確定治療方案以及預(yù)后同樣是頗有價值的。例如，檢測細(xì)胞色素P450 (CYP)基因和維生素K環(huán)氧化物還原酶I (VKORl)基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)能夠用于確定患者的華法林(warfarin)劑量。在個性化醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，檢測臨床相關(guān)的突變可用于指導(dǎo)制定革巴向治療方案。
[0004]臨床上的分子診斷化驗(yàn)經(jīng)常是耗時的，并且需要復(fù)雜的步驟，包括純化、分離和擴(kuò)增。因此，需要用于簡單、快速且準(zhǔn)確地檢測核酸分子以及其它生物材料的方法和平臺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了一種簡單并且快速的平臺，該平臺采用數(shù)字圖像分析來檢測并確定生物材料的類型。
[0006]因此，本文描述了一種鑒別生物材料的方法。所述方法包括:
[0007]提供含有生物材料的樣品，其中，生物材料具有種類(kind)和類型(type);將一種或多種捕獲試劑(capture)和一種或多種探針添加到樣品中，每種捕獲試劑和每種探針被一種或多種可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記，其中，每種捕獲試劑對于生物材料的一個種類(a kindofbiological material)是特異性的，以及每種探針對于生物材料的一個類型(a typeofbiological material)是特異性的,而且一種或多種捕獲試劑通過它們的可檢測的標(biāo)記物是可相互辨識(區(qū)分)的，并且一種或多種探針通過它們的可檢測的標(biāo)記物是可相互辨識(區(qū)分)的，由此可檢測的標(biāo)記物的組合對一種和一類生物材料進(jìn)行鑒別；
[0008]允許一種或多種捕獲試劑和一種或多種探針結(jié)合至生物材料；并且
[0009]測定結(jié)合至生物材料的可檢測的標(biāo)記物，由此對生物材料的種類和類型進(jìn)行鑒別。
[0010]待檢測的生物材料可以例如是核酸分子、多肽、細(xì)胞、脂類、糖脂(glycolipid)、組織或生物體(organism)。感興趣的生物材料的種類可以是特定的基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞或者生物物種。生物材料的類型可以是基因型、血清型、單核苷酸多態(tài)性(SNP)或SNP的組合、突變或突變的組合、核酸序列或者生物物種的類型或亞型。
[0011]在下面的附圖和描述中闡明了本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方式的細(xì)節(jié)。通過描述和附圖以及權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢將會是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】[0012]圖1為示例性的核酸捕獲試劑和探針的示意圖。
[0013]圖2為示例性的核酸檢測的示意圖。
[0014]圖3為一組圖像,示出了華法林基因分型檢測(warfarin genotyping test)的結(jié)果O
[0015]圖4的顯微照片(50倍放大)示出了采用乳液PCR(emulsion PCR)擴(kuò)增前的血液樣品、裂解緩沖液和P CR緩沖液的混合物，其中，油包裹的熒光染料和核酸(oil-encapsulated fluorescent dye and nucleic acid)存在于白色部分，并且凝膠狀的材料和背景存在于黑色部分；以及
[0016]圖5的顯微照片(20倍放大)示出了采用乳液PCR擴(kuò)增的混合物，其中，目標(biāo)I代表DNA-探針-Cy3，目標(biāo)2代表采用探針l_Cy5標(biāo)記的DNA-探針_Cy5。NC(陽性對照)代表采用FAM染料標(biāo)記的油相，并且
[0017]WL代表白光下的狀態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本文描述了一種用于簡單并且快速地檢測生物材料的方法。該方法能夠用于分析樣品的類型、數(shù)量、強(qiáng)度以及其它物理的、化學(xué)的、生物的特征。例如，該方法能夠用于測定生物物種(organism secies)、基因型、血清型以及核酸序列。該方法的應(yīng)用包括分子學(xué)的和免疫學(xué)的診斷檢測以及 核酸測序。
