一種融合標簽蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種融合標簽蛋白。本發(fā)明的融合標簽蛋白是在野生型HREVl07(1—125)蛋白的C89S突變體(記為HREVl07N)基礎(chǔ)上構(gòu)建的，包括SEQ?ID?No：1所示氨基酸序列的HREVl07N，以及在其P38-K57無規(guī)卷曲區(qū)域中插入的兩段Linker和這兩段Linker之間的多克隆位點對應(yīng)短肽。本發(fā)明進一步提供了一種融合蛋白表達系統(tǒng)，包括編碼所述融合標簽蛋白的核酸分子，目的蛋白基因插入到所述多克隆位點中，在融合標簽蛋白的C端還可以再連接rubredoxin標簽蛋白和His標簽，以利于融合蛋白的表達和純化。
【專利說明】一種融合標簽蛋白【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種新型的融合標簽蛋白，以及基于該融合標簽的新型融合蛋白表達系統(tǒng)。【背景技術(shù)】[0002]將外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌等宿主細胞中表達以獲得相應(yīng)的目的蛋白，是科研以及生產(chǎn)過程中獲取所需蛋白質(zhì)的重要方法之一。大腸桿菌作為蛋白表達的宿主細胞有很多優(yōu)點:比如易于繁殖，蛋白表達量高且價格便宜。但是它也有很多局限性，例如:一些異源蛋白在大腸桿菌體內(nèi)表達時表達量很低，一些蛋白表達后易于降解，或者表達的外源蛋白對宿主細胞具有毒性，導致細菌生長停滯或死亡?；蛘唠m然表達量較高，但表達時蛋白尚未正確折疊便聚合在一起形成包涵體。對包涵體進行體外變復性實驗使其重新折疊的方法不僅復雜，而且難以保證變復性后蛋白的結(jié)構(gòu)與正常生理狀態(tài)下一致。[0003]選擇合適的表達載體和宿主細胞，或優(yōu)化表達溫度和時間等方法可以使一些蛋白的表達情況得到改善，但很多時候仍然難以湊效。目前使用較為廣泛的方法是利用具有促表達以及促溶作用的標簽蛋白與目的蛋白融合表達。[0004]有一些蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達時表達量很高，而且能夠正確折疊成可溶性蛋白，性質(zhì)穩(wěn)定，常被用作標簽蛋白與目的蛋白融合在一起表達。此類標簽蛋白被稱為 SETs (Solubility-Enhancing Tags),目前已發(fā)現(xiàn)了多種 SETs,例如 Trx、GST、MBP> NusA、 SUMO、GBl 等等(Esposito, D.and D.K.Chatterjee (2006)." Enhancement of soluble protein expression through the use offusion tags." CurrOpinBiotechnol17 (4): 353-358.)。但此類標簽蛋白究竟如何幫助目的蛋白的表達和折疊，機理目前尚不十分明確，且這些SETs不能幫助所有的蛋白質(zhì)表達和折疊。對于某種難以表達的蛋白，我們可能需要嘗試使用不同的SETs以找到合適的表達條件。[0005]HREV107 (又稱 H-REV107-1，H-REV107-3 和 HRSL3)是腫瘤抑制因子 H-REV107 家族蛋白中的一員。它在正常的組織中廣泛表達，但在癌細胞中的表達受到明顯的抑制。 H-REV107的大量表達可以抑制腫瘤細胞的生長并且誘導細胞凋亡(Ren，X.，J.Lin, C.Jin and B.Xia (2010)." Solution structure of the N-terminal catalytic domain of human H-REV107—a novel circular permutated NlpC / P60domain.，TEBS Lett584(19): 4222-4226.)。[0006]H-REV107由親水的N端結(jié)構(gòu)域和疏水的C端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，分別具有不同的功能: N端結(jié)構(gòu)域具有磷脂酶活性；C端是跨膜結(jié)構(gòu)域，與細胞定位有關(guān)，并能夠抑制腫瘤生長。 HREV107親水性的N端(1-125個殘基)在大腸桿菌中表達時可溶表達量很高而且性質(zhì)穩(wěn)定。據(jù)此， 我們研究了 HREV107N作為一新型融合標簽的可能性，并依據(jù)其結(jié)構(gòu)特點構(gòu)建了一種新型的融合標簽以及相應(yīng)的融合蛋白表達系統(tǒng)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明目的在于提供一種新型的融合標簽蛋白以及基于此標簽蛋白所構(gòu)建的新型融合蛋白表達系統(tǒng)。
