南方根結(jié)線蟲食道腺特異基因Msp40及其編碼蛋白和其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種南方根結(jié)線蟲食道腺特異基因Msp40及其編碼蛋白和其作為潛在RNA干擾靶標基因的應(yīng)用。該Msp40基因編碼的蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)：1）序列表中的SEQ?ID?№.2的氨基酸殘基序列；2）將序列表中的SEQ?ID?№.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與線蟲致病力相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的編碼基因作為潛在的RNA干擾靶標基因，可用來制備dsRNA或RNA干擾載體，通過植物體內(nèi)及體外RNA干擾線蟲Msp40表達，從而顯降低線蟲致病力，同時也為抗線蟲轉(zhuǎn)基因植物的培育奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】南方根結(jié)線蟲食道腺特異基因Msp40及其編碼蛋白和其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一種南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)食道腺特異基因及其編碼蛋白和其作為潛在RNA干擾靶標基因的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)是一類固著型內(nèi)寄生植物病原線蟲。根結(jié)線蟲寄主范圍廣，適應(yīng)性強，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害嚴重，造成巨大經(jīng)濟損失。在我國以南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)分布最廣，危害最大，嚴重威脅我國南方露地及北方保護地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全。輪作及化學防治等傳統(tǒng)的線蟲防治方法，存在特異性差、副作用大、防效有限等突出問題。而RNA干擾作為一種新的防治策略及技術(shù)，為抗線蟲基因工程帶來新的突破。通過構(gòu)建RNA干擾載體，導入植物中表達線蟲寄生致病相關(guān)基因的雙鏈RNA (dsRNAs)或小干擾RNA(siRNAs)，經(jīng)口針取食進入線蟲體內(nèi)，引發(fā)系統(tǒng)性RNA干擾反應(yīng)，導致線蟲寄生、發(fā)育、代謝、運動等相關(guān)功能出現(xiàn)障礙甚至死亡，從而使轉(zhuǎn)基因植物實現(xiàn)對寄生線蟲的抗性。相關(guān)研究表明，食道腺在根結(jié)線蟲與寄主互作致病過程中發(fā)揮重要作用。多數(shù)推測的寄生致病相關(guān)基因均在線蟲食道腺表達，編碼產(chǎn)生分泌蛋白，再經(jīng)由口針穿刺和注射進入植物細胞內(nèi)，發(fā)揮寄生致病相關(guān)的復雜功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)食道腺特異基因Msp40及其編碼蛋白和其作為潛在RNA干擾靶標基因的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白，是如下(a)或(b):
[0005]Ca)由序列表中SEQ ID Na.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0006](b)將序列表中SEQ ID Na.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與線蟲致病力相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0007]上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0008]所述線蟲致病力的判斷指標具體為寄主單株根結(jié)數(shù)目或線蟲卵數(shù)。
[0009]編碼上述蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0010]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0011]編碼上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護的范圍。
[0012]上述基因為如下I) -4)中任一種的DNA分子:
[0013]I)序列表中SEQ ID Ns:1第75-1019位的核苷酸序列；
[0014]2)編碼序列表中SEQ ID Na:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；
[0015]3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID Ns:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
[0016]4)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0017]上述嚴格條件也可為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用
