用于高表達(dá)細(xì)胞株開發(fā)的載體的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種pSGS載體及其在高表達(dá)細(xì)胞株開發(fā)中的應(yīng)用。該載體的構(gòu)建首先基于新霉素抗性篩選基因NEO，通過聯(lián)合弱化篩選基因表達(dá)和增強目的基因表達(dá)的策略構(gòu)建表達(dá)載體pSNEO，鑒于GS系統(tǒng)的擴(kuò)增功能，設(shè)計引物用發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列與GS基因替換pSNEO載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列與NEO基因，得到篩選高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的通用載體pSGS。本發(fā)明構(gòu)建的pSGS載體可以方便快速的完成目的基因的穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建，為大分子重組蛋白的制備提供了新的工具。
【專利說明】用于高表達(dá)細(xì)胞株開發(fā)的載體的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及生物制藥基因工程表達(dá)技術(shù)，具體涉及一種用于高表達(dá)細(xì)胞株開發(fā)的載體的構(gòu)建及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)系統(tǒng)及高表達(dá)工程細(xì)胞株的獲得是基因工程藥物研究和生產(chǎn)的瓶頸，而表達(dá)載體和宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的兩個基本組成部分。目前用于制備基因工程藥物的表達(dá)系統(tǒng)包括以大腸桿菌為主要宿主細(xì)胞的原核表達(dá)系統(tǒng)和以酵母、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞為宿主的真核表達(dá)系統(tǒng)。
[0003]CHO表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，是為數(shù)不多的可進(jìn)行高密度懸浮培養(yǎng)的動物細(xì)胞之一。CHO細(xì)胞表達(dá)的外源基因產(chǎn)物與天然蛋白在結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式上幾乎相同，且能正確組裝成多亞基蛋白，并可大規(guī)模、高密度培養(yǎng)。但是該細(xì)胞系在表達(dá)外源基因時存在著培養(yǎng)成本高、周期長、表達(dá)量低等問題。因此，建立哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)系統(tǒng)包括高表達(dá)載體構(gòu)建、高表達(dá)工程細(xì)胞株的獲得、生物反應(yīng)器無血清高密度培養(yǎng)工藝以及目標(biāo)蛋白的分離純化工藝，是生物制藥工業(yè)研究和生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明就哺乳動物細(xì)胞高表達(dá)載體的構(gòu)建做了進(jìn)一步研究。
[0004]目的基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)受整合目的基因的染色體區(qū)域的狀態(tài)、目的基因的拷貝數(shù)及目的基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后加工修飾的效率影響。構(gòu)建一個高表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，應(yīng)從表達(dá)載體在染色體上整合位點的優(yōu)化、轉(zhuǎn)錄與翻譯效率的提高以及目的基因的拷貝數(shù)的增加等方面綜合考慮。
[0005]為了獲得高表達(dá)細(xì)胞株，一般都是通過將攜帶目的基因及篩選基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后隨機(jī)整合到基因組中實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)，通過篩選基因的篩選，得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。
[0006]常用的真核篩選基因有NEO基因、GS基因等。NEO基因是一種常用的獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選基因，編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動物細(xì)胞，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的選擇試劑。當(dāng)NEO基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動NEO基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。
