堿基序列分析方法和堿基序列分析裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及堿基序列分析方法和堿基序列分析裝置。該堿基序列分析方法包括：核酸擴(kuò)增步驟，通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，渾濁度測(cè)量步驟，測(cè)量核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溶液的渾濁度，以及熔解曲線分析步驟，對(duì)位于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的探針核酸鏈和擴(kuò)增產(chǎn)物執(zhí)行熔解曲線分析。
【專利說(shuō)明】堿基序列分析方法和堿基序列分析裝置
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求于2012年10月23日提交的日本在先專利申請(qǐng)2012-234227的權(quán)益，將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本技術(shù)涉及堿基序列分析方法、堿基序列分析裝置以及堿基序列分析程序。具體地，本技術(shù)涉及包括渾濁度測(cè)量步驟和熔解曲線分析步驟的堿基序列分析方法等。
【背景技術(shù)】
[0004]雙鏈核酸鏈解離(熔解)成兩個(gè)單鏈核酸的溫度稱為熔解溫度(Tm值)。在熔解曲線分析中，通過(guò)檢測(cè)由于在雙鏈核酸鏈逐漸地被加熱并熔解為兩個(gè)單鏈核酸時(shí)出現(xiàn)熔解而改變的信號(hào)，測(cè)量與溫度的變化有關(guān)的信號(hào)檢測(cè)量的變化。可從通過(guò)繪制與溫度的變化有關(guān)的信號(hào)檢測(cè)量的變化獲得的熔解曲線確定熔解溫度。因?yàn)槿劢鉁囟确从硟蓚€(gè)單鏈核酸之間的同源關(guān)系，所以兩個(gè)單鏈核酸之間的同源關(guān)系可基于熔解溫度來(lái)確定。因此，熔解曲線分析用于分析核酸，例如，核酸擴(kuò)增反應(yīng)的特異性的驗(yàn)證和單核苷酸多態(tài)性(SNP)等的基因型確定。
[0005]熒光物質(zhì)通常用于檢測(cè)雙鏈核酸鏈的熔解。例如，通過(guò)熒光標(biāo)記能夠與靶核酸鏈形成雙鏈核酸鏈的核酸探針，基于當(dāng)靶核酸鏈和核酸探針解離時(shí)通過(guò)熒光標(biāo)記的光的發(fā)射或消失可檢測(cè)核酸鏈的解離。此外，使用通過(guò)嵌入雙鏈核酸來(lái)產(chǎn)生熒光的嵌入劑可檢測(cè)從雙鏈至單鏈的變化。
[0006]熒光物質(zhì)不限于熔解曲線分析，其也廣泛地用于擴(kuò)增后核酸鏈的檢測(cè)和定量及其他這樣的核酸分析。另一方面，對(duì)于擴(kuò)增后核酸鏈的檢測(cè)，也可不使用熒光物質(zhì)而采用檢測(cè)樣本的渾濁度的方法。在使用D`NA合成酶的延伸反應(yīng)中，反應(yīng)溶液中的作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的焦磷酸與鎂離子結(jié)合，由此形成焦磷酸鎂。如果產(chǎn)生的焦磷酸鎂的量超過(guò)樣品的可溶水平，焦磷酸鎂沉淀且反應(yīng)溶液變濁。通過(guò)測(cè)量渾濁度的水平，可實(shí)施對(duì)擴(kuò)增后核酸鏈檢測(cè)和量化。
[0007]因此，例如，JP-A-2012-34617公開(kāi)的“核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置包括:第一光源，被配置為輸出用于激發(fā)熒光物質(zhì)的光；第二光源，被配置為輸出波長(zhǎng)區(qū)域與由熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光的波長(zhǎng)區(qū)域匹配的光；以及控制單元，被配置為通過(guò)在第一光源和第二光源之間切換來(lái)發(fā)射光；其中，通過(guò)使來(lái)自第一光源的光和來(lái)自第二光源的光沿著光路(通過(guò)光引導(dǎo)構(gòu)件使兩個(gè)光束在該光路上重疊)通過(guò)并照射在用作核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的反應(yīng)區(qū)上，可檢測(cè)隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行形成的渾濁物質(zhì)所產(chǎn)生的光量和隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行由光激發(fā)的熒光物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度。”

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]當(dāng)通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)在擴(kuò)增后核酸鏈上執(zhí)行上述熔解曲線分析時(shí)，因?yàn)槿劢馇€分析在核酸已被擴(kuò)增后開(kāi)始，所以要在預(yù)定時(shí)間執(zhí)行從核酸擴(kuò)增反應(yīng)到熔解曲線分析的切換。
[0009]根據(jù)本公開(kāi)的實(shí)施方式，提供一種能夠連續(xù)地執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析的堿基序列分析方法。
[0010]根據(jù)本公開(kāi)的實(shí)施方式，提供一種堿基序列分析方法包括:通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸擴(kuò)增步驟，測(cè)量核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溶液的渾濁度的渾濁度測(cè)量步驟，以及對(duì)位于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所執(zhí)行探針核酸鏈和擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析的溶解曲線分析步驟。
[0011]優(yōu)選的是，當(dāng)渾濁度達(dá)到預(yù)定值時(shí)執(zhí)行熔解曲線分析步驟。
[0012]此外，優(yōu)選的是，探針核酸鏈具有比核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度低的熔解溫度。
[0013]此外，優(yōu)選的是，探針核酸鏈具有比核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用的引物的熔解溫度低的熔解溫度，并且在探針核酸鏈存在下執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0014]探針核酸鏈可具有比引物的熔解溫度低5_15°C的熔解溫度。
[0015]各自具有不同的堿基序列的多個(gè)探針核酸鏈可被用作探針核酸鏈。
[0016]各自具有不同的堿基序列的多個(gè)探針核酸鏈可各自被發(fā)射不同波長(zhǎng)的光的熒光物質(zhì)標(biāo)記。在具有不同的堿基序列的多個(gè)探針核酸鏈中，一個(gè)探針核酸鏈可完全地匹配(match, 一致)包含在擴(kuò)增產(chǎn)物中的堿基序列的一部分。
[0017]核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以是等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)。等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)可通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法來(lái)執(zhí)行。
[0018]根據(jù)本公開(kāi)的實(shí)施方式，提供堿基序列分析裝置包括:光源，被配置為將照射光輸出在反應(yīng)場(chǎng)所上，檢測(cè)單元，被配置為檢測(cè)由于照射光而從反位于應(yīng)場(chǎng)所中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液產(chǎn)生的光，溫度調(diào)節(jié)單元，被配置為加熱或者冷卻反應(yīng)場(chǎng)所；以及控制單元，被配置為基于檢測(cè)單元的信號(hào)輸入來(lái)切換光源的驅(qū)動(dòng)模式?？刂茊卧慌渲脼閷Ⅱ?qū)動(dòng)模式從核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式切換至熔解曲線分析模式。
[0019]優(yōu)選的是,光源包括第一光源和第二光源，并且從第一光源輸出的光的波長(zhǎng)與從被包含在利用第二光源的光照射的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光的波長(zhǎng)區(qū)域匹配。
[0020]控制單元可被配置為隨著從核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式切換到溶解曲線分析模式，將向反應(yīng)場(chǎng)所輸出照射光的光源從第一光源切換到第二光源。