2X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0018]其中，序列表中SEQ ID Ns:1的核苷酸序列全長1217bp，第1-74位核苷酸為5’非翻譯區(qū)，第1023-1217位核苷酸為3’非翻譯區(qū)，第75-1019位核苷酸為開放閱讀框，編碼SEQ ID Na.2所示氨基酸序列，將該具有序列表中SEQ ID Na:1中第75-1019位的核苷酸序列的片段命名為Msp40。
[0019]含有下述I)或2)所述核酸片段的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或宿主菌也是本發(fā)明保護的范圍:
[0020]I)編碼所述蛋白 的核酸分子全長或其任意片段；所述核酸分子可以是DNA，也可以是RNA ；
[0021]2)所述的編碼基因全長或其任意片段。
[0022]上述重組載體具體為克隆載體、表達載體中或RNA干擾載體。
[0023]擴增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍。
[0024]本發(fā)明的另一個目的是提供一種dsRNA，所述dsRNA具有下述核苷酸序列之一:
[0025]I)序列表中SEQ ID Na:3所示的核苷酸序列；
[0026]2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID N2:3限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
[0027]3)與I)或2)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0028]本發(fā)明的還一個目的是提供一種RNA干擾載體，所述載體為將DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點中得到的；所述DNA片段為X正向一連接區(qū)一X反向；X正向為SEQ IDN0.1中第289-646位核苷酸所示，X反向為X正向的反向互補片段；
[0029]或所述載體為將DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點中得到的；所述DNA片段為Y正向一連接區(qū)一Y反向；Y正向為SEQ ID N0.1中第721-1013位核苷酸所示，Y反向為Y正向的反向互補片段。
[0030]所述X正向一連接區(qū)一X反向片段具有序列表中SEQ ID Ns.4所述的核苷酸序列；所述Y正向一連接區(qū)一Y反向片段具有序列表中SEQ ID Na.5所述的核苷酸序列。
[0031]所述出發(fā)載體具體為PCAMBIA3301。
[0032]具體的，所述RNA干擾載體由下述方法制備得到的:將具有SEQ ID Na:4或SEQ IDNa:5所示核苷酸序列的DNA片段連接入pCAMBIA3301載體骨架中即得。
[0033]具體的所述載體骨架將pCAMBIA3301載體經(jīng)Nco I和BstE II酶切后制得。
[0034]本發(fā)明的還一目的是提供所述蛋白、所述編碼核酸分子、所述編碼基因、所述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌、所述引物對、所述dsRNA、或所述的RNA干擾載體在如下I)-5)至少一種中的應(yīng)用:[0035]I)防治線蟲對植物的侵害；
[0036]2)降低線蟲的致病力或降低線蟲的侵染力；
[0037]3)制備具有線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物；
[0038]4)抑制靶基因的表達；
[0039]5)鑒定靶基因的功能；
[0040]所述祀基因為Msp40或其同族基因。
[0041]所述防治線蟲對植物的侵害具體指降低線蟲寄主植物的根結(jié)數(shù)。
[0042]所述降低線蟲的致病力具體指降低線蟲的卵數(shù)。
[0043]所述線蟲具體為南方根結(jié)線蟲。
[0044]所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。
[0045]本發(fā)明的又一個目的是提供一種制備具有線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將下述I)-4)任一核酸片段導入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物:
[0046]I)根據(jù)所述蛋白的編碼基因全長或其任意片段制備得到的dsRNA ；
[0047]2)所述的 dsRNA;
[0048]3)具有序列表中SEQ ID No:4所示核苷酸序列的核酸片段
[0049]4)具有序列表中SEQ ID No:5所示核苷酸序列的核酸片段
[0050]所述轉(zhuǎn)基因植物對線蟲的抗性強于所述目的植物。
[0051]所述I)-4)任一核酸片段是通過所述的重組載體導入目的植物；所述的重組載體具體為前述的RNA干擾載體。
[0052]所述轉(zhuǎn)基因植物對線蟲的抗性強于所述目的植物具體體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物被線蟲侵染后的單株根結(jié)數(shù)目少于所述目的植物。
[0053]所述線蟲具體為南方根結(jié)線蟲。
[0054]所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。
[0055]本發(fā)明的再一目的是提供一種降低線蟲的侵染力或致病力的方法，包括如下步驟:使出發(fā)線蟲食取權(quán)利要求6所述dsRNA，得到的目的線蟲的侵染力或致病力低于出發(fā)線蟲。
[0056]具體的，所述線蟲為南方根結(jié)線蟲。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1為FITC誘導南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲取食情況圖。