[0008]所述新型融合標簽蛋白涉及一種新型融合蛋白構(gòu)建方法，此方法也在本發(fā)明所保護的范圍之內(nèi)。[0009]本發(fā)明所提供的新型融合標簽蛋白以HREV107的N端結(jié)構(gòu)域(第1_125位殘基)(記為HREV107N)為基礎(chǔ)構(gòu)建。本發(fā)明所述HREV107N的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:I所示。與野生型序列相比，本發(fā)明所述HREV107N序列中第89位為絲氨酸，而野生型序列該位置為半胱氨酸，即本發(fā)明所述HREV107N是其野生型的C89S突變體。此突變是為避免原有半胱氨酸殘基參與形成二硫鍵，突變后蛋白整體結(jié)構(gòu)不受影響。
[0010]本發(fā)明還涉及HREV107N的編碼基因，其編碼基因可以是序列表中SEQ ID No:2所示的DNA分子。當然，由于密碼子的簡并性，其它與SEQ ID No:2所示核苷酸序列同源且編碼相同氨基酸序列的DNA分子也可用于構(gòu)建本發(fā)明的融合標簽蛋白。
[0011]HREV107的N端結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中表達時可溶表達量很高而且性質(zhì)穩(wěn)定，故可作為一種潛在的具有促溶作用的標簽蛋白。HREV107N蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如圖1所示。其結(jié)構(gòu)中存在一段較長的無規(guī)卷曲(P38-K57)，這段區(qū)域不參與疏水核心的構(gòu)建，獨立地伸展在外。
[0012]基于HREV107N的此種特殊結(jié)構(gòu)，我們猜測在HREV107N的P38-K57部分插入一種目的蛋白后，HREV107N其它部分應(yīng)當依然能夠按照原來的方式折疊，形成一種與原有結(jié)構(gòu)基本相同的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域(參見圖2)。而HREV107N的高表達量以及高度可溶的特性將增強融合蛋白的可溶表達。該猜想被核磁NHSQC實驗所驗證(見實施例二，圖4)。
[0013]外源蛋白在大腸桿菌中表達時容易形成包涵體，包涵體是由來不及正確折疊的蛋白質(zhì)聚集在一起形成的沉淀。當目的蛋白插入到HREV107N的(P38-K57)無規(guī)卷曲區(qū)域表達時，由于HREV107N能夠重組成為正確折疊的結(jié)構(gòu)域，目的蛋白的自由度受到約束，目的蛋白之間發(fā)生相互作用聚集到一起形成包涵體的可能性降低。同時，目的蛋白被限定在HREV107N附近進行折疊，減少了其他因素的干擾，有助于其正確折疊。此外，在HREV107N的約束下，目的蛋白的生理活性有應(yīng)當有所降低，某些外源蛋白對宿主細胞的毒性也應(yīng)當有所下降。
[0014]基于上述研究，本發(fā)明提供的融合標簽蛋白包括HREV107N，以及在其P38-K57區(qū)域中插入的兩段Linker (連接肽)和這兩段Linker之間的多克隆位點(MCS)對應(yīng)短肽。
[0015]Linker區(qū)域序列可根據(jù)需要選擇合適的蛋白酶切位點(例如PreScission蛋白酶酶切位點LEVLFQGP)以及其他氨基酸殘基。通常每段Linker的長度為15-20氨基酸殘基。多克隆位點便于目的蛋白的插入，可根據(jù)需要選擇合適的限制性酶切位點。
[0016]上述融合標簽蛋白的編碼基因，以及含有該編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。按照HREV107N的蛋白質(zhì)一級序列，在其P38-K57區(qū)域內(nèi)的某一位置將其分成兩部分，這兩部分的編碼序列記為第一核酸片段和第二核酸片段，則所述融合標簽蛋白的編碼基因依次包括位于同一個閱讀框架中的第一核酸片段、Linkerl的編碼序列、多克隆位點、Linker2的編碼序列和第二核酸片段。
[0017]上述多克隆位點(MCS)位于兩段Linker的編碼序列(記為Iinkerl和linker2)之間，即 linkerl-MCS_linker2 ;而 linkerl-MCS_linker2 位于上述組成 HREV107N 編碼基因的第一核酸片段和第二核酸片段之間。[0018]在本發(fā)明的一個實施例中，Linker片段和MCS對應(yīng)短肽插入到HREV107N的第47位和第48位氨基酸殘基之間。其構(gòu)建方式如下:
[0019]將HREV107N 的蛋白質(zhì)一級序列分開成 HREV107 (1-47)和 HREV107 (48-125)兩部分，分別記為Hrevn和Hrevc。在這兩部分對應(yīng)的核酸片段之間加入兩段Linker的編碼序列以及這兩段I inker之間的多克隆位點(MCS)，如圖3所示，得到所述融合標簽蛋白的編碼序列。
[0020]為進一步方便目的蛋白的表達和純化，本發(fā)明還提供了以所述融合標簽蛋白和另一標簽蛋白 rubredoxin (鐵氧還蛋白)(Kohli, B.M.and C.0stermeier (2003)." ARubredoxin based system for screening of protein expression conditions andon-line monitoring of the purification process." Protein ExprPurif28(2):362-367.)為基礎(chǔ)構(gòu)建的融合蛋白表達系統(tǒng)。該融合蛋白表達系統(tǒng)包括一核酸分子，所述核酸分子編碼的融合蛋白除了上述融合標簽蛋白外，在其C端還連接有rubredoxin標簽蛋白。
[0021]rubredoxin(鐵氧還蛋白)是一種6KDa大小的含鐵的蛋白質(zhì)，當Fe為+2價時rubredoxin無色，當Fe為+3價時rubredoxin呈紅色。氧化態(tài)rubredoxin具有顏色的特性可使得融合蛋白的表達和純化可視化。
[0022]再進一步的,在上述融合蛋白表達系統(tǒng)在rubredoxin標簽蛋白的C端還可以連接上His標簽(圖4)。His標簽使得融合蛋白可用N1-NTA吸附柱進行純化。
[0023]本發(fā)明的融合蛋白表達系統(tǒng)在表達數(shù)種自身難以可溶表達的蛋白如AID(Alers，S., A.S.Loffier, S.Wesselborg and B.Stork (2012)." Role of AMPK-mTOR-Ulkl /2in the regulation of autophagy:cross talk, shortcuts, and feedbacks.，’Mol CellBiol32 (I):2-11.)、HREV107C 端結(jié)構(gòu)域、C-clamp (Hoverter, N.P, J.H.Ting, S.Sundaresh,P Baldi and M.L Waterman(2012)." A`ffNT / p21circuit directed by the C-clamp, asequence-specific DNA binding domain in TCFs.”Mol Cell Biol32 (18):3648-3662.)時獲得了很高的表達量。而對于另一種常規(guī)表達時導致大腸桿菌宿主死亡的蛋白質(zhì)Ki 11 in，利用所述融合蛋白表達系統(tǒng)亦獲得了很好的表達結(jié)果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1顯示了 HREV107(1-125)區(qū)域結(jié)構(gòu)，N端第1_37位氨基酸殘基和C端第58-125位氨基酸殘基之間為一段20個氨基酸殘基長度的柔性區(qū)域，該部分不參與疏水核心的構(gòu)建，獨立伸展在外。
[0025]圖2是本發(fā)明所述新型融合標簽蛋白的構(gòu)建示意圖，在HREV107(1_47)和HREV107 (48-125)之間插入目標蛋白后，HREV107N的兩部分仍然能夠重組成為正確折疊的
蛋白質(zhì)。
[0026]圖3是本發(fā)明所述新型融合標簽蛋白的一級結(jié)構(gòu)示意圖，由N端到C端依次是HREV107 (1-47)、Linker 1、MCS、LI inker2 和 HREV107 (48-125)。
[0027]圖4是HREV107N和在HREV107N中間柔性區(qū)域插入另一蛋白質(zhì)rubredoxin后所得融合蛋白的NHSQC核磁實驗結(jié)果，其中:黑色為HREV107N蛋白的信號，灰色為融合蛋白的信號。[0028]圖5是實施例二所構(gòu)建的新型融合蛋白表達系統(tǒng)的折置結(jié)構(gòu)不意圖，目標蛋白插Λ HREV107(l-47)和 HREV107 (48-125)之間。
[0029]圖6是實施例三所構(gòu)建的新型融合蛋白表達系統(tǒng)的蛋白一級結(jié)構(gòu)示意圖，由N端到 C 端依次是 HREV107(l-47)、Linkerl、MCS、Linker2、HREV107 (48-125)、rubredoxin 和His標簽。