[0007]目的基因的擴(kuò)增常采用目的基因和選擇標(biāo)記基因共擴(kuò)增的方法，如二氫葉酸還原酶(dhfr)和/或，谷氨酰胺合成酶(GS)是常用的擴(kuò)增基因。GS擴(kuò)增基因時一種顯性基因擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因。在無外源性谷氨酰胺的條件下，只有整合入外來GS基因的細(xì)胞才能生存并形成克隆。谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量時，利用細(xì)胞內(nèi)的氨和谷氨酰胺，在缺乏細(xì)胞外谷氨酰胺的培養(yǎng)下，加入谷氨酰胺合成酶的移植物(Methionine sulphoximine,MSX)，可使GS基因及與之相連的目的基因擴(kuò)增，達(dá)到提供目的基因表達(dá)水平的目的(Bebbington CR, Renner G,Thomson S,et al,Biotechnology.1992 ；10 (2):169:175.)?應(yīng)用GS基因擴(kuò)增系統(tǒng)通常只需1-2輪MSX加壓篩選，即可獲得高表達(dá)細(xì)胞株，可以避免多輪篩選來實現(xiàn)基因擴(kuò)增所導(dǎo)致的篩選壓力增加(Brown et al., Cytotechnology9:231-236)，并且在含有GS基因的細(xì)胞株中也可獲得有效的基因擴(kuò)增。另外，應(yīng)用GS基因擴(kuò)增系統(tǒng)可減少細(xì)胞產(chǎn)生的氨。因此，GS基因在構(gòu)建一種適用于哺乳動物細(xì)胞，尤其是CHO細(xì)胞的高效表達(dá)載體在工業(yè)生產(chǎn)中意義重大。
[0008]在細(xì)胞中表達(dá)水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細(xì)胞內(nèi)存在的反式作用因子之間的相互作用來實現(xiàn)。由于在特定的細(xì)胞內(nèi)，反式作用因子是固定的，不可改變的，因此基因的表達(dá)主要取決于其順式作用元件的作用。為了得到高表達(dá)細(xì)胞株，借助真核基因表達(dá)調(diào)控的理論，可將較強的順式作用元件集中到一個載體中，使其方便高效地表達(dá)目的基因。必須的順式作用元件包括:真核啟動子、增強子、加尾信號序列等，此外還包括一些特定的5'端非翻譯區(qū)或3'端非翻譯區(qū)。尤其是mRNA5'端非翻譯區(qū)的發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)是一類非常重要然而又常常受到忽視的瞬時作用元件。如果mRNA的翻譯起始密碼子ATG附近存在穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，從而影響到翻譯起始效率，尤其是那些非常穩(wěn)定的發(fā)卡的存在會完全抑制翻譯起始。同時也有報道表明，當(dāng)5'非翻譯區(qū)存在富含G-C配對的莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)時,翻譯起始復(fù)合體很難在體外組裝成功，從而影響翻譯的起始(PestovaTV, KolupaevaVG.The roles of individual eukaryotic translationinitiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection[J].Genes Dev.2002，16(22):2906-2922.)。
[0009]在真核表達(dá)載體中，常用的真核啟動子為巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)、猴空泡病毒 40 (Simian virus 40, SV40)啟動子、小鼠巨細(xì)胞病毒(Mouse cytomegalovirus,mCMV)啟動子等。有研究表明:在CHO細(xì)胞中，CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄活性分別是SV40啟動子和LTR(Rous肉瘤病毒基因)啟動子的10倍和30倍左右，在之前的研究中我們通過一個比較強的啟動子如CMV promoter來驅(qū)動目的基因的表達(dá)，和一個稍弱的啟動子如SV40 promoter來表達(dá)篩選基因，但是最后形成的克隆仍是很多，從成千上萬個轉(zhuǎn)染子中篩選高表達(dá)細(xì)胞系仍然是很困難的，通常需要耗費很長時間。