[0019]普通的方法論
[0020]本方法利用了捕獲試劑和探針。每種捕獲試劑對于目標(biāo)的一個種類(例如，特定的基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞或者病原體)是特異性的。每種探針被設(shè)計成辨別目標(biāo)的類型(例如，基因型、SNP或血清型)。
[0021]捕獲試劑和探針各自包含結(jié)合至感興趣的生物材料(例如核酸、多肽、脂類、糖脂、細(xì)胞、組織、病原體或生物體)的結(jié)合部分(bindmg moiety)。有用的結(jié)合部分包括核酸、抗體、抗體片段、抗體樣分子(antibody-like molecule)(例如，親和體分子(aff ibody molecule)、affilin、affitin、anticalin 和高親和性多聚體(avimer))、類妝物(peptidomimetic)、蛋白質(zhì)、肽、融合蛋白質(zhì)、受體、配體、DNA-蛋白質(zhì)雜交體、DNA-RNA雜交體以及RNA-蛋白質(zhì)雜交體。通過改變捕獲試劑和探針使它們特異性地識別并結(jié)合感興趣的生物材料，所述方法適合于檢測任何生物材料。
[0022]捕獲試劑和探針均被一種或多種可檢測的標(biāo)記物例如發(fā)色團(tuán)(chromophore)和突光標(biāo)記物標(biāo)記。通過唯一的、預(yù)定義的顏色代碼(unique pre-defined color code)鑒別目標(biāo)生物材料的種類和類型，顏色代碼為與特定的捕獲試劑和特定的探針相關(guān)的可檢測的標(biāo)記物的組合。
[0023]可檢測的標(biāo)記物在本領(lǐng)域是公知的?？蓹z測的標(biāo)記物的實(shí)例包括量子點(diǎn)、同位素標(biāo)記物(例如，放射性或重金屬同位素)、磁性標(biāo)記物、自旋標(biāo)記物、電子標(biāo)記物、熱標(biāo)記物、有色標(biāo)記物(例如，發(fā)色團(tuán)和熒光標(biāo)記物)、發(fā)光標(biāo)記物(例如，熒光劑和化學(xué)發(fā)光試劑)、酶標(biāo)記物(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、熒光素酶和半乳糖苷酶)、抗體標(biāo)記物以及可化學(xué)修飾的標(biāo)記物(例如，熒光標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物、生物發(fā)光標(biāo)記物、染料和酶)?？蓹z測的標(biāo)記物包括那些能夠通過任何光源例如可見光、熒光、發(fā)光、LED、紫外(UV)或激光或者其組合而可視化的物質(zhì)。熒光標(biāo)記物的實(shí)例包括熒光素、羅丹明、熒光黃、德克薩斯紅、Alexa-Fluor 染料、Cy3> Cy5> Cy5.5 和 Cy7。
[0024]如果一組捕獲試劑包括總共η種不同的顏色，并且一組探針包括總共m種不同的顏色，則捕獲試劑組和探針組一起能夠用于辨別(2n-l)x(2m-l)個類型的生物材料。因此，本文描述的方法能夠采用顏色的排列和組合的方式使被辨別(區(qū)分)的生物材料種類的數(shù)量和生物材料類型的數(shù)量最大化。
[0025]為了鑒別目標(biāo)生物材料的種類和類型，將懷疑含有感興趣的目標(biāo)的檢測樣品與對目標(biāo)(例如，特定的基因)特異的捕獲試劑以及對目標(biāo)一個或多個類型(例如，基因突變或SNP)特異的一種或多種探針混合。通過測定與在檢測中使用的捕獲試劑和探針有關(guān)的可檢測的標(biāo)記物的顏色來鑒別捕獲試劑-探針-目標(biāo)復(fù)合物。例如，采用熒光顯微鏡對捕獲試劑-探針-目標(biāo)復(fù)合物進(jìn)行成像。每種顏色獨(dú)立地被可視化以獲得圖像。將這樣獲得的圖像進(jìn)行數(shù)字編輯和分析以鑒別存在的顏色以及顏色信號的強(qiáng)度。由此確定了指示目標(biāo)的種類和/或類型的顏色代碼。在檢測中典型地包括陽性和陰性對照。應(yīng)當(dāng)將從圖像分析中獲得的等于或大于陽性對照的信號強(qiáng)度視為陽性信號。
[0026]適合的成像系統(tǒng)可從市場上購買。可采用常規(guī)的方法或軟件例如ImageJ進(jìn)行圖像分析。