[0030]圖7顯示了 AID、C-clamp、Hrev_C與Killin (8-50)單獨表達以及利用新型融合表達系統(tǒng)表達時的表達情況，其中:A.AID與C-clamp單獨表達時幾乎無表達；B.Hrev-C單獨表達時形成包涵體；C.Killin單獨表達時導致宿主細胞死亡，故表達量很低；D.利用實施例三構(gòu)建的新型融合表達系統(tǒng)，上述蛋白都獲得了較高的可溶表達量，而且很少形成包涵體。U1:未誘導樣品；T:全菌；S:細菌裂解后所得上清；P:細菌裂解后所得沉淀。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖，通過實施例具體說明本發(fā)明新型融合標簽蛋白的構(gòu)建過程以及新型融合蛋白表達系統(tǒng)的效果，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0032]實施例中，如實驗具體條件未注明，請參照《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克D.W拉塞爾著)所述常規(guī)實驗條件，或者儀器、試劑供應(yīng)商所提供的條件。常規(guī)質(zhì)粒構(gòu)建所涉及的PCR、酶切、連接等實驗，以及蛋白質(zhì)表達所涉及的轉(zhuǎn)化、細菌培養(yǎng)、誘導等實驗為本領(lǐng)域研究人員所熟悉，具體實驗細節(jié)在本發(fā)明中不再做詳細描述，亦可參照《分子克隆實驗指南》。
[0033]實施例一:野生型HREV107 (1-125)基因片段的獲得以及C89S突變體構(gòu)建
[0034]野生型HREV107 (1-125)的DNA片段可以通過以人類肝臟cDNA文庫(購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)為模板的PCR擴增反應(yīng)獲得。
[0035]以人類肝臟cDNA文庫為模板，以Nde1-REV-N / REV-Xho1-C為引物，進行PCR擴增，得到兩端分別帶有NdeI和XhoI酶切位點的野生型HREV107 (1-125)基因片段。將該片段通過這兩個酶切位點插入pET-2Ia載體中，得到pET-21a-HREV107N-His質(zhì)粒。引物序列如下:
[0036]Nde1-REV-N:5’ -GGAATTCCATATGCGTGCGCCCATTCCA-3’ (SEQ ID No:4)
[0037]REV-Xho1-C:5，-CCGCTCGAGGGCGACTCCATAGCGCAG-3，(SEQ ID No:5)
[0038]其中CATATG與CTCGAG分別為NdeI和XhoI限制性酶切位點。
[0039]由于野生型HREV107 (1-125)結(jié)構(gòu)中第89位半胱氨酸在蛋白質(zhì)的表面，有可能與其他半胱氨酸之間形成二硫鍵，本發(fā)明將該半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸。另外，113位的半胱氨酸由于在疏水核心內(nèi)部，不需進行突變。
[0040]定點突變所用試劑購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，具體實驗過程細節(jié)請參閱試劑盒說明書。以從大腸桿菌中純化得到的pET-21a-HREV107N-His質(zhì)粒為模板，以C89S_F / C89S_R為引物，用Muta-directTM酶進行18個循環(huán)的PCR擴增反應(yīng)，MutazymeTM酶處理選擇突變克隆，轉(zhuǎn)化。取LB平板上的克隆搖菌，提純質(zhì)粒并測序，選擇正確的突變克隆，得到 pET-21a-HREV107N_C89S-His 質(zhì)粒。
[0041]定點突變所用引物序列如下:
[0042]C89S_F:5， -GTACTCGCCGCTGCCCAGCAGCAAAATCATCCA-3’ (SEQ ID No:6)[0043]C89S_R:5’ -TGGATGATTTTGCTGCTGGGCAGCGGCGAGTAC-3’ (SEQ ID No:7)
[0044]為敘述簡便，說明書其他地方不再對此突變進行強調(diào)，其他實施例中所涉及HREV107N序列均指突變體序列。
[0045]實施例二:Hrevn-rubredoxin-Hrevc_His融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建、表達和表征
[0046]本實施例以rubredoxin蛋白作為目的蛋白，將其插入HREV107N的P38-K57區(qū)域。