`[0010]選擇基因(如neo、dhfr)的弱化表達(dá),使大量整合在低表達(dá)整合位點的細(xì)胞由于選擇標(biāo)記基因表達(dá)量不夠而在選擇培養(yǎng)基條件下死亡，只有那些少量整合在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的細(xì)胞由于表達(dá)足夠的選擇基因產(chǎn)物而存活下來形成克隆。在弱化選擇基因的表達(dá)上，本領(lǐng)域的研究者做了很多嘗試:(I)通過基因突變來削弱篩選基因的功能(Sautter K, EnenkelB.Bioeng.2005 Mar 5; 89 (5): 530-8.); (2)通過改造起始密碼子鄰近的基因序列來弱化篩選基因的表達(dá)(Reff，US Patent N0.5，733，799，1998 ); (3)通過對起始密碼子本身進(jìn)行改造，使篩選基因的起始密碼子具有比較低的翻譯起始效率，之后連接的目的基因的起始密碼子為優(yōu)化的密碼子，從而提高目的基因的表達(dá)(Van Blokland et al.JBiotechnol.2007 Feb I; 128 (2):237-45)；。有文獻(xiàn)報道，刪除SV40啟動子中兩個重復(fù)72bp序列全部刪除，或在刪除一個72bp重復(fù)序列后，在剩余的一個72bp重復(fù)序列的第5_7位引入TGG-GTT突變，可使SV40啟動子轉(zhuǎn)錄活性分別降低為野生型的1/3、1/1000及1/36(JamesJ, Lucy CP, Patricia ED.Sciense.1994; 249:404-406)。通常情況下，經(jīng)過這樣嚴(yán)格的篩選，表達(dá)篩選基因低的細(xì)胞將會被更有效的殺死，表達(dá)篩選基因聞的細(xì)胞才能存活下來；同時形成的克隆會比較少，這些克隆一般會比較高水平的表達(dá)目的蛋白。
[0011]另外有文獻(xiàn)報道，刪除SV40啟動子中的一個72bp重復(fù)序列，或在刪除一個72bp重復(fù)序列后，在剩余的一個72bp重復(fù)序列的第5-7位引入TGG-GTT突變，或?qū)蓚€重復(fù)72bp序列全部刪除，可使SV40啟動子轉(zhuǎn)錄活性分別降低為野生型的1/3、1/36及1/1000(JamesJ, Lucy CP, Patricia ED.Sciense.1994;249:404-406)。
[0012]土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控兀件(Woodchuck Hepatitis Virus PosttranscriptionalRegulatory Element,WPRE)，一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，可以增強基因的表達(dá)水平(US 6284469 BI)。關(guān)于WPRE的報道主要集中在與病毒載體相關(guān)的基因治療。CN102618579A (2012.8.1)公開了HA-VP2基因重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建證實了添加調(diào)控元件WPRE可以提高桿狀病毒介導(dǎo)外源基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá)率。CN102533862A (2012.7.4)中發(fā)明人成功地構(gòu)建EGFP基因重組桿狀病毒表達(dá)載體，WPRE增強了外源基因的表達(dá)效率。同時有文獻(xiàn)報道WPRE可以提高蛋白的瞬時表達(dá)水平(Enhancement of recombinant antibody production in HEK 293E cells byWPRE.Biotechnology and Bioprocess Engineering.2009 October; Volume 14, Issue 5, pp633-638)。
[0013]基于以上思路，我們構(gòu)建了一種攜帶篩選基因的真核表達(dá)載體pSGS，篩選基因的啟動子是弱化后的SV40啟動子，同時在篩選基因翻譯起始位點前引入發(fā)卡結(jié)構(gòu)，共同的目標(biāo)是使轉(zhuǎn)染子的形成率大大降低，只有那種整合位點較好，高表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)染子才可以存活下來。同時加入轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件WPRE，利用該載體可以簡單快速的獲得目的基因的穩(wěn)定聞表達(dá)細(xì)胞株，為真核重組蛋白的表達(dá)提供了新的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明構(gòu)建了真核表達(dá)載體pSGS，該載體主要由篩選基因表達(dá)框與目的基因表達(dá)框組 成。
[0015]本發(fā)明的真核表達(dá)載體pSGS的篩選基因啟動子是弱化的SV40啟動子，即SV40'，可以降低篩選基因的轉(zhuǎn)錄水平；篩選基因翻譯起始位點前引入發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，該序列可以降低篩選基因的翻譯水平；目的基因表達(dá)框的多克隆位點與rabbit beta-globin polyA之間加入WPRE序列，該轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可以增強目的基因mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高目的基因的表達(dá)水平。