[0058]圖2為浸泡誘導南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲取食對線蟲活力影響情況圖。
[0059]圖3為體外干擾后南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲Msp40基因表達情況圖，以tubulin作為內(nèi)參基因。
[0060]圖4為體外干擾后南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲接種番茄與接種未干擾對照組產(chǎn)生根結(jié)數(shù)統(tǒng)計分析圖。
[0061]圖5為體外干擾后南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲接種番茄與接種未干擾對照組產(chǎn)生卵粒數(shù)統(tǒng)計分析圖。
[0062]圖6為TSlRNAi及TS2RNAi干擾載體構(gòu)建示意圖。
[0063]圖7為轉(zhuǎn)TSlRNAi與TS2RNAi擬南芥植株TSl、TS2與Col-O生態(tài)型WT接種南方根結(jié)線蟲后產(chǎn)生根結(jié)數(shù)統(tǒng)計分析圖。
[0064]圖8為轉(zhuǎn)TSlRNAi與TS2RNAi擬南芥植株TSl、TS2與Col-O生態(tài)型WT接種南方根結(jié)線蟲后產(chǎn)生卵粒數(shù)統(tǒng)計分析圖。
【具體實施方式】
[0065]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0066]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0067]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0068]實施例1、南方根結(jié)線蟲食道腺基因Msp40的獲得
[0069]取接種南方根結(jié)線蟲(報道過南方根結(jié)線蟲的文獻信息:殷友琴，楊寶君，王秋麗.根結(jié)線蟲病的病原鑒定[J].植物保護學報，1989，(03);公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得該南方根結(jié)線蟲。)45-60天的番茄根系，洗凈后挑取卵塊在無菌水中孵化3天，離心收集新鮮的二齡幼蟲約10-20yL。液氮冷凍,組織研磨器破碎樣品，用Trizol (InvitrogenWi提取總 RNA, Recombinant DNase I (Takara)消化基因組 DNA, Super ScriptTM III ReverseTranscriptase Kit (Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄得到南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲cDNA。以該cDNA為模板，以下列核苷酸序列為引物，進行PCR擴增:
[0070]上游引物Msp40cds_F2:5’ -GGTCATTCTTATAACTAAAAACCTTCAAAC-3，
[0071]下游引物Msp40cds_R2:5’ -GGAGGCATTTTTACTAAATTTCGA-3’
[0072]PCR 擴增體系為:dH2014.8μ L，5XHF PCR buffer5.0 μ L, 2.5mM dNTPs2.0 μ L，Msp40cds_F21.0 μ L, Msp40cds_R21.0 μ L, cDNAl.0 μ L, Phusion DNA polymerase (NEB)
0.2 μ L,總體系 25.0 μ L。
[0073]PCR 擴增條件為:94.(TC預變性 5min，94.(TC變性 30s，58.(TC退火 30s，72.(TC延伸lmin，共35個循環(huán)，72.(TC保溫IOmin后終止反應(yīng)。
[0074]取全部擴增產(chǎn)物加入6 X loading buffer于0.8%瓊脂糖凝膠中電泳,采用Axygen小量膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，與PMD18-T (Takara)載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α感受態(tài)細胞，以前述引物進行PCR鑒定得到陽性克隆，陽性克隆以載體通用引物測定擴增序列。測序結(jié)果表明，上述PCR擴增得到的片段的序列為序列表中SEQ ID Ns:1的第1-1191位的核苷酸序列，其中SEQ ID Na:1的第75-1019位的核苷酸序列為編碼序列，編碼序列表中SEQID Na:2所示的氨基酸殘基序列，共編碼315個氨基酸，將該具有序列表中SEQ ID Na:1中第75-1019位的核苷酸序列的片段命名為Msp40。
[0075]實施例2、南方根結(jié)線蟲食道腺基因Msp40的RNA干擾分析
·[0076]通過人工合成靶基因的dsRNA或siRNA，讓線蟲二齡幼蟲通過取食途徑攝取，從而引發(fā)內(nèi)源基因的RNA干擾，稱為體外RNA干擾(in vitro RNAi)技術(shù)；
[0077]一、Msp40體外RNA干擾對線蟲致病力影響
[0078]1.dsRNA 的制備
[0079]使用MEGAscript?RNAi Kit (Ambion)嚴格按實驗說明人工合成 dsRNA。dsRNA合成和純化試劑盒MEGAscript? RNAi Kit (Cat#1626)購自Ambion公司；小量RNA提取試劑盒 RNeasy Mini Kit (Cat#74104)購自 QIAGEN 公司。