[0027]在本方法中使用的檢測樣品可以來自于任何來源，該來源包含或者懷疑包含感興趣的生物材料。例如，樣品可得自有生命的生物體(例如，人、動物、植物、細(xì)菌、真菌、原生生物以及病毒)或者環(huán)境來源(例如，水或土壤)。樣品可以是體液，諸如血漿、血清、唾液、全血、精液或尿液，或者是固態(tài)樣品(例如，組織、細(xì)胞顆粒、活檢組織以及排泄物)。感興趣的生物材料可以首先從樣品中分離或從樣品中部分分離。生物材料也可以被富集或濃縮，諸如通過分子大小色譜柱(molecular sizing column)、過濾或離心。
[0028]優(yōu)選地，捕獲試劑包括小固體顆粒(例如，珠子)以方便從未結(jié)合的捕獲試劑、探針和目標(biāo)中分離并且鑒別出 捕獲試劑-探針-目標(biāo)復(fù)合物。任何類型的小固體顆粒，例如能夠結(jié)合至生物分子的小的合成顆?；蛭⑶?，都能夠用在本文的方法中。由各種材料構(gòu)成的小固體顆粒(例如，塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、順磁性材料、石墨狀碳、二氧化鈦、乳膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、蛋白質(zhì)聚合物、尼龍、生物素、鏈霉親和素和聚四氟乙烯)在本領(lǐng)域是已知的并且可從市場上購買。適當(dāng)?shù)念w粒直徑范圍可以是從約0.2 μ m至約200 μ m(例如，I~3 μ m)。
[0029]將生物分子(例如，核酸、蛋白質(zhì)和抗體)結(jié)合至固體顆粒的方法在本領(lǐng)域是已知的。生物分子可以直接地或者經(jīng)由接頭(linker)間接地連接至固體顆粒。
[0030]可采用本領(lǐng)域已知的方法例如洗滌和離心來分離捕獲試劑-探針-目標(biāo)復(fù)合物。如果使用了生物素珠子或鏈霉親和素珠子，則可以使用鏈霉親和素或生物素柱或免疫沉淀反應(yīng)。如果使用了磁珠，則磁性裝置可用于分離復(fù)合物。雙向電泳裝置可用于分離具有不同物質(zhì)和尺寸的磁珠。例如參見 Medoro, G ;Manaresi, N.；Leonardi, A.；Altomare, L.；Tartagni, M.；Guerrieri, R.A Lab-on—a—Chip for CellDetection and Manipulation.1EEE Sensors Journal，2003，3，317-325 ;以及美國專利 N0.7，682，827。
[0031]本文描述的方法能夠用于寬泛的多種目的。例如，該方法能夠用于診斷基因疾病(或者因此患者的或受試者的風(fēng)險)、鑒別包含在目標(biāo)基因內(nèi)的外源序列(例如，病毒序列)，或者用于檢測傳染病、傳染性生物體或病原體。
[0032]術(shù)語“受試者”指動物或人，包括但不局限于例如靈長類的哺乳動物、豬、嚙齒動物，諸如老鼠和田鼠、兔、豚鼠、倉鼠、牛、馬、貓、狗、綿羊和山羊。
[0033]本方法能夠在現(xiàn)場實(shí)施或者在遠(yuǎn)離現(xiàn)場的裝備內(nèi)實(shí)施。采用本方法獲得的數(shù)據(jù)、圖像和結(jié)果可以在手持式裝置例如智能電話、移動裝置或者平板電腦上被加載、分析和可視化。
[0034]核酸檢測[0035]本方法能夠用于檢測并且鑒別核酸，例如DNA、RNA、mRNA以及cDNA。例如，本方法能夠用于檢測基因標(biāo)記物、等位基因、突變或SNP的存在。
[0036]在核酸檢測中，捕獲試劑可以包括核酸分子，例如單鏈核酸，其具有與目標(biāo)核酸(例如，基因)內(nèi)的第一目標(biāo)序列互補(bǔ)的捕獲序列(capture sequence)(例如,30至100個或者30至60個核苷酸)。第一目標(biāo)序列不包含任何感興趣的SNP或突變。換句話說，捕獲試劑被設(shè)計成“捕獲”即結(jié)合特定的目標(biāo)核酸，而不是檢測目標(biāo)內(nèi)的任何特定的基因標(biāo)記物。捕獲試劑被一種或多種可檢測的標(biāo)記物例如有色標(biāo)記物標(biāo)記。在同時檢測多個目標(biāo)核酸的檢測或者檢測樣品內(nèi)是否存在許多目標(biāo)之一的檢測中，采用了各自對目標(biāo)核酸具有特異性的多種捕獲試劑。每種不同的捕獲試劑被不同的可檢測的標(biāo)記物或者可檢測的標(biāo)記物的組合所標(biāo)記。
[0037]探針包含核酸分子，其具有與目標(biāo)核酸內(nèi)的第二目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針序列(例如，30至100個或者30至60個核苷酸)。第二目標(biāo)序列包括一種或多種感興趣的鑒別特征(identifying feature ofinsterest),例如SNP、突變、用于疾病的基因標(biāo)志物或者任何基因改變。探針同樣被一種或多種可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記。在設(shè)計成檢測多個基因改變或特征的檢測中或者檢測是否存在許多特征之一的檢測中，采用了不同的探針，每種探針被不同的可檢測的標(biāo)記物或者可檢測的標(biāo)記物的組合所標(biāo)記。