[0021]進(jìn)一步，堿基序列分析裝置還可包括:光引導(dǎo)構(gòu)件，該光引導(dǎo)構(gòu)件被配置為將從第一光源輸出的光和從第二光源輸出的光引導(dǎo)至兩束光可在其重疊的光路。
[0022]此外，第二光源可為一個(gè)或多個(gè)激光源和/或LED光源。檢測(cè)單元可以時(shí)間分割方式檢測(cè)從熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光。
[0023]堿基序列分析裝置可被設(shè)置有遮光結(jié)構(gòu)，該遮光結(jié)構(gòu)被配置為限制從光源和/或反應(yīng)場(chǎng)所輸出的光的前進(jìn)方向。遮光結(jié)構(gòu)可具有與在光源與檢測(cè)單元之間的多個(gè)光路上的位置對(duì)應(yīng)的多個(gè)開(kāi)口部(aperture portion)。
[0024]根據(jù)本公開(kāi)的實(shí)施方式，提供一種堿基序列分析程序，該堿基序列分析程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行:通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸擴(kuò)增步驟，測(cè)量核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溶液的渾濁度的渾濁度測(cè)量步驟，對(duì)位于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的探針核酸鏈和擴(kuò)增產(chǎn)物執(zhí)行熔解曲線分析的熔解曲線分析步驟。
[0025]根據(jù)本公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式，提供一種能夠在同一反應(yīng)場(chǎng)所連續(xù)地執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析的堿基序列分析方法等。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置的示意圖；
[0027]圖2是示出了通過(guò)根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置來(lái)執(zhí)行核酸分析方法的流程圖；
[0028]圖3是示出了通過(guò)堿基序列分析裝置執(zhí)行核酸分析方法的變形例的流程圖；
[0029]圖4是根據(jù)本技術(shù)的第二實(shí)施方式的堿基序列分析裝置的示意圖；
[0030]圖5是示出了基于實(shí)驗(yàn)I中測(cè)量到的測(cè)試組I至3的渾濁度的Tt值的圖；
[0031]圖6是示出了實(shí)驗(yàn)2中測(cè)量到的測(cè)試組I至3的熔解曲線的圖；以及
[0032]圖7是示出了實(shí)驗(yàn)2中測(cè)量到的測(cè)試組I至3的熔解曲線的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]在下文中， 將參考附圖來(lái)詳細(xì)描述本公開(kāi)的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)注意，在此說(shuō)明書(shū)和附圖中，具有基本上相同的功能與結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)元件以相同的參考標(biāo)號(hào)表示，并且省略了對(duì)這些結(jié)構(gòu)性元件的重復(fù)解釋。將按照以下順序進(jìn)行描述。
[0034]1.根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置的配置
[0035]( I)光源
[0036](2)檢測(cè)單元
[0037](3)溫度調(diào)節(jié)單元
[0038](4)控制單元
[0039](5)反應(yīng)區(qū)域
[0040]2.根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置的操作
[0041](I)核酸擴(kuò)增步驟
[0042]( 2 )渾濁度測(cè)量步驟
[0043](3)熔解曲線分析步驟
[0044]3.根據(jù)本技術(shù)的第二實(shí)施方式的堿基序列分析裝置的配置
[0045](I)激發(fā)濾波器
[0046](2)遮光結(jié)構(gòu)
[0047]4.根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析方法和堿基序列分析程序
[0048]1.根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置的配置
[0049]圖1是根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A1的示意圖。堿基序列分析裝置A1包括:將照射光輸出到反應(yīng)區(qū)域52上的光源(在圖1中，第一光源11和第二光源12)，該反應(yīng)區(qū)域52是核酸擴(kuò)增反應(yīng)場(chǎng)所，檢測(cè)由于照射光從發(fā)生在反應(yīng)區(qū)域52 (反應(yīng)場(chǎng)所)中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的光的檢測(cè)單元2，加熱或者冷卻反應(yīng)區(qū)域52 (反應(yīng)場(chǎng)所)的溫度調(diào)節(jié)單元3a，以及基于來(lái)自檢測(cè)單元2的信號(hào)輸入而切換光源11和光源12的驅(qū)動(dòng)模式的控制單元4。此外，在根據(jù)本實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A1中，包括第一光源11和第二光源12作為光源。
[0050]此外，根據(jù)本實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A1包括光引導(dǎo)構(gòu)件131，其將從第一光源11 (第一光源)輸出的光和從第二光源12 (第二光源)輸出的光引導(dǎo)至這些光束在其重置的光路。
[0051]將參考圖1依次描述在堿基序列分析裝置A1中的各個(gè)結(jié)構(gòu)。應(yīng)注意，將要由堿基序列分析裝置A1分析的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液將被描述為被存儲(chǔ)在微芯片B1的反應(yīng)區(qū)域52中，微芯片B1被配置為相對(duì)堿基序列分析裝置A1的單獨(dú)的結(jié)構(gòu)。此外，在圖1中，設(shè)置在微芯片B1中的多個(gè)區(qū)域中的兩個(gè)反應(yīng)區(qū)域52和52作為代表示出。
[0052](光源)
[0053]如圖1所示，堿基序列分析裝置A1包括兩種類型的光源(第一光源11和第二光源12)作為將光照射在反應(yīng)區(qū)域52上的光源。
[0054]第一光源11輸出光L1用于測(cè)量核酸擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程期間的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾池度。優(yōu)選來(lái)自第一光源11的光L1的波長(zhǎng)與從包含在利用來(lái)自第二光源12的光L2照射的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光L21的波長(zhǎng)區(qū)域匹配。堿基序列分析裝置A1包括允許由來(lái)自第二光源12的光L2激發(fā)熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光L21經(jīng)過(guò)的熒光濾波器17。因此，配置成從第一光源11輸出的光L1具有與來(lái)自突光物質(zhì)的突光L21相同的波長(zhǎng)區(qū)域從而允許光L1經(jīng)過(guò)熒光濾波器17，因此，在反應(yīng)區(qū)域52中產(chǎn)生的光L11和熒光L21可通過(guò)同一檢測(cè)單元2檢測(cè)。
[0055]例如，來(lái)自第一光源11的光L1可為像從普通光源(如:氘燈、鎢絲燈、氙燈、汞燈、鹵素?zé)舻?輸出的各種波長(zhǎng)的混合波長(zhǎng)的光。匹配熒光濾波器17的傳輸波長(zhǎng)區(qū)域的波長(zhǎng)區(qū)域可為諸如大于等于450nm,特別是450至780nm。
[0056]在通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增`產(chǎn)物的熔解曲線分析中，第二光源12將激發(fā)光1^2(在圖1中以光L2表示)輸出到包含在核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中的熒光物質(zhì)上。激發(fā)光L2具有與期望的熒光物質(zhì)的吸收光譜對(duì)應(yīng)的特定波長(zhǎng)區(qū)域。此波長(zhǎng)區(qū)域不與由熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光L21的波長(zhǎng)區(qū)域重疊。激發(fā)光L2到達(dá)反應(yīng)區(qū)域52，并激發(fā)熔解曲線分析中使用的熒光物質(zhì)。此外，從熒光物質(zhì)產(chǎn)生的激發(fā)光L2經(jīng)由熒光濾波器17到達(dá)檢測(cè)單元2。