[0016]弱化的SV40啟動子和發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列可以確保本發(fā)明中的載體上的篩選基因的低水平表達(dá)，因而在該載體整合至宿主細(xì)胞的基因組之后，只有整合在適合外源基因高表達(dá)的“熱點”位置(hot-spot)的克隆才能存活，不僅能夠有效克服高表達(dá)克隆篩選過程的“位置效應(yīng)”(position effect)，而且減少了篩選過程中的低表達(dá)背景克隆。聯(lián)合WPRE序列，本發(fā)明將能夠有效提高構(gòu)建高表達(dá)細(xì)胞株的效率。
[0017]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明提供了一種真核表達(dá)載體，該載體是以PTSE載體為基礎(chǔ)改造獲得，包括表達(dá)弱化的篩選基因表達(dá)框和表達(dá)增強的目的基因表達(dá)框，被命名為pSGS。
[0018]所述的真核表達(dá)載體，表達(dá)弱化的篩選基因表達(dá)框依次含有弱化的SV40啟動子、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、篩選基因、SV40 polyA加尾信號；表達(dá)增強的目的基因表達(dá)框依次含有CMV啟動子，多克隆位點，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件WPRE和Rabbit beta-globin polyA加尾信號。[0019]所述的真核表達(dá)載體，所述的弱化的SV40啟動子核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述WPRE核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0020]所述的真核表達(dá)載體，篩選基因是谷氨酰胺合成酶基因GS。
[0021]本發(fā)明同時提供了基礎(chǔ)載體pTSE的構(gòu)建方法，具體步驟如下:
以 pTT 載體(Yves Durocher, Sylvie Perret and Amine Kamen , Nucleic AcidsResearch, 2002, Vol.30, N0.2 e9)為基礎(chǔ)，首先用 EcoRI 單切 pTT 載體，接著用 T4 DNApolymerase將產(chǎn)生的粘性末端補平，重新連接該載體，消除EcoRI酶切位點；接著將得到的載體用SalI單切,用T4 DNA polymerase將產(chǎn)生的粘性末端補平,重新連接該載體,消除SalI酶切位點,得到pTT'載體。合成含信號肽及多克隆位點的序列如下:5’ -aRtRtttaaacggagaattcgccgccaccATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTCTGGGTGCCCGGGTCGACCGGTGGCGCCAAGCTTGGATCCAGA-3’，下劃線部分分別為Pmel、EcoRI, BamHI位點，方框部分為信號肽序列，便于表達(dá)的外源蛋白分泌到胞外。PmeI及BamHI雙酶切該序列后定向克隆入pTT'載體的PmeI及BamHI之間，從而引入信號肽及多克隆位點(包括Sail、AgeI, KasI,HindIII及BamHI)，得到pTSE載體，結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0022]為了構(gòu)建pSGS載體，我們對pTSE載體進(jìn)行了改造。在目的基因表達(dá)框的多克隆位點與rabbit beta-globin polyA之間定向克隆入WPRE,得到表達(dá)載體pTSE_w,為了證明WPRE的功能，我們分別構(gòu)建了抗⑶22的人源化抗體hRFB4的輕鏈與重鏈基因表達(dá)載體 pTSE-hRFB4K 及 pTSE_hRFB4H、pTSE_hRFB4K_w 及 pTSE_hRFB4H_w，在相同的條件下轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞，比較它們的蛋白表達(dá)量，具體見實施例1。
[0023]接著在pTSE-w的基礎(chǔ)上，連接入SV40 ' -NE0_SV40polyA表達(dá)單元，在NEO基因翻譯起始位點ATG前引入可形成`發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列，如SEQ ID No:2所示，構(gòu)建成真核表達(dá)載體pSNEO。該SV4(V -NE0-SV40polyA表達(dá)單元來源于商業(yè)化的pcDNA3.1+載體(購自invitrogen),通過設(shè)計引物缺失突變SV40啟動子序列的第一個72bp重復(fù)序列及第二個72bp重復(fù)序列的前26個堿基，具體見實施例2。