[0047]本實施例所用rubredoxin蛋白以及構(gòu)建過程中選擇的linker、酶切位點等僅用于說明新型融合標簽蛋白的構(gòu)建方法，并不限定本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0048]I)構(gòu)建重組質(zhì)粒
[0049]重組質(zhì)粒表達區(qū)域從5’端至3’端共包括以下A至F共6部分，序列依次為:
[0050]A)HREV107(l-47):參照序列表中SEQ ID No:2的第1-141位核苷酸序列，其編碼SEQ IDNo:1的第1-47位氨基酸殘基；
[0051]B) Linkerl:
[0052]5，ccatggggtggttctggtggtggttctggtctggaagttctgttccaggggcccggatcc_3^ (SEQID No:8)其中位于首尾的ccatgg與ggatcc序列分別為NcoI和BamHI限制性酶切位點，以便于變換linker。
[0053]對應(yīng)氨基酸序列為:PffGGSGGGSGLEVLFQGPGS(SEQID No:9)
[0054]其中LEVLFQGP為PreScission蛋白酶酶切位點。
[0055]C)rubredoxin:參照序列表中 SEQ ID No:3 ；
`[0056]D) Linker2:
[0057]5，_gaattcggtggtggtggttctctggaagttctgttccaggggccctcttctggtatcgat_3^ (SEQ ID No:10)
[0058]其中位于首尾的gaattc與atcgat序列分別為EcoRI和ClaI限制性酶切位點。
[0059]對應(yīng)氨基酸序列為:EFGGGGSLEVLFQGPSSGID(SEQ ID No:11)
[0060]E)HREV107 (48-125):參照序列表中SEQ ID No:2的第142-375位核苷酸序列，其編碼SEQ ID No:1的第48-125位氨基酸殘基。
[0061]F) Hi s 標簽
[0062]設(shè)計相應(yīng)引物利用重疊PCR反應(yīng)將前5部分(A至E)依次連接在一起，然后通過NdeI和XhoI限制性酶切位點插入pET-21a商業(yè)載體中，該載體帶有一個His標簽，在融合蛋白的C端。
[0063]2)融合蛋白的表達和純化
[0064]將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達菌株。35°C條件下培養(yǎng)細菌，先在20mL LB中培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)入IL LB中繼續(xù)培養(yǎng)。當菌液OD值為0.8時溫和離心并將菌體轉(zhuǎn)入500mL15N同位素標記的M9培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)Ih后加入0.4mMIPTG以及0.7mMFeCl3誘導蛋白表達。4h后收集細菌。超聲破碎，離心，取上清液。利用DE52陰離子交換色譜或N1-NTA吸附柱以及FPLC色譜分離純化得到15N標記的融合蛋白。
[0065]3)利用核磁NHSQC實驗觀察融合蛋白的折疊情況
[0066]以15N標記的HREV107N蛋白為對照，對15N標記的融合蛋白進行核磁NHSQC實驗，實驗結(jié)果見圖4。黑色為HREV107N蛋白的信號，灰色為融合蛋白的信號?？梢钥吹紿REV107N的大部分信號在融合蛋白的NHSQC圖譜上均可找到，證明在融合蛋白中，HREV107N的結(jié)構(gòu)與原結(jié)構(gòu)基本相同。也就是說,在HREV107N中間柔性區(qū)域插入另一蛋白質(zhì)rubredoxin后，HREV107N的兩部分仍然能夠重組成為正確折疊的蛋白質(zhì)。
[0067]實施例三:新型融合蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建以及測試
[0068]在本實施例中，四種不同的蛋白被用來測試新型融合蛋白表達系統(tǒng)的效果。
[0069]I)測試所用目的蛋白介紹
[0070]AID:AID(auto-1nhibiting domain)是腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase (AMPK)) α亞基的一部分。AMPK是一種重要的蛋白激酶，它在人體的很多器官組織包括肝臟、大腦、骨骼肌中都有表達。生物體內(nèi)AMP / ATP比例的升高能夠激活AMPK的活性，AMPK被激活后能夠促進多細胞生物體內(nèi)一系列分解代謝過程，同時抑制一些合成代謝通路，比如脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物的生物合成，從而使AMP與ATP的比例維持在恒定水平。因此AMPK是生物能量代謝的關(guān)鍵分子。