[0057]第二光源12 (第二光源)的實(shí)例包括激光光源和LED光源、汞燈、鎢絲燈等。這些光源可單獨(dú)使用或者以其多個(gè)光源的組合使用。特別地，優(yōu)選一個(gè)或多個(gè)激光源和/或LED光源。如果光源是激光源，因?yàn)檫@樣的光源具有較窄光譜寬度和高功率輸出，所以可省略過(guò)去使用的激發(fā)濾波器。此外，在第二光源12中包括導(dǎo)光板使得能夠通過(guò)具有不同的波長(zhǎng)的多種類型激光光源以多種顏色激發(fā)。這也允許具有不同波長(zhǎng)的多個(gè)激發(fā)光束以時(shí)間分割方式從第二光源輸出。
[0058]在根據(jù)本實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A1中，光引導(dǎo)構(gòu)件131被設(shè)置為使分別從第一光源11和第二光源12輸出的光L1和L2的光路重疊。盡管光引導(dǎo)構(gòu)件13在根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式I的堿基序列分析裝置中是可選擇的結(jié)構(gòu)，但是使用光引導(dǎo)構(gòu)件131允許光路上的聚光透鏡15和檢測(cè)單元2的數(shù)目減少，因此，能夠減少整個(gè)堿基序列分析裝置的大小。
[0059]光引導(dǎo)構(gòu)件131包括光學(xué)入射端部131a。從第一光源11或者第二光源12輸出的光L1和L2入射在光學(xué)入射端部131a上。使入射光L1和L2朝反應(yīng)區(qū)域52的方向前進(jìn)的構(gòu)件(如:棱鏡、反射板、凹凸部等)被設(shè)置在光引導(dǎo)構(gòu)件131中。此外，在堿基序列分析裝置A1中,優(yōu)選在光引導(dǎo)構(gòu)件131和反應(yīng)區(qū)域52之間布置聚光透鏡15和光闌16。
[0060](2)檢測(cè)單元
[0061]檢測(cè)單元2檢測(cè)從反應(yīng)區(qū)域52輸出的光L11或者熒光L21。不特別地限制檢測(cè)單元2的配置，只要至少可檢測(cè)光L11和熒光L21即可，光L11包括來(lái)自利用來(lái)自第一光源11的光L1照射的反應(yīng)區(qū)域52的散射光或者通過(guò)反應(yīng)區(qū)域52的透射光，熒光L21通過(guò)來(lái)自第二光源12的激發(fā)光L2從反應(yīng)區(qū)域52產(chǎn)生。檢測(cè)單元2的實(shí)例包括區(qū)域成像元件，例如，CXD或CMOS元件、PMT (光電倍增管)、光電二極管等。
[0062]此外，優(yōu)選堿基序列分析裝置A1包括在包含散射光或透射光的光L11和熒光L21到達(dá)檢測(cè)單元2的光路上、在反應(yīng)區(qū)域52和檢測(cè)單元2之間的熒光濾波器17和聚光透鏡15。優(yōu)選熒光濾波器17使來(lái)自反應(yīng)區(qū)域52的光L11 (包含散射光或透射光)或熒光L21較好地通過(guò)。例如，熒光濾波器17可為多帶通濾波器。特定的波長(zhǎng)頻帶可為大于等于450nm，更具體地為450nm至750nm。此外，如果從上述第二光源12輸出的激發(fā)光L2以時(shí)間分割的方式輸出到反應(yīng)區(qū)域52，優(yōu)選堿基序列分析裝置A1具有以時(shí)間分割方式檢測(cè)從反應(yīng)區(qū)域52中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光L21的檢測(cè)單元2。 [0063](3)溫度調(diào)節(jié)單元
[0064]溫度調(diào)節(jié)單元3a是用于加熱或冷卻的結(jié)構(gòu)，以便反應(yīng)區(qū)域52具有期望的溫度。不特別地限制溫度調(diào)節(jié)單元3a，只要其能改變反應(yīng)區(qū)域52的溫度即可。例如，溫度調(diào)節(jié)單元3a可為透明導(dǎo)電膜，例如，可透光的ITO加熱器。溫度調(diào)節(jié)單元優(yōu)選設(shè)置在接近反應(yīng)區(qū)域52的位置。
[0065](4)控制單元
[0066]控制單元4控制上述的第一光源11、第二光源12及溫度調(diào)節(jié)單元3a的驅(qū)動(dòng)。下文將描述通過(guò)控制單元4控制第一光源11等?？蓮陌–PU、存儲(chǔ)器、硬盤等的通用計(jì)算機(jī)中配置控制單元4。OS、以下描述的堿基序列分析程序等存儲(chǔ)在硬盤上。
[0067](5)反應(yīng)區(qū)域
[0068]反應(yīng)區(qū)域52是用于下文描述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析的反應(yīng)場(chǎng)所。不特別地限制反應(yīng)區(qū)域52的配置，只要通過(guò)堿基序列分析裝置A1可測(cè)量從反應(yīng)區(qū)域52產(chǎn)生的光L11和L21即可?？赏ㄟ^(guò)市場(chǎng)上可買到的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用塑料管配置反應(yīng)區(qū)域52用?？商鎿Q地，如圖1中所示，例如，反應(yīng)區(qū)域52可為形成在微芯片B1中的溝槽。
[0069]微芯片B1由多個(gè)基板51和51層壓成。在根據(jù)本實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A1中，因?yàn)榉庋b在反應(yīng)區(qū)域52中的樣品經(jīng)受光學(xué)分析，對(duì)于基板51和51，優(yōu)先選擇可透光的并且由于具有很少固有熒光與少量的波長(zhǎng)色散而具有很少光學(xué)誤差的材料。基板51和51可由諸如玻璃和各種塑料(聚丙烯、聚碳酸酯、環(huán)烯烴聚合物、聚二甲硅氧烷等)的材料形成。此外，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析中使用的試劑的一部分可預(yù)先包含在反應(yīng)區(qū)域52中。
[0070]2.根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置的操作
[0071]接下來(lái)，將參考圖2中示出的流程圖描述根據(jù)本技術(shù)第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A1的操作。如此流程圖(圖2)所示，根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析方法包括:核酸擴(kuò)增步驟(SI)、渾濁度測(cè)量步驟(S2)和熔解曲線分析步驟(S3)。[0072](I)核酸擴(kuò)增步驟
[0073]在圖2中，參考符號(hào)SI表示通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸擴(kuò)增步驟。在此步驟SI中，將包含核酸鏈(即:擴(kuò)增靶)的樣品(核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液)引入反應(yīng)區(qū)域52 (參考圖1)，實(shí)施核酸擴(kuò)增反應(yīng)，并且獲得用于熔解曲線分析的包含靶序列的擴(kuò)增后核酸鏈。
[0074]使用根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置Al執(zhí)行的“核酸擴(kuò)增反應(yīng)”包括:采用熱循環(huán)的常規(guī)PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))以及不涉及熱循環(huán)的各種等溫?cái)U(kuò)增方法。等溫?cái)U(kuò)增方法的實(shí)例包括諸如LAMP (環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)、SMAP (智能擴(kuò)增方法)、NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增)、ICAN? (核酸的等溫嵌合引物啟動(dòng)的擴(kuò)增)、TRC (轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào))、SDA (鏈置換擴(kuò)增)、TMA (轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增)、RCA (滾環(huán)擴(kuò)增)等的方法。此外，該“核酸擴(kuò)增反應(yīng)”廣泛地包括針對(duì)核酸擴(kuò)增在變化溫度或恒溫下實(shí)施的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0075]如果核酸擴(kuò)增反應(yīng)包括溫度循環(huán)或加熱操作，可通過(guò)溫度調(diào)節(jié)單元3a執(zhí)行對(duì)反應(yīng)區(qū)域52中的樣品的加熱。此外，堿基序列分析裝置A1可被配置成使得通過(guò)溫度調(diào)節(jié)單元3a執(zhí)行的加熱或冷卻由控制單元4控制。