[0024]鑒于GS系統(tǒng)的擴(kuò)增功能，設(shè)計引物用發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列與GS基因替換pSNEO載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列與NEO基因，得到篩選高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的通用載體pSGS，接著構(gòu)建了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4 (CTLA-4)與IgGl Fe的融合蛋白表達(dá)載體pSGS_CTLA4Fc及抗原癌基因人類表皮生長因子受體2即Her2的抗體antiHer2的表達(dá)載體pSGS_antiHer2，用于穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選，最后得到高表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，具體見實施例3。
[0025]本發(fā)明同時提供了所述真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，具體步驟如下:
(1)在目的基因表達(dá)框的多克隆位點與rabbitbeta-globin polyA之間定向克隆入WPRE,構(gòu)建含WPRE序列的表達(dá)載體，命名為pTSE-w ；
(2)由PcDNA3.1+ 制備篩選表達(dá)單位 SV40' -NE0-SV40polyA ；
(3)在NEO基因翻譯起始位點ATG前引入可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體命名為pSNEO ；
(4)用發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列和GS基因替換pSNEO載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列和NEO基因，所得載體即為pSGS載體。
[0026]本發(fā)明同時提供了所述的真核表達(dá)載體在單基因或雙基因表達(dá)中的應(yīng)用。[0027]本發(fā)明同時提供了所述的真核表達(dá)載體在制備哺乳動物細(xì)胞高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中的用途。
[0028]該載體不僅能實現(xiàn)蛋白在瞬時表達(dá)水平上的提升，而且能夠快速得到穩(wěn)定的高表達(dá)株，縮短了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的研發(fā)周期。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為pTSE質(zhì)粒圖譜。
[0030]圖2為pTSE-w質(zhì)粒圖譜。
[0031 ] 圖3為hRFB4抗體純化產(chǎn)物電泳圖。其中，泳道I代表pTSE_hRFB4K與pTSE-hRFB4H共轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞收獲的上清純化后的電泳圖，泳道2代表pTSE-hRFB4K_w與pTSE-hRFB4H-w共轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞收獲的上清純化后的電泳圖，marker指的是Themo的PageRuler Unstained Protein Ladder, 10_200KDa 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。[0032]圖4為發(fā)卡結(jié)構(gòu)示意圖。
[0033]圖5為pSNEO質(zhì)粒圖譜。
[0034]圖6為pSGS質(zhì)粒圖譜。
[0035]圖7 為 pSGS-CTLA4_Fc 質(zhì)粒圖譜。
[0036]圖8 為 pSGS_antiHer2 質(zhì)粒圖譜。
[0037]圖9為表達(dá)CTLA4-FC蛋白的20株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株表達(dá)示意圖。pcd指的是pg/cell/day。
[0038]圖10為表達(dá)antiHer2抗體的20株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株表達(dá)示意圖。
[0039]圖11為表達(dá)CTLA4-FC蛋白的6號與18號單克隆的穩(wěn)定性監(jiān)測示意圖。
[0040]圖12為表達(dá)antiHer2抗體的13號與16號單克隆的穩(wěn)定性監(jiān)測示意圖。
[0041]圖13為pSGS-CTLA4Fc_18克隆在懸浮培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)表達(dá)示意圖。