[0071]C-clamp:ffnt信號通路是多細胞真核生物中高度保守的信號通路，在胚胎發(fā)育、某些腫瘤發(fā)展等過程中起到重要作用。當fct信號通路激活時，下游轉(zhuǎn)錄因子LEF / T cellfactor(LEF / TCF)與基因組中的 Wnt 響應(yīng)序列(Wnt response elements,WREs)結(jié)合，從而激活或抑制相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄過程。LEF / TCF蛋白與DNA的主要結(jié)合區(qū)域是HMG(highmobility group)box7。近來，有研究發(fā)現(xiàn)有一類LEF / TCF存在第二個與DNA結(jié)合的區(qū)域。該區(qū)域由約37個氨基酸構(gòu)成，含有4個十分保守的半胱氨酸殘基，因而被命名為C-clamp (Cystine clamp)模體。C-clamp能夠特異性結(jié)合RGGC序列。對C-clamp結(jié)構(gòu)以及其DNA結(jié)合機制的研究有助于闡明這一類LEF / TCF轉(zhuǎn)錄因子的作用機制。
[0072]Killin =Killin是p53靶基因編碼的20KDa的核蛋白，它受p53調(diào)控抑制核內(nèi)DNA的合成，對P53誘導的細胞凋亡起 重要作用。它對DNA的結(jié)合能力很強，在體外它可抑制真核生物的DNA合成，在體內(nèi)它可以引發(fā)細胞凋亡前的S期生長停滯。在試圖用大腸桿菌大量表達并純化 6XHIS_tagged Killin 時發(fā)現(xiàn)，在加入 IPTG(isopropyl-D-thiogalactoside)誘導半個小時后，細菌生長停滯，已表達的蛋白由于量非常少，用Western blot檢測時幾乎不能用His-tag的單克隆抗體檢測到,而且由于Killin結(jié)合了 DNA使其His-tag不能和Ni結(jié)合，因此無法用N1-NTA親和色譜純化得到Killin純蛋白。研究發(fā)現(xiàn)Ki 11 in中對于抑制DNA合成起關(guān)鍵作用的DNA結(jié)合域是接近Ki 11 in N端的42個氨基酸殘基(8_50)，它是保持Killin毒性的最短的片段。
[0073]Hrev-C:HREV107 的 C 端結(jié)構(gòu)域(126-162)，包括 HREV107 的第 126-162 位氨基酸殘基。
[0074]AID和C-clamp在大腸桿菌中的表達量很低(見圖7A)，而HREV107的C端結(jié)構(gòu)域(126-162)(記為Hrev-C)在大腸桿菌中表達時為包涵體(見圖7B)，Killin(8_50)區(qū)域則因為表達時導致宿主細胞死亡故而不能通過傳統(tǒng)的表達方式獲得蛋白(見圖7C)。
[0075]2)新型融合蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建
[0076]參照圖4，新型融合蛋白表達系統(tǒng)自5’端至3’端包括七部分，分別為:
[0077]A)HREV107(l-47):參照序列表中SEQ ID No:2的第1-141位核苷酸序列，其編碼SEQ IDNo:1的第1-47位氨基酸殘基；
[0078]B) Linkerl:
[0079]5， ccat￡￡ggtggttctggtggtggttctggtctggaagttctgttccaggggccc-3> (SEQ IDNo:12)
[0080]其中ccatgg為NcoI限制性酶切位點,用于必要時候變換linker。
[0081]對應(yīng)氨基酸序列為:PffGGSGGGSGLEVLFQGP(SEQID No:13)
[0082]其中LEVLFQGP為PreScission蛋白酶酶切位點。
[0083]C)MCS:多克隆位點(multiple cloning site),用于目的蛋白的插入,本例中采用BamHI 與 EcoRI 兩個限制性酶切位點，即 5’ -GGATCCGAATTC-3’ (SEQ ID No:14)。
[0084]D) Linker2:
[0085]5，-ggtggtggtggttctctggaagttctgttccaggggccctcttctggtacga-3， (SEQ ID No:15)
[0086]其中atcgat為ClaI限制性酶切位點。