[0038]例如，如圖1所示，多個捕獲試劑和探針被設(shè)計成同時檢測三種不同目標(biāo)基因中的SNP (箭頭指示的位置)。捕獲試劑1、捕獲試劑2和捕獲試劑3中的每一個均與不同的有色珠子(即R、Y或G-有色珠子)結(jié)合，并且具有的核酸序列分別與目標(biāo)1、目標(biāo)2或目標(biāo)3的一部分互補(bǔ)。對于每個目標(biāo)，產(chǎn)生了這樣的探針，每個探針均具有與包含特定SNP(例如，SNPl-1或2-1)的部分互補(bǔ)的序列。每種不同的探針被不同的熒光標(biāo)記物(即a，b)標(biāo)記。因此，通過專門預(yù)定的顏色代碼例如Ra、Ya或Gb來表示每個SNP。
[0039]熟練的從業(yè)者將意識到以上實(shí)例僅為解釋說明性的，并且能夠針對不同的應(yīng)用來設(shè)計捕獲試劑和探針。取決于檢測，不同的探針能夠共用一些可檢測的標(biāo)記物，只要能夠區(qū)分不同的目標(biāo)即可。
[0040]圖2示出了示例性的核酸檢測的概況。在步驟I中，在試管中將血液樣品與裂解緩沖液混合以釋放細(xì)胞內(nèi)容物。在步驟2中，將捕獲試劑、探針、用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸的引物以及PCR試劑添加到同一試管中。在同一試管中進(jìn)行PCR。當(dāng)PCR反應(yīng)完成時，使捕獲試劑、探針和被擴(kuò)增的目標(biāo)核酸在同一試管中雜交。在步驟3中，清洗試管。捕獲試劑-探針-目標(biāo)復(fù)合物保留在試管內(nèi)。在步驟4中，對來自試管的樣品進(jìn)行圖像分析。
[0041]如本文所提到的，與核酸的一部分“互補(bǔ)的”序列指具有能夠與核酸雜交并形成穩(wěn)定的二聚體的充分互補(bǔ)性的序列。不需要捕獲試劑序列和探針序列分別與第一目標(biāo)序列和第二目標(biāo)序列具有絕對的互補(bǔ)性，盡管這是優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠基于預(yù)期目標(biāo)而設(shè)計適當(dāng)?shù)牟东@試劑和探針序列。
[0042]在適當(dāng)嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。所述嚴(yán)格的條件是公知的，并且將可預(yù)測地基于目標(biāo)、捕獲試劑和探針的特定序列而改變。
[0043]可采用乳化即采用油包水的液滴進(jìn)行以上描述的核酸檢測。通常，能夠產(chǎn)生微乳液，其中水相部分包含目標(biāo)核酸、捕獲試劑、探針和其它成分。PCR、雜交或其它反應(yīng)能夠采用乳液進(jìn)行。換句話說，乳液中的每個液滴均為微型反應(yīng)器。用于制作微乳液的方法是本領(lǐng)域已知的。例如參見 Williams 等人,Nature Methods,3(7):545-550 (2006)以及 Dressman等人，PNAS, 100 (15) 8817-8822 (2003)。
[0044]在當(dāng)前的方法中，制備了油-表面活性劑混合物(包含Span80、Tween80、TritonX-100、礦物油和染料)以及水溶液相(包含緩沖液、水、DNA模板、引物、DNA聚合酶、PCR試劑、捕獲試劑和探針)?？梢钥刂艱NA模板、探針和捕獲試劑的濃度以產(chǎn)生液滴，該液滴平均每個液滴包含預(yù)期數(shù)量的分子，例如，單個模板DNA分子，從而使得液滴中的單個模板克隆擴(kuò)增(clonal expansion)。將水溶液相緩曼地逐滴添加到油-表面活性劑混合物中，同時攪拌混合物。攪拌混合物直到形成乳液。乳液包括油包水的液滴，每個液滴均包含DNA模板、捕獲試劑和探針。乳液能夠被放置到PCR板的各個孔內(nèi)，并且能夠進(jìn)行PCR和雜交反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)完成后，等分乳液可以被放置到顯微鏡的載玻片上，并且進(jìn)行如上所描述的成像。