[0076]優(yōu)選的是，使用堿基序列分析裝置A1執(zhí)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)是不涉及溫度循環(huán)的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)。特別地優(yōu)選基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法實(shí)施的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。在LAMP方法中，由于存在大量的擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致核酸擴(kuò)增中涉及大量的堿基，所以容易進(jìn)行下述的渾濁度測(cè)量。
[0077]反應(yīng)區(qū)域52中的樣品(核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液)包括作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的擴(kuò)增靶的核酸鏈以及用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。具體地，這些試劑可為寡核苷酸引物(在下文中也簡(jiǎn)稱為“引物”)、核酸單體(dNTP)、酶、包含在反應(yīng)緩沖液中的成分等，該引物與作為擴(kuò)增靶的核酸鏈的至少部分堿基序列互補(bǔ)。此外，優(yōu)選用于下述熔解曲線分析的探針核酸鏈也被包括作為試劑。在根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析方法中，通過(guò)在用于熔解曲線分析的探針核酸鏈存在下進(jìn)行核`酸擴(kuò)增步驟SI的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，熔解曲線分析可在通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增核酸鏈的步驟之后立即開(kāi)始。
[0078]優(yōu)選探針核酸鏈的熔解溫度(Tm)低于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度。更優(yōu)選熔解溫度低于用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物的熔解溫度以使得在核酸擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中不會(huì)阻礙擴(kuò)增核酸鏈和雙鏈核酸的擴(kuò)增。特別優(yōu)選的是，探針核酸鏈的熔解溫度比引物的熔解溫度低5-15°C。探針核酸鏈的熔解溫度可通過(guò)在實(shí)際執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的條件下實(shí)施熔解曲線分析來(lái)實(shí)際測(cè)量。此外，可通過(guò)恰當(dāng)?shù)剡x擇已知的方法(例如，最近毗鄰法、華萊士法(Wallacemethod)、GC%方法等)計(jì)算熔解溫度。
[0079]在步驟SI中，堿基序列分析裝置A1的控制單元4選擇“核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式”作為驅(qū)動(dòng)模式。該“核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式”是其中堿基序列分析裝置A1中的每一結(jié)構(gòu)被控制在適于包含在反應(yīng)區(qū)域52中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中的核酸的擴(kuò)增的狀態(tài)的模式。具體地，在像堿基序列分析裝置A1的具有兩種類型的光源(第一光源11和第二光源12)的裝置中，驅(qū)動(dòng)以下將描述的渾濁度測(cè)量步驟S2中使用的第一光源11。此外，如果核酸擴(kuò)增反應(yīng)采用包括溫度循環(huán)的方法，控制單元4在“核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式”中通過(guò)驅(qū)動(dòng)溫度調(diào)節(jié)單元3a執(zhí)行期望的溫度。
[0080]( 2 )渾濁度測(cè)量步驟
[0081]在圖2中，參考符號(hào)S2表示測(cè)量核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度的渾濁度測(cè)量步驟。在此步驟中，通過(guò)測(cè)量反應(yīng)區(qū)域52中的核酸反應(yīng)溶液的渾濁度完成核酸是否已擴(kuò)增的確定，其中，核酸擴(kuò)增反應(yīng)已在核酸擴(kuò)增步驟SI中實(shí)施。
[0082]在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的堿基的實(shí)例包括從焦磷酸和能夠與其結(jié)合的金屬離產(chǎn)生的堿基。如果產(chǎn)生的這些堿基的量高于可溶解入核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的量，堿基沉淀并形成渾濁物質(zhì)。在根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析方法中，不特別地限制作為渾濁度測(cè)量對(duì)象的渾濁物質(zhì)，只要渾濁物質(zhì)是通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生并可被光學(xué)測(cè)量的即可。
[0083]渾濁度測(cè)量步驟S2可在核酸擴(kuò)增步驟SI開(kāi)始時(shí)同時(shí)開(kāi)始，或者可在從核酸擴(kuò)增步驟SI啟動(dòng)時(shí)起推移預(yù)定時(shí)期之后開(kāi)始。如果像在稱為實(shí)時(shí)PCR中哪樣，在核酸鏈擴(kuò)增過(guò)程中執(zhí)行渾濁度測(cè)量，優(yōu)選在核酸擴(kuò)增步驟SI啟動(dòng)的同時(shí)或之后立刻開(kāi)始渾濁度測(cè)量步驟S2。另一方面，在確定擴(kuò)增后核酸鏈?zhǔn)欠癜诤怂釘U(kuò)增反應(yīng)溶液的情況下，可在從核酸擴(kuò)增步驟SI啟動(dòng)時(shí)起推移預(yù)定時(shí)期之后開(kāi)始渾濁度測(cè)量步驟S2。
[0084]在渾濁度測(cè)量步驟S2中，控制單元4在預(yù)定時(shí)刻(timing)輸出來(lái)自第一光源11的用于渾池度測(cè)量的光U。從第一光源11輸出的光L1經(jīng)由光引導(dǎo)構(gòu)件131和聚光透鏡15照射在反應(yīng)區(qū)域52上。通過(guò)用光L1照射，在反應(yīng)區(qū)域52產(chǎn)生包括由在核酸擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的渾濁物質(zhì)產(chǎn)生的散射光或者通過(guò)反應(yīng)區(qū)域52的透射光的光Ln。光L11通過(guò)熒光濾波器17從而由檢測(cè)單元2檢測(cè)。應(yīng)注意，在渾濁度測(cè)量步驟S2中，可檢測(cè)在反應(yīng)區(qū)域52中產(chǎn)生的散射光，或者可檢測(cè)來(lái)自反應(yīng)區(qū)域52的透射光，或者其可檢測(cè)這二者。在根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿 基序列分析方法中，不特別地限制測(cè)量渾濁度的方法。
[0085]如圖2中所示，例如，由控制單元4控制的第一光源11的光L1的輸出可以預(yù)設(shè)間隔重復(fù)進(jìn)行直至核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度超過(guò)預(yù)先設(shè)置的渾濁度的預(yù)定值。在核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度超過(guò)此預(yù)定值的時(shí)間點(diǎn)，控制單元4開(kāi)始下文描述的熔解曲線分析步驟S3。
[0086]另一方面，如圖3中所示，控制單元4也可通過(guò)在核酸擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始后推移預(yù)定時(shí)期后輸出來(lái)自第一光源11的光L1測(cè)量核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度。在核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度超過(guò)預(yù)定值時(shí)，控制單元4開(kāi)始下文描述的熔解曲線分析步驟S3。如果核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度沒(méi)有超過(guò)預(yù)定值，控制單元4確定沒(méi)有獲得將用于熔解曲線分析的擴(kuò)增的核酸，因此結(jié)束堿基序列分析方法。