[0080]I)轉(zhuǎn)錄模板制備[0081]a)以南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲基因組cDNA為模板，構(gòu)建針對序列表中SEQ ID Na:1第289-644位核苷酸片段的dsRNA。選取Msp40的5’端保守部分設(shè)計引物，擴增356bp長度目標區(qū)域，保證了無其他與靶基因同源的基因存在，避免非靶效應(yīng)。引物序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下I)或2)的蛋白: 1)序列表中的SEQID Ns.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將序列表中的SEQID N0.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與線蟲致病力相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中SEQID Ns:1第75-1019位的核苷酸序列； 2)編碼序列表中SEQID No:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列； 3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID No:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列； 4)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
4.含有下述I)或2)所述核酸片段的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或宿主菌: 1)編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸分子全長或其任意片段；所述核酸分子可以是DNA，也可以是RNA ； 2)權(quán)利要求2或3所述的編`碼基因全長或其任意片段。
5.擴增權(quán)利要求2或3所述的編碼基因全長或其任意片段的引物對。
6.一種dsRNA,所述dsRNA具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中SEQID Na:3所示的核苷酸序列； 2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID No:3限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列； 3)與I)或2)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
7.—種RNA干擾載體，所述載體為將DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點中得到的；所述DNA片段為X正向一連接區(qū)一X反向；X正向為SEQ ID N0.1中第289-646位核苷酸所示，X反向為X正向的反向互補片段； 或所述載體為將DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點中得到的；所述DNA片段為Y正向一連接區(qū)一Y反向；Y正向為SEQ ID N0.1中第721-1013位核苷酸所示，Y反向為Y正向的反向互補片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的RNA干擾載體，其特征在于:所述X正向一連接區(qū)一X反向片段具有序列表中SEQ ID N2.4所述的核苷酸序列；所述Y正向一連接區(qū)一 Y反向片段具有序列表中SEQ ID Na.5所述的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4所述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌、權(quán)利要求5所述引物對、權(quán)利要求6所述dsRNA、或權(quán)利要求7或8所述的RNA干擾載體在如下I) -5)至少一種中的應(yīng)用: O防治線蟲對植物的侵害； 2)降低線蟲的致病力或降低線蟲的侵染力； 3)制備具有線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物；4)抑制靶基因的表達； 5)鑒定靶基因的功能。 所述靶基因為權(quán)利要求2或3所述基因或其同族基因。
10.一種制備具有線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將下述I) -4)任一核酸片段導入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物: 1)根據(jù)權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因全長或其任意片段制備得到的dsRNA； 2)權(quán)利要求6所述的dsRNA； 3)具有序列表中SEQID No:4所示核苷酸序列的核酸片段； 4)具有序列表中SEQID No:5所示核苷酸序列的核酸片段； 所述轉(zhuǎn)基因植物對線蟲的抗性強于所述目的植物； 或一種降低線蟲的侵染力或致病力的方法，包括如下步驟:使出發(fā)線蟲食取權(quán)利要求6所述dsRNA，得到的目`的線蟲的侵染力或致病力低于出發(fā)線蟲。
【文檔編號】C12N15/63GK103524611SQ201310472669
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】簡恒, 牛俊海, 劉沛, 劉倩 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學