[0042]下面對所有質(zhì)粒圖譜中的縮寫標(biāo)注進(jìn)行解釋=Amp-R是氨芐青霉素抗性基因；PBR 322 ori是質(zhì)粒pBR322復(fù)制原點；PSV40'是弱化后的SV40早期啟動子；hairpin是可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列；GS是谷氨酰胺合成酶基因；ΝΕ0是新霉素抗性基因；SV40 polyA是SV40病毒蛋白表達(dá)的加尾信號序列；PCMV是人巨細(xì)胞病毒的啟動子；leader是信號肽序列；WPRE是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件；Rabbit beta-globin polyA是兔β球蛋白加尾信號序列；EBV ori是EBV病毒復(fù)制原點；CTLA4_Fc是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)與IgGl Fe的融合基因序列；antiHer2_L是antiHer2抗體的輕鏈序列；antiHer2-H是antiHer2抗體的重鏈序列。
[0043]【具體實施方式】:
下述實施例中所述實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)實驗方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0044]實施例1:pTSE-w載體的構(gòu)建及WPRE序列的有效性的驗證
1、pTSE-w載體的構(gòu)建:
WPRE序列如SEQ IN NO:3所示，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。設(shè)計PCR引物擴(kuò)增，然后用BamHI和B gill酶切，得目的片段。
[0045]Pl:5，-TAGGGATCCAATCAACCTCTGGA-3，P2:5， - TGTAGATCTCGAAGACGCGGAAGAGGCCG-3J
用BamHI線性化pTSE載體，并進(jìn)行去磷酸化，防止載體自連；因為BamHI及BglII為同尾酶，產(chǎn)生的粘性末端可以連接，最后挑取WPRE插入方向為正向的pTSE-w載體(我們規(guī)定與PCMV-MCS-RBGp0IyA相同的插入方向為正向)。此時保留原來多克隆位點的BamHI位點，WPRE序列連入后，下游的酶切位點消失。BamHI與BglII雙酶切的WPRE序列與BamHI線性化的PTSE載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒，測序得到正確的pTSE-w載體,如見圖2所示。
[0046]、WPRE序列的有效性的驗證:
通過構(gòu)建人源化的抗⑶22抗體的輕鏈與重鏈基因表達(dá)載體pTSE-hRFB4K及pTSE-hRFB4H、pTSE-hRFB4K-w 及 pTSE_hRFB4H_w 來驗證 WPRE 序列的有效性。
[0047]擴(kuò)增hRFB4重鏈(hRFB4H)所需的引物是P3與P4，擴(kuò)增hRFB4輕鏈(hRFB4K)所需的引物是P5與P6 ;以pGH-hRFB4K與pGH_hRFB4H質(zhì)粒(即CN 103214578A說明書第6頁第54段公開的含hRFB4輕鏈和重鏈基因的pCDNA3.1的載體，此處分別命名為pGH_hRFB4K和pGH-hRFB4H，由上海捷瑞生物工程有限公司全合成)為模板合成引物:
P3:5， -cggGtcGaccggTGAAGTGCAGCTGGT-3，
P4:5’ -GACGGATCCTCATTTACCCGGGGACAGGGA-3’
P5:5’ -cggGtcGaccggTGATATCCAGATGACCCAGAGC-3’
P6:5’ -GACGGATCCTAACACTCTCCCCTGTTGA-3’
P3與P5下劃線部分是SalI酶切 位點，P4與P6下劃線部分是BamHI酶切位點。SalI與BamHI雙酶切pTSE_w及pTSE載體，并雙酶切由PCR得到的hRFB4K及hRFB4H，分別進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化鑒定后得到正確的pTSE-hRFB4K、pTSE- hRFB4H、pTSE_ hRFB4K_w及pTSE- hRFB4H_w四種載體。
[0048]在完全平行的條件下，將pTSE- hRFB4K與pTSE- hRFB4H等量各取15ug共轉(zhuǎn)染30ml 293Ecell，pTSE- hRFB4K_w 及 pTSE- hRFB4H_w 等量各取 15ug 共轉(zhuǎn)染 30ml 293E 細(xì)胞，分別在3天后收獲上清，用Protein A進(jìn)行純化。pTSE- hRFB4K與pTSE- hRFB4H共轉(zhuǎn)染收獲的上清純化后得到的蛋白總量是1.lmg，pTSE- hRFB4K-w及pTSE- hRFB4H_w共轉(zhuǎn)染收獲的上清純化后得到的蛋白總量是2mg。