[0087](3熔解曲線分析步驟
[0088]在圖2中，參考符號(hào)S3表示熔解曲線分析步驟，其用于對(duì)位于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的探針核酸鏈和擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增后核酸鏈)執(zhí)行熔解曲線分析。優(yōu)選在核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度已經(jīng)達(dá)到預(yù)定值時(shí)執(zhí)行此步驟S3。在步驟S3中，通過(guò)將激發(fā)光L2照射在反應(yīng)區(qū)域52上以及測(cè)量從包含在核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光L21，執(zhí)行對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析。
[0089]控制單元4將驅(qū)動(dòng)模式從核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式切換至熔解曲線分析模式，并開(kāi)始熔解曲線分析步驟S3。優(yōu)選在基于從反應(yīng)區(qū)域52 (反應(yīng)場(chǎng)所)產(chǎn)生的光L11,核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度達(dá)到預(yù)定值時(shí)，由控制單元4執(zhí)行驅(qū)動(dòng)模式的切換。
[0090]該“熔解曲線分析模式”是一種其中由控制單元4基于從檢測(cè)單元2的信號(hào)輸入將堿基序列分析裝置A1的每一結(jié)構(gòu)控制在適于對(duì)包含在反應(yīng)區(qū)域52中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中的擴(kuò)增后核酸鏈和探針核酸鏈進(jìn)行熔解曲線分析的狀態(tài)的模式。具體地，在像堿基序列分析裝置A1的具有兩種類型的光源(第一光源11和第二光源12)的裝置中，將照射光輸出至反應(yīng)區(qū)域52的第一光源11從第一光源11 (第一光源)被切換至第二光源12 (第二光源)。應(yīng)注意，在步驟S3中，控制單元4也可控制輸出定時(shí)和功率(激發(fā)光的波長(zhǎng)、光量等)以及激發(fā)光L2的時(shí)間分割。此外，在步驟S3中，除光源外，控制單元4也驅(qū)動(dòng)溫度調(diào)節(jié)單元3a以使核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液處于期望的溫度。
[0091]熔解曲線分析步驟S3中使用的熒光物質(zhì)的實(shí)例包括通過(guò)結(jié)合至雙鏈核酸發(fā)射熒光的嵌入劑以及通過(guò)形成雙鏈產(chǎn)生熒光或使熒光消失的被標(biāo)記的探針核酸鏈。如果使用探針核酸鏈，基于利用熔解為單鏈核酸而增加或減少的熒光的強(qiáng)度可獲得熔解曲線?？墒褂玫耐ㄟ^(guò)形成雙鏈?zhǔn)テ錈晒獾奶结樅怂徭湹膶?shí)例包括能市場(chǎng)上可買到的Q探針(QProbe)。
[0092]在熔解曲線分析步驟S3中，可使用具有不同的堿基序列的多個(gè)探針核酸鏈。例如，通過(guò)設(shè)計(jì)具有不同的擴(kuò)增后核酸鏈的探針核酸鏈，具有多個(gè)擴(kuò)增后核酸鏈部分的堿基序列可通過(guò)執(zhí)行熔解曲線分析而被一次分析出。此外，在具有不同的堿基序列的多個(gè)探針核酸鏈中，一個(gè)探針核酸鏈可被設(shè)計(jì)成使得完全地匹配包含在擴(kuò)增產(chǎn)物中的一部分堿基序列。在使用為堿基序列未知的部分設(shè)計(jì)的探針核酸鏈的熔解曲線分析中，也可基于從完全與擴(kuò)增的一部分核酸鏈匹配的探針核酸鏈獲得的熔解曲線執(zhí)行熔解曲線分析。
[0093]當(dāng)在一個(gè)熔解曲線分析中使用具有不同的堿基序列的多個(gè)探針核酸鏈時(shí)，優(yōu)選標(biāo)記有發(fā)射各種不同的波長(zhǎng)的光的突光物質(zhì)。突光物質(zhì)的實(shí)例可包括突光素和異硫氰酸突光素(FITC)(它是熒光素的衍生物的一種)、羅丹明及其衍生、物以及BODIPY染料。
[0094]在熔解曲線分析步驟S3中， 當(dāng)使用標(biāo)記有熒光物質(zhì)的多種類型的探針核酸鏈時(shí)，優(yōu)選基于上述時(shí)間分割方式檢測(cè)各種突光物質(zhì)的強(qiáng)度。
[0095]在熔解曲線分析步驟S3中，首先，控制單元4將反應(yīng)區(qū)域52中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液冷卻至探針核酸鏈的熔解溫度以下的溫度。當(dāng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的溫度已經(jīng)冷卻至低于探針核酸鏈的熔解溫度之下時(shí)，探針核酸鏈雜交入擴(kuò)增產(chǎn)物并形成雙鏈。通常執(zhí)行從核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度(大約65°C )至約室溫~40°C的冷卻。
[0096]在冷卻樣品之前，可將擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增后核酸鏈)熱變性。一般通過(guò)加熱至大約90°C至100°C (優(yōu)選為大約95°C)執(zhí)行熱變性。擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈形成部分通過(guò)熱變性被部分地解離。如果探針核酸鏈為擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈形成部分而設(shè)計(jì)，通過(guò)在步驟S3開(kāi)始之前增加熱變性擴(kuò)增后核酸鏈的步驟，可將探針核酸鏈雜交入擴(kuò)增后核酸鏈的靶序列中。
[0097]隨后，為獲得熔解曲線，控制單元4驅(qū)動(dòng)溫度調(diào)節(jié)單元3a以加熱被冷卻的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液。此外，在加熱核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的同時(shí)，控制單元4開(kāi)始來(lái)自第二光源12的激發(fā)光L2的輸出。
[0098]在反應(yīng)區(qū)域52中處于雜交狀態(tài)的擴(kuò)增后核酸鏈和探針核酸鏈由于核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的溫度的增加熔解為單鏈核酸。用激發(fā)光L2照射核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中的熒光物質(zhì)從而發(fā)射熒光L21。熒光L21通過(guò)熒光濾波器17和聚光透鏡15并被檢測(cè)單元2檢測(cè)。在熔解曲線分析中，通常溫度從冷卻后的室溫(室溫~40°C)增加至大約90°C并且測(cè)量相對(duì)于溫度的改變的檢測(cè)出的熒光量的改變。
[0099]當(dāng)通過(guò)溫度調(diào)節(jié)單元3a加熱的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液達(dá)到大約90°C的預(yù)定溫度時(shí)，控制單元4停止來(lái)自第二光源12的光L2的輸出并且結(jié)束熔解曲線分析步驟S3。此外，伴隨激發(fā)光L2的停止,控制單元4也停止通過(guò)溫度調(diào)節(jié)單元3a對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的加熱。[0100]在根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A1中，通過(guò)在核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度達(dá)到預(yù)定值時(shí)從核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式切換至熔解曲線分析模式，控制單元4可連續(xù)地執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析。
[0101]此外，通過(guò)在擴(kuò)增后核酸鏈已經(jīng)達(dá)到預(yù)設(shè)的濃度之后切換所驅(qū)動(dòng)的光源，堿基序列分析裝置A1的控制單元4可在樣品被保持在與執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所相同的反應(yīng)場(chǎng)所的狀態(tài)下執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析，而不用增加其他步驟，例如確認(rèn)核酸鏈的存在。