[0087]對應(yīng)氨基酸序列為:GGGGSLEVLFQGPSSGID(SEQID No:16)
[0088]E)HREV107 (48-125):參照序列表中SEQ ID No:2的第142-375位核苷酸序列，其編碼SEQ ID No:1的第48-125位氨基酸殘基。
[0089]F)rubredoxin:參照序列表中 SEQ ID No:3。
[0090]G) Hi s ?不簽。
[0091]將前6部分(A至F)通過重疊PCR反應(yīng)連接在一起，通過NdeI和XhoI限制性酶切位點插入到C端帶有His標簽的pET-21a商業(yè)載體中。其中HREV107(48-125)與rubredoxin之間再引入三個殘基，避免二者之間互相干擾，序列為SSG。
[0092]3)將 AID、C-clamp、Hrev-C 以及 Killin(8-50)通過 BamHI 和 EcoRI 限制性酶切位點分別插入新型融合蛋白表達系統(tǒng)，得到四個重組質(zhì)粒。
[0093]4)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21表達菌株。35°C條件下培養(yǎng)細菌，先在3mL LB中培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)入20L LB中繼續(xù)培養(yǎng)。當菌液OD值為0.8時加入0.4mMIPTG以及0.7mMFeCl3誘導蛋白表達。4h后收集細菌。
[0094]5)利用SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分析各融合蛋白的表達情況，結(jié)果如圖7D所示。
[0095]利用本發(fā)明的新型融合蛋白表達系統(tǒng)，原本表達量低或表達時形成包涵體的幾種蛋白均獲得了很高的可溶表達量。同時，該系統(tǒng)所帶的rubredoxin標簽蛋白由于具有顏色，使得表達與純化過程變得可視化。表達系統(tǒng)中的His標簽使得融合蛋白可用N1-NTA吸附柱進行純化。
【權(quán)利要求】
1.蛋白HREV107N，其氨基酸序列如序列表中的SEQID No:1所示。
2.權(quán)利要求1所述蛋白HREV107N的編碼基因。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白HREV107N的編碼基因，其特征在于，該編碼基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No:2所示。
4.一種融合標簽蛋白，包括權(quán)利要求1所述的蛋白HREV107N，以及在其第38-57位氨基酸殘基組成的無規(guī)卷曲區(qū)域中插入的兩段Linker和這兩段Linker之間的多克隆位點對應(yīng)短肽。
5.如權(quán)利要求4所述的融合標簽蛋白，其特征在于，所述兩段Linker和多克隆位點對應(yīng)短肽插入到蛋白HREV107N的第47位和第48位氨基酸殘基之間。
6.如權(quán)利要求4所述的融合標簽蛋白，其特征在于，每段Linker長15-20氨基酸殘基； 優(yōu)選的，在所述Linker中具有蛋白酶切位點；更優(yōu)選的,兩段Linker的序列如序列表中SEQ ID No:14 和 SEQ ID No:16 所示。
7.權(quán)利要求4~6任一所述融合標簽蛋白的編碼基因，以及含有該編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
8.一種融合蛋白表達系統(tǒng)，包括一核酸分子，該核酸分子編碼的融合蛋白包含權(quán)利要求4~6任一所述的融合標簽蛋白，其中所述的多克隆位點用于目的蛋白基因的插入。
9.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白表達系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸分子編碼的融合蛋白還包含連接在權(quán)利要求4~6任一所述的融合標簽蛋白C端的rubredoxin標簽蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白表達系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸分子編碼的融合蛋白還包含連接在rubredoxin標簽蛋白C端的His標簽。
【文檔編號】C12N15/70GK103554245SQ201310481574
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】夏斌, 段博, 陳安琦 申請人:北京大學