[0049]各取500ul收獲的上清加入IXPB (0.02M, pH7.0)平衡好的Protein A懸液，使Protein A與培養(yǎng)上清中的抗體充分結(jié)合,離心舍棄上清,在余下的Protein A介質(zhì)中加入50ul I X loading buffer,沸水煮3_5min。取出煮好的樣品,冷卻后再離心一下樣品,取上層澄清液體5ul，上樣于SDS-PAGE膠，電泳結(jié)果如圖3所示，結(jié)果證明pTSE載體連入WPRE序列后可以提聞蛋白的表達(dá)水平。
[0050]實施例2:pSNE0載體的構(gòu)建
我們以pTSE-w載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建用于篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的載體pSNEO，具體的構(gòu)建方法如下:以PcDNA3.1+質(zhì)粒(購自Invitrogen公司)為模板，合成引物序列如下(PNE0F-1與PNE0R-2合成5’端磷酸化引物):
PNE0F-1:5’ -GCAGGCAGAAGTATGCAAAG-3’
PNE0R-1:5’ -GATGTCTACTGCATCCTCGATGTGATCAGATCCGAAAAT-3’
PNE0F-2:5’ -AGGATGCAGTAGACATCCTCGATGATTGAACAAGATGGAT-3’PNEOR-2:5’ -GATATCGCTACATGTATACAGACATGATAAGATACATTGATG-3>
方框標(biāo)注部分為反向互補序列，下劃線部分分別是EcoRV與PciI酶切位點，PNEOF-1與PNEOR-1擴(kuò)增得到片段NEOl，PNE0F-2與PNE0R-2擴(kuò)增得到片段NE02，以PNE0F-1與PNE0R-2為引物，NEOl 與 NE02 為模板，重疊 PCR 得至Ij “SV40,啟動子-hairpin-NE0_SV40 polyA”單元,該單元的啟動子是缺失 5’ -CTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCA-3> 片段的弱化的啟動子，同時在翻譯起始位點ATG前引入序列5’ -CATCGAGGATGCAGTAGACATCCTCGATG-3’，該序列可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如圖4所示，影響篩選基因的翻譯起始；我們在該篩選單元的下游引入EcoRV與PciI酶切位點，便于構(gòu)建重鏈與輕鏈在一個載體的全抗體表達(dá)載體。PciI單切質(zhì)粒pTSE-w,然后用T4 DNA polymerase將產(chǎn)生的粘性末端補平,接著用CIP進(jìn)行去磷酸化，回收后連接pTSE-w和5’端磷酸化的篩選基因表達(dá)單元PCR產(chǎn)物，構(gòu)建質(zhì)粒pSNEO，如圖5所示，經(jīng)過鑒定測序挑取正向方向的克隆(我們規(guī)定與PCMV-MCS-Rabbitbeta-globin polyA相同的插入方向為正向，MCS指多克隆位點) 。
[0051]實施例三:pSGS載體的構(gòu)建及在細(xì)胞株構(gòu)建方面高效性的驗證 UpSGS載體的構(gòu)建
以pSNEO載體和pBT-NESP-Fc載體(CN101870735A，說明書第9頁86-88段所構(gòu)建的載體，含GS基因，委托上海捷瑞生物工程有限公司全合成)為模板，設(shè)計合成引物序列如下:PGSF-1:5’ -GAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAC -3’
PGSF-2:
5，-ATTTTCGGATCTGATCACATCGAGGATGCAGTAGACATCCTCGA
TGGCCACCTC AGCAAGTTC-3’
PGSR-1: 5’ -GTCTGTTCGAATTAGTTTTTGTATTGGAAGGGC-3>
其中下劃線部分分別為AvrII與BstBI的酶切位點，方框中為重疊序列；&PGSF_1、PGSF-2,PGSR-1為引物，以pBT-NESP-Fc質(zhì)粒為模板，將擴(kuò)增的PCR片段即含發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列的GS基因定向插入pSNEO載體的AvrII及BstBI酶切位點之間，將NEO基因替換為GS基因，啟動子與PSNEO載體啟動子一樣為弱化的啟動子，同時在GS基因翻譯起始位點前含發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列，經(jīng)過鑒定測序得到正確的PSGS載體，如圖6所示。
[0052]、pSGS載體在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建方面的驗證
為了驗證該基礎(chǔ)載體在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建方面的優(yōu)勢，我們以pSGS載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)與IgGl Fe的融合蛋白表達(dá)載體pSGS-CTLA4-Fc及抗原癌基因人類表皮生長因子受體2 (her2)的抗體antiHer2的表達(dá)載體 pSGS_antiHer2。