[0102]此外，在使用堿基序列分析裝置A1執(zhí)行的堿基序列分析方法中，因?yàn)樘结樅怂徭湹娜劢鉁囟鹊陀诤怂釘U(kuò)增反應(yīng)中的熔解溫度，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的過(guò)程中，防止探針核酸鏈被雜交入擴(kuò)增靶核酸鏈中。因此，即使處于其中探針核酸鏈已經(jīng)被添加至核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的狀態(tài)中，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始之前可將用于熔解曲線分析的試劑引入反應(yīng)場(chǎng)所而不會(huì)阻礙核酸擴(kuò)增反應(yīng)，這簡(jiǎn)化了分析堿基序列的操作。
[0103]此外，在測(cè)量核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度的渾濁度測(cè)量步驟中，可以僅對(duì)其探針核酸鏈已被確定為已經(jīng)擴(kuò)增至具有適于熔解曲線分析的水平的樣本執(zhí)行熔解曲線分析。因此，基于根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析方法，提高了擴(kuò)增后核酸鏈的熔解曲線分析的準(zhǔn)確度。
[0104]3.根據(jù)本技術(shù)的第二實(shí)施方式的堿基序列分析裝置的配置
[0105]圖4是根據(jù)本技 術(shù)的第二實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A2的示意圖。除激發(fā)濾波器18和遮光結(jié)構(gòu)19a、19b、19c及19d之外，堿基序列分析裝置A2具有與本技術(shù)的第一實(shí)施方式具有相同的配置。與本技術(shù)的第一實(shí)施方式中相同的組成部分用相同的參考標(biāo)號(hào)表示，并且將在此省略其描述。
[0106](I)激發(fā)濾波器
[0107]堿基序列分析裝置A2包括激發(fā)濾波器18，其僅允許由第二光源12輸出的光L2中特定波長(zhǎng)的光通過(guò)。激發(fā)濾波器18優(yōu)選布置在第二光源12和反應(yīng)區(qū)域52之間。此外，優(yōu)選激發(fā)濾波器18將由第二光源12輸出的光L2轉(zhuǎn)換成可檢測(cè)到期望熒光的特定波長(zhǎng)的激發(fā)光。
[0108]如圖4中所示，在堿基序列分析裝置A2中，因?yàn)榧ぐl(fā)濾波器18沒(méi)有設(shè)置在用于渾濁度測(cè)量的從光源11輸出的光L1的光路上，光引導(dǎo)構(gòu)件132設(shè)置在反應(yīng)區(qū)域52和激發(fā)濾波器18之間。光引導(dǎo)構(gòu)件132包括光學(xué)入射端部132a。從第一光源11輸出的光入射在光學(xué)入射端部132a上。與本技術(shù)的第一實(shí)施方式相似，使入射光朝向反應(yīng)區(qū)域52的方向的構(gòu)件(如:棱鏡、反射板、凹凸部等)被設(shè)置在光引導(dǎo)構(gòu)件132中。由第二光源12輸出的光L2和由第一光源11輸出的光1^沿著它們重疊的光路傳遞，并到達(dá)反應(yīng)區(qū)域52。
[0109]應(yīng)注意，盡管兩種類型的光源(第一光源11和第二光源12)設(shè)置在根據(jù)本技術(shù)的第一實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A1中和根據(jù)本技術(shù)的第二實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A2中，但是設(shè)置在根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析裝置中的光源的數(shù)目可為一個(gè)。在這種情況下，在渾濁度測(cè)量步驟S2的適當(dāng)?shù)亩〞r(shí)，僅允許在適于渾濁度測(cè)量的波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的光通過(guò)的激發(fā)濾波器18可被布置在至反應(yīng)區(qū)的光路上，并且在熔解曲線分析步驟S3的適當(dāng)?shù)亩〞r(shí)，僅允許在適于熒光物質(zhì)的激發(fā)的波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的光通過(guò)的激發(fā)濾波器18可被布置在至反應(yīng)區(qū)的光路上。[0110](2)遮光結(jié)構(gòu)
[0111]堿基序列分析裝置A2包括限制從反應(yīng)區(qū)域52 (反應(yīng)場(chǎng)所)輸出的光L11及L21的前進(jìn)方向的遮光結(jié)構(gòu)19a及19b。此外，獨(dú)立于限制由反應(yīng)區(qū)域52輸出的光L11及L21的輸出方向的目的，遮光結(jié)構(gòu)19c及19d被設(shè)置為限制從光源(第一光源11和第二光源12)輸出的光L1和L2的前進(jìn)方向。也就是，在堿基序列分析裝置A2中，抑制來(lái)自鄰近的光學(xué)系統(tǒng)的雜散光的進(jìn)入的遮光結(jié)構(gòu)19a、19b、19c及19d被設(shè)置在光源(第一光源11和第二光源12)與檢測(cè)單元2之間的光路附近的多個(gè)位置。因?yàn)樵O(shè)置遮光結(jié)構(gòu)19&、1%、19(:及19(1抑制雜散光，所以提高使用堿基序列分析裝置A2執(zhí)行的分析的準(zhǔn)確度。
[0112]在圖4中示出的堿基序列分析裝置A2中，設(shè)置為與檢測(cè)單元2鄰近的遮光結(jié)構(gòu)19a和設(shè)置為與反應(yīng)區(qū)域52鄰近的遮光結(jié)構(gòu)19b限制由反應(yīng)區(qū)域52輸出的光L11及L21的前進(jìn)方向。另一方面，設(shè)置為與第二光源12鄰近的遮光結(jié)構(gòu)19d和設(shè)置為與反應(yīng)區(qū)域52鄰近的遮光結(jié)構(gòu)19c限制由光源(第一光源11及第二光源12)輸出的光L1及L2的前進(jìn)方向。在根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A2中，不特別地限制遮光結(jié)構(gòu)19a、19b、19c及19d的數(shù)目。遮光結(jié)構(gòu)可為從光源(第一光源11和第二光源12)或者反應(yīng)區(qū)域52中的任意一個(gè)輸出的光而設(shè)。然而，為提高使用堿基序列分析裝置A2執(zhí)行的分析的準(zhǔn)確度，優(yōu)選的是，遮光結(jié)構(gòu)19a、19b、19c及19d被設(shè)置在抑制從光源(第一光源11和第二光源12)和反應(yīng)區(qū)域52輸出的各束光的雜散光的位置。
[0113]優(yōu)選的是，遮光結(jié)構(gòu)19a、19b、19c及19d是具有預(yù)定厚度的板狀結(jié)構(gòu)。此外，如圖4中所示，如果遮光結(jié)構(gòu)19b、19c及19d被設(shè)置在形成反應(yīng)區(qū)域52的微芯片B1的基板51和51接觸的位置，遮光結(jié)構(gòu)也可用作溫度調(diào)節(jié)單元3b及3c的結(jié)構(gòu)。此外，遮光結(jié)構(gòu)19a、19b、19c及19d也可具有開(kāi)口部191a、191b、191c及191d。優(yōu)選提供對(duì)應(yīng)于光源(第一光源11和第二光源12)和檢測(cè)單元2之間的多個(gè)光路的位置的多個(gè)開(kāi)口部191a、191b、191c及191d。
[0114]例如，可通過(guò)使用光刻法蝕刻在不銹鋼、銅(Cu)、鎳(Ni)等的金屬膜上圖案形成(pattern-forming) 一個(gè)或者多個(gè)開(kāi)口部191a、191b、191c及19Id,制造出遮光結(jié)構(gòu)19a、19b、19c及19d。多個(gè)開(kāi)口部191a、191b、191c及191d優(yōu)選地被設(shè)置成與遮光結(jié)構(gòu)19a、19b、19c及19d的光源(第一光源11或第二光源12)或者反應(yīng)區(qū)域52相對(duì)。
[0115]在根據(jù)本實(shí)施方式的堿基序列分析裝置A2中，即使當(dāng)使用輸出各種波長(zhǎng)的混合波長(zhǎng)的普通的光源(如:氘燈、鎢絲燈、氙燈、汞燈、鹵素?zé)舻?時(shí)，在堿基序列分析裝置A2中包括的激發(fā)濾波器18僅允許具有適于激發(fā)熒光物質(zhì)的波長(zhǎng)的光照射反應(yīng)區(qū)域52。此外，如果上述第二光源12是激光源，取決于熒光物質(zhì)，可能難以獲得具有有效激發(fā)波長(zhǎng)的激光。然而，通過(guò)使用激發(fā)濾波器18，因?yàn)榭僧a(chǎn)生具有期望波長(zhǎng)的激發(fā)光，可以在大范圍內(nèi)選擇熒光物質(zhì)用于熔解曲線分析中。