[0045]可以對乳液中使用的同一 DNA模板上進(jìn)行實(shí)時PCR，以驗(yàn)證從乳液的圖像分析中獲得的數(shù)據(jù)。此外，在完成乳液的圖像分析之后，可以分解具有陽性信號的乳液以分離捕獲試劑-探針-目標(biāo)復(fù)合物。參見Dressman等人(2003)，如上。可以對分離出的捕獲試劑-探針-目標(biāo)復(fù)合物進(jìn)一步進(jìn)行圖像分析，以證實(shí)從乳液的直接圖像分析中獲得的結(jié)果。
·[0046]熟練的從業(yè)者將意識到采用乳液時存在許多可能的構(gòu)型和設(shè)計。在一個實(shí)施方式中，可以制備這樣的乳液，其中，每種不同顏色的液滴包含不同的捕獲試劑-探針組合。在另外的實(shí)施方式中，相同的液滴可以均包含相同的捕獲試劑但不同的探針。例如，每個液滴/捕獲試劑能夠鑒別特定的HCV類型，并且不同的探針用于辨別HCV亞型。熟練的從業(yè)者同樣將知道包括適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ铡?br> [0047]試劑盒
[0048]本文包括用于實(shí)施上述任何方法的試劑盒。試劑盒可以包括一種或多種捕獲試劑以及一種或多種探針。試劑盒也可以包含另外的成分，諸如試劑、PCR引物和說明書。測序試劑盒也可以包括以上描述的固體載體或者測序芯片。
[0049]下面的具體實(shí)施例被解釋為僅是說明性的，并且無論如何絕非用于限制說明書的其余部分。無進(jìn)一步的詳盡細(xì)節(jié)，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于本文的描述將本發(fā)明利用到極致。本文引用的所有出版物的全部內(nèi)容通過參照并入本文。
[0050]實(shí)施例:華法林靈敏度基因分型(Warfarin Sensitivity Genotyping)
[0051]使用捕獲試劑和探針進(jìn)行華法林靈敏度基因分型。
[0052]下面的表1示出了生物素標(biāo)記的捕獲試劑、Texas Red或FAM標(biāo)記的對照以及Cy3或Cy5標(biāo)記的等位基因特異性探針的序列。
[0053]表1
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別生物材料的方法，該方法包括: 提供含有生物材料的樣品，其中生物材料具有種類和類型； 將一種或多種捕獲試劑和一種或多種探針添加到樣品中，每種捕獲試劑和每種探針被一種或多種可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記，其中，每種捕獲試劑對于生物材料的一個種類是特異性的，并且每種探針對于生物材料的一個類型是特異性的，且一種或多種捕獲試劑通過它們的可檢測的標(biāo)記物是可相互區(qū)別的，且一種或多種探針通過它們的可檢測的標(biāo)記物是可相互區(qū)別的，由此可檢測的標(biāo)記物的組合對生物材料的種類和類型進(jìn)行鑒別； 使一種或多種捕獲試劑和一種或多種探針結(jié)合至生物材料；以及 測定結(jié)合至生物材料的可檢測的標(biāo)記物，由此鑒別生物材料的種類和類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，可檢測的標(biāo)記物為有色標(biāo)記物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，一種或多種捕獲試劑包括總共η種不同的有色標(biāo)記物，以及一種或多種探針包括總共m種不同的有色標(biāo)記物，η和m均為等于或大于I的整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中，樣品為血液樣品、血清樣品、血漿樣品、尿液樣品、唾液樣品、組織樣品、細(xì)胞樣品、含有被擴(kuò)增過的核酸的樣品或者含有經(jīng)純化或經(jīng)部分純化的生物材料的樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，生物材料為核酸分子、組織或生物體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，種類是特定的基因或生物物種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述 的方法，其中，類型為基因型、單核苷酸多態(tài)性(SNP)或SNP的組合、突變或突變的組合、核酸序列或者生物物種的類型或亞型。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，有色標(biāo)記物中的每一種可采用可見光、熒光、發(fā)光、LED光、紫外光、激光或者它們的組合來檢測。