[0053]載體的構(gòu)建
以pGH-CTLA4Fc質(zhì)粒(US5851795中含SEQ IN NO:13氨基酸序列的載體，此處命名為pGH-CTLA4Fc，委托上海捷瑞生物工程有限公司全合成)為模板，設(shè)計并合成以下引物:PCTLA4F:5’ -ACTGTCGACCGGTGCAATGCACGTCGCGCAAC-3>
PCTLA4R:5’ -AGTGGATCCTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3>
其中下劃線部分分別為SalI及BamHI的酶切位點，將擴(kuò)增的CTLA4_Fc PCR片段定向插入pSGS載體的Sail及BamHI酶切位點之間，得到正確的pSGS-CTLA4_Fc質(zhì)粒，如圖7所
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[0054]載體的構(gòu)建
2.2.lpTSE-antiHer2L-w 的構(gòu)建
以 pBT-antiHer2 質(zhì)粒(US20090202546A1，2009年 8 月 13 日中公開的含 SEQ IN NO:13輕鏈和SEQ IN NO:14重鏈氨基酸序列的載體，此處命名為pBT_antiHer2，由上海捷瑞生物工程有限公司合成)為模板，設(shè)計并合成以下引物:
【權(quán)利要求】
1.一種真核表達(dá)載體，該載體是以PTSE載體為基礎(chǔ)改造獲得，其特征在于，該載體包括表達(dá)弱化的篩選基因表達(dá)框和表達(dá)增強的目的基因表達(dá)框，該載體被命名為PSGS。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體，其特征在于，表達(dá)弱化的篩選基因表達(dá)框依次含有弱化的SV40啟動子、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、篩選基因、SV40 polyA加尾信號；表達(dá)增強的目的基因表達(dá)框依次含有CMV啟動子，多克隆位點，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件WPRE和Rabbit beta-globinpoIyA加尾信號。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真核表達(dá)載體，其特征在于，所述的弱化的SV40啟動子核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述WPRE核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體，其特征在于，篩選基因是谷氨酰胺合成酶基因GS。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體，其特征在于，所述PTSE載體為如圖1所示的載體，其構(gòu)建步驟如下: (1)以pTT載體為基礎(chǔ)，消除EcoRI酶切位點和SalI酶切位點，所得載體命名為pTT'載體； (2)合成含信號肽及多克隆位點的序列，PmeI及BamHI雙酶切序列后定向克隆入pTT/載體的PmeI及BamHI之間，所述多克隆位點包括Sal1、Age1、Kas1、HindIII及BamHI，所得載體命名為PTS E載體。
6.構(gòu)建權(quán)利要求1所述真核表達(dá)載體的方法，具體步驟如下: (1)在目的基因表達(dá)框的多克隆位點與rabbitbeta-globin polyA之間定向克隆入WPRE,構(gòu)建含WPRE序列的表達(dá)載體，命名為pTSE-w ； (2)由PcDNA3.1+ 制備篩選表達(dá)單位 SV40' -NE0-SV40polyA ； (3)在NEO基因翻譯起始位點ATG前引入可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體命名為pSNEO ； (4)用發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列和GS基因替換pSNEO載體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列和NEO基因，所得載體即為pSGS載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的真核表達(dá)載體用于單基因或雙基因表達(dá)中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的真核表達(dá)載體用于構(gòu)建哺乳動物細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞株中的用途。
【文檔編號】C12N5/10GK103525867SQ201310486379
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】劉志剛, 孟艷敏, 王康, 高震, 郭晶晶, 彭博, 白先宏 申請人:北京東方百泰生物科技有限公司