[0116]此外，在堿基序 列分析裝置A2中，包含物遮光結(jié)構(gòu)19a、19b、19c及19d能夠抑制來(lái)自周圍光源和來(lái)自反應(yīng)區(qū)域的雜散光。因此，即使像微芯片B1中一樣存在多個(gè)相鄰的反應(yīng)區(qū)域52，在堿基序列分析方法中可實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確度的光檢測(cè)而無(wú)需通過(guò)時(shí)間分割來(lái)檢測(cè)來(lái)自各個(gè)反應(yīng)區(qū)域52的激發(fā)光。此外，可大幅減少檢測(cè)從多個(gè)反應(yīng)區(qū)域52輸出的光L11及光L21所需的時(shí)間。此外，本實(shí)施方式的其它配置和有利的效果與本技術(shù)的上述第一實(shí)施方式相同。[0117]4.根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析方法和堿基序列分析程序
[0118]根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析方法與由上述堿基序列分析裝置A1及A2中的控制單元4執(zhí)行的操作相對(duì)應(yīng)。此外，在堿基序列分析裝置A1及A2中的控制單元4包含執(zhí)行這些操作的堿基序列分析程序。
[0119]根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方式的堿基序列分析程序存儲(chǔ)在硬盤并且在CPU和OS的控制下讀入內(nèi)存以執(zhí)行上述分析操作。此外，可將堿基序列分析程序記錄在計(jì)算機(jī)可讀記錄介質(zhì)中。不特別地限制記錄介質(zhì)，只要其為計(jì)算機(jī)可讀記錄介質(zhì)。具體的實(shí)例可包括諸如軟盤和⑶-ROM的圓片型記錄介質(zhì)。此外，也可使用基于磁帶的介質(zhì),例如,磁帶。而且,可使用諸如:DSP (數(shù)字信號(hào)處理器)、ASIC (專用集成電路)、PLD (可編程邏輯電路)、FPGA (現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列)等硬件執(zhí)行一部分處理，以及與上述軟件程序結(jié)合執(zhí)行高速處理。
[0120]此外，本技術(shù)也可以如下方式配置。
[0121](I) 一種堿基序列分析方法，包括:
[0122]核酸擴(kuò)增步驟，通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0123]渾濁度測(cè)量步驟，測(cè)量該核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溶液的渾濁度；以及
[0124]熔解曲線分析步驟，對(duì)位于該核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所的探針核酸鏈和擴(kuò)增產(chǎn)物執(zhí)行熔解曲線分析。
[0125](2)根據(jù)(I)所述的堿基序列分析方法，其中，當(dāng)渾濁度已經(jīng)達(dá)到預(yù)定值時(shí)執(zhí)行熔解曲線分析步驟。
[0126](3)根據(jù)(I )或(2)所述的堿基序列分析方法，其中，探針核酸鏈的熔解溫度低于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度`，并且在探針核酸鏈存在下執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0127](4)根據(jù)(I )至(3)任一項(xiàng)所述的堿基序列分析方法，其中，探針核酸鏈的熔解溫度低于核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用的引物的熔解溫度。
[0128](5)根據(jù)(4)所述的堿基序列分析方法，其中，探針核酸鏈的熔解溫度比引物的熔解溫度低5 °C至15°C。
[0129](6)根據(jù)(I)至(5)任一項(xiàng)所述的堿基序列分析方法，其中，各自具有不同的堿基序列的多個(gè)探針核酸鏈被用作探針核酸鏈。
[0130](7)根據(jù)(6)所述的堿基序列分析方法，其中，各自具有不同的堿基序列的該多個(gè)探針核酸鏈各自被發(fā)射不同波長(zhǎng)的光的突光物質(zhì)標(biāo)記。
[0131](8)根據(jù)(6)或(7)所述的堿基序列分析方法，其中，在各自具有不同的堿基序列的多個(gè)探針核酸鏈中，一個(gè)探針核酸鏈完全地匹配包含在擴(kuò)增產(chǎn)物中的堿基序列的一部分。
[0132](9)根據(jù)(I )至(8)中的任一項(xiàng)所述的堿基序列分析方法，其中，核酸擴(kuò)增反應(yīng)是等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
[0133](10)根據(jù)(9)所述的堿基序列分析方法，其中，等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法執(zhí)行。
[0134](11) 一種堿基序列分析裝置，包括:
[0135]光源，被配置為將照射光輸出在反應(yīng)場(chǎng)所上；
[0136]檢測(cè)單元，被配置為檢測(cè)由于該照射光從在反應(yīng)場(chǎng)所內(nèi)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液產(chǎn)生的光；[0137]溫度調(diào)節(jié)單元，被配置為加熱或者冷卻反應(yīng)場(chǎng)所；以及
[0138]控制單元，被配置為基于來(lái)自檢測(cè)單元的信號(hào)輸入來(lái)切換光源的驅(qū)動(dòng)模式，
[0139]其中，控制單元被設(shè)置為將驅(qū)動(dòng)模式從核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式切換至熔解曲線分析模式。
[0140](12)根據(jù)(11)所述的堿基序列分析裝置，
[0141]其中，光源包括第一光源和第二光源，以及
[0142]其中，從第一光源輸出的光的波長(zhǎng)與從包含在被第二光源的光照射的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中的熒光物質(zhì)中產(chǎn)生的熒光的波長(zhǎng)區(qū)域匹配。
[0143]( 13)根據(jù)(12)所述的堿基序列分析裝置，其中，控制單元被配置為將照射光輸出至反應(yīng)場(chǎng)所的光源從第一光源切換至第二光源作為從核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式至溶解曲線分析模式的切換。
[0144](14)根據(jù)(12)或(13)所述的堿基序列分析裝置，進(jìn)一步包括:光引導(dǎo)構(gòu)件，被配置為將從第一光源輸出的光和從第二光源輸出的光引導(dǎo)至光路，在該光路兩個(gè)光束重疊。
[0145](15)根據(jù)(12)至(14)任一項(xiàng)所述的堿基序列分析裝置，其中，第二光源是一個(gè)或多個(gè)激光源和/或LED光源。
[0146](16)根據(jù)(12)至(15)中任一項(xiàng)所述的堿基序列分析裝置，其中，檢測(cè)單元以時(shí)間分割方式檢測(cè)由熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光。
[0147](17)根據(jù)(11)至(16)中任一項(xiàng)所述的堿基序列分析裝置，其中，堿基序列分析裝置設(shè)置有遮光結(jié)構(gòu)，該遮光結(jié)構(gòu)被配置為限制從光源和/或反應(yīng)場(chǎng)所輸出的光的前進(jìn)方向。
[0148](18)根據(jù)(17)所述的堿基序列分析裝置，其中，遮光結(jié)構(gòu)具有與在光源與檢測(cè)單元之間的多個(gè)光路的位置對(duì)應(yīng)的多個(gè)開(kāi)口部。
[0149]〈實(shí)驗(yàn)1>
[0150]1.核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度測(cè)量
[0151]通過(guò)在要用于熔解曲線分析的探針核酸鏈存在下執(zhí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)以及測(cè)量核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液的渾濁度來(lái)研究探針核酸鏈對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的影響。
[0152](材料和方法)