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，一種或多種捕獲試劑和所述一種或多種探針共用X種有色標(biāo)記物，其中，X為等于或大于O并且小于n+m的整數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，通過對每個有色標(biāo)記物單獨(dú)成像以獲得n+m-x個獨(dú)立圖像而進(jìn)行測定步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，每種捕獲試劑包含經(jīng)一種或多種可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的小固體顆粒。
12.—種鑒別一種或多種目標(biāo)核酸的方法,該方法包括: 提供包含核酸分子的樣品； 將一種或多種捕獲試劑和一種或多種探針添加到所述樣品中，其中， (i)每種捕獲試劑被一種或多種可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記，從而使之可通過其可檢測的標(biāo)記物而與其它捕獲試劑區(qū)分，并且包含與目標(biāo)核酸中的第一目標(biāo)序列互補(bǔ)的捕獲核酸序列，以及 (ii)每種探針被一種或多種可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記，從而使之可通過其可檢測的標(biāo)記物而與其它探針區(qū)分，并且包含與目標(biāo)核酸中的第二目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針序列，第二目標(biāo)序列包括SNP、突變或野生型序列，并且每種探針對于SNP、突變或野生型序列是特異性的，由此可檢測的標(biāo)記物的組合對目標(biāo)核酸分子及其類型進(jìn)行鑒定，該類型為SNP、突變或野生型序列，或者它們的組合；使一種或多種捕獲試劑和一種或多種探針與核酸分子雜交； 分離各自含有目標(biāo)核酸、捕獲試劑和探針的復(fù)合物；并且 測定結(jié)合至被分離出的復(fù)合物的可檢測的標(biāo)記物，由此對一種或多種目標(biāo)核酸及其類型進(jìn)行鑒別。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，可檢測的標(biāo)記物為有色標(biāo)記物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，一種或多種捕獲試劑包括總共η種不同的顏色，并且一種或多種探針包括總共m種不同的顏色，η和m均為等于或大于I的整數(shù)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，一種或多種捕獲試劑和一種或多種探針共用X種有色標(biāo)記物，其中，X為等于或大于O并且小于n+m的整數(shù)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，通過單獨(dú)地對每種有色標(biāo)記物進(jìn)行成像以獲得n+m-x個獨(dú)立圖像而進(jìn)行測定步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，有色標(biāo)記物中的每一種可采用可見光、熒光、發(fā)光、LED光、紫外光、激光或者它們的組合來檢測。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，目標(biāo)核酸包括維生素K環(huán)氧化物還原酶基因或其片段和細(xì)胞色素P450基因或其片段，以及SNP包括與華法林靈敏度相關(guān)的SNP。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，每種捕獲試劑包含經(jīng)一種或多種可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的小固體顆粒。
20.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，在乳液中進(jìn)行雜交步驟。
【文檔編號】C12Q1/04GK103627793SQ201310469534
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月21日
【發(fā)明者】陳奕璋, 蔡秀娟 申請人:財團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院