[0153]在本實(shí)驗(yàn)中，基于LAMP方法實(shí)施核酸擴(kuò)增反應(yīng)。將兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)的染色體組DNA用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增祀的模板核酸鏈。兩歧雙歧桿菌(NBRC N0.:100015)從國(guó)家技術(shù)評(píng)估研究所(National Institute ofTechnology and Evaluation,NITE)的生物資源中心(Biological Resource Center,NBRC)獲得。此外，表1中示出的五種類型的引物用于模板核酸鏈的擴(kuò)增。其中，引物FIP具有與模板核酸鏈的上游側(cè)上的堿基序列的一部分的22個(gè)堿基互補(bǔ)的序列，并且具有與在下游側(cè)上的模板核酸鏈的堿基序列的一部分的20個(gè)堿基同源的序列。此外，引物BIP具有與在上游側(cè)上的模板核酸鏈的堿基序列的一部分的21個(gè)堿基同源的序列，并且具有與在下游側(cè)上的模板核酸鏈的堿基序列的一部分的20個(gè)堿基互補(bǔ)的序列。在本實(shí)驗(yàn)中，為方便起見(jiàn)，在上游側(cè)上的引物FIP的22個(gè)堿基部分將以引物FIP (Flc)表示，并且在下游側(cè)的引物FIP的20個(gè)堿基部分將以引物FIP (F2)表示。類似地，在上游側(cè)上的引物BIP的21個(gè)堿基部分將以引物BIP (Fl)表示，并且在下游側(cè)的引物BIP的20個(gè)堿基部分將以引物BIP(B2c)表示。
[0154]每一個(gè)引物的Tm值如下。引物F3:64.2°C、引物B3:61.2°C、引物FIP (Flc):72.4°C、引物 FIP (F2):68.6°C、引物 BIP (Bl):71.1°C、引物 BIP (B2c):66.7°C及引物 LF:66.5°C。通過(guò)使用最近毗鄰法并且將鈉離子(Na+)濃度設(shè)置為50mM、F3及B3引物濃度均設(shè)置為0.25 μ M、FIP及BIP引物濃度均設(shè)置為0.2 μ M且LF引物濃度設(shè)置為I μ Μ，計(jì)算引物Tm值。對(duì)于引物FIP和引物ΒΙΡ，對(duì)上游側(cè)和下游側(cè)分別計(jì)算Tm值。這是因?yàn)長(zhǎng)AMP方法反應(yīng)機(jī)理中包含兩種狀態(tài):一種狀態(tài)是其中引物FIP或者引物BIP的上游側(cè)用核酸鏈退火，一種狀態(tài)是其中下游側(cè)用核酸鏈退火。
[0155]表1
[0156]
【權(quán)利要求】
1.一種堿基序列分析方法，包括: 核酸擴(kuò)增步驟，通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； 渾濁度測(cè)量步驟，測(cè)量所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溶液的渾濁度；以及 熔解曲線分析步驟，在所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所執(zhí)行探針核酸鏈和所述擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的堿基序列分析方法，其中，當(dāng)所述渾濁度已經(jīng)達(dá)到預(yù)定值時(shí)執(zhí)行所述熔解曲線分析步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的堿基序列分析方法，其中，所述探針核酸鏈具有比所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度低的熔解溫度，并且在所述探針核酸鏈存在下執(zhí)行所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的堿基序列分析方法，其中，所述探針核酸鏈具有比在所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用的引物的熔解溫度低的熔解溫度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的堿基序列分析方法，其中，所述探針核酸鏈具有比所述引物的熔解溫度低5°C至15 °C的熔解溫度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的堿基序列分析方法，其中，各自具有不同的堿基序列的多個(gè)探針核酸鏈被用作所述探針核酸鏈。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的堿基序列分析方法，其中，各自具有不同的堿基序列的所述多個(gè)探針核酸鏈各自標(biāo)記有發(fā)射不同波長(zhǎng)的光的突光物質(zhì)。`
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的堿基序列分析方法，其中，在各自具有不同的堿基序列的所述多個(gè)探針核酸鏈中，一個(gè)探針核酸鏈與包含在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中的堿基序列的一部分完全匹配。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的堿基序列分析方法，其中，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)是等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的堿基序列分析方法，其中，所述等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法來(lái)執(zhí)行。
11.一種堿基序列分析裝置，包括: 光源，被配置為將照射光輸出在反應(yīng)場(chǎng)所上； 檢測(cè)單元，被配置為檢測(cè)由于所述照射光而從在所述反應(yīng)場(chǎng)所中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液產(chǎn)生的光； 溫度調(diào)節(jié)單元，被配置為加熱或者冷卻所述反應(yīng)場(chǎng)所；以及 控制單元，被配置為基于所述檢測(cè)單元的信號(hào)輸入來(lái)切換所述光源的驅(qū)動(dòng)模式， 其中，所述控制單元被設(shè)置為將所述驅(qū)動(dòng)模式從核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式切換至熔解曲線分析模式。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的堿基序列分析裝置， 其中，所述光源包括第一光源和第二光源，以及 其中，從所述第一光源輸出的光的波長(zhǎng)與從被包含在利用來(lái)自所述第二光源的光照射的所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光的波長(zhǎng)區(qū)域匹配。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的堿基序列分析裝置，其中，所述控制單元被配置為將輸出所述照射光至所述反應(yīng)場(chǎng)所的所述光源從所述第一光源切換至所述第二光源作為從所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)模式至所述溶解曲線分析模式的切換。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的堿基序列分析裝置，進(jìn)一步包括:光引導(dǎo)構(gòu)件，被配置為將從所述第一光源輸出的光和從所述第二光源輸出的光引導(dǎo)至兩束光在其重疊的光路。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的堿基序列分析裝置，其中，所述第二光源是一個(gè)或多個(gè)的激光源和/或LED光源。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的堿基序列分析裝置，其中，所述檢測(cè)單元以時(shí)間分割方式檢測(cè)從所述熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的堿基序列分析裝置，其中，所述堿基序列分析裝置設(shè)置有遮光結(jié)構(gòu)，所述遮光結(jié)構(gòu)被配置為限制從所述光源和/或所述反應(yīng)場(chǎng)所輸出的光的前進(jìn)方向。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的堿基序列分析裝置，其中，所述遮光結(jié)構(gòu)具有與在所述光源與所述檢測(cè)單元之間的多個(gè)光路上的位置對(duì)應(yīng)的多個(gè)開(kāi)口部。
19.一種堿基序列分析程序，所述堿基序列分析程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟: 核酸擴(kuò)增步驟，通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； 渾濁度測(cè)量步驟， 測(cè)量所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溶液的渾濁度；以及 熔解曲線分析步驟，在所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)場(chǎng)所執(zhí)行探針核酸鏈和所述擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103773840SQ201310485308
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月23日
【發(fā)明者】中村友彥, 梶原淳志 申請(qǐng)人:索尼公司