一組環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶及其編碼基因和應用。該環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶，來自軟腐芽孢桿菌(Bacillus?macerans)。本發(fā)明將其基因序列進行了突變，得到了四種突變蛋白質。對上述突變蛋白質降解淀粉和生產環(huán)狀糊精的進行了比較研究。結果表明某些位點突變得到的環(huán)狀糊精葡萄糖轉移酶生產α-CD的專一性更高，生產效率更高，在工業(yè)生產上具有重大價值。
【專利說明】一組環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一組環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002]環(huán)狀糊精的英文為cyclodextrin，簡稱⑶。環(huán)糊精是環(huán)糊精轉葡萄糖基酶(CGTase)作用于淀粉的產物，是六個以上葡萄糖以α-1，4糖苷鍵連結的環(huán)狀寡聚糖，其中最常見、研究最多的是<1-環(huán)糊精((1-^)、0-環(huán)糊精(0_?)、Y _環(huán)糊精(Y -⑶)，分別由六個、七個和八個葡萄糖分子構成，是相對大和相對柔性的分子。
[0003]α -環(huán)狀糊精為淀粉深加工的一類高值化產品，由六個葡萄糖基通過α _1，4葡萄糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖。在結構上，α-⑶呈現(xiàn)出圓筒形(一端大，一端小)的立體結構，具有“外親水，內疏水”的特殊性質。憑借其特殊的立體結構，在功能上，使其可與多種客體化合物采用適當方法進行包結，從而改變被包結物質的溶解度、揮發(fā)性及化學反應性能等理化性質，再加之其安全無毒性，使其具有一些非常有用的功能。
[0004]α -⑶是一種有潛力的食品添加劑，特別是可以作為目前已經生產的β -環(huán)狀糊精(β_⑶)的替代產品。β_⑶已有大規(guī)模生產，但在使用過程中發(fā)現(xiàn)它有臟器沉積的風險，以及包結效率低下的問題。
[0005]概括起來，α -CD在食品工業(yè)有如下應用前景:(I)將水不溶性或溶解度低的化合物制成水溶解度高的包封化合物；(2)使包封的化合物具有良好的穩(wěn)定性(如保色、保香，耐熱、耐酸、耐水解、抗氧化、防揮發(fā)等)；(3)屏蔽作用(掩蓋食品中不愉快氣味和苦味)；(4)除去食品中不需要的成分(如咖啡因、膽固醇等)；(5)具有乳化、發(fā)泡作用，可作乳化劑和發(fā)泡劑；(6)使液體狀、油狀、揮發(fā)性物料固化。
`[0006]目前，α-⑶開發(fā)和應用的最大障礙是缺乏具有高α _環(huán)糊精轉化活力的酶制劑，使得該產品的成本和價格高出β -CD的三倍，限制了其大規(guī)模應用。
[0007]α -⑶的生成,主要是以淀粉為原料,經過環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶(cyclodextringlucano-transferase簡稱CGTases)的糖基轉化作用而來。CGTases的專一性較低，在大多數(shù)情況下同時產生Y-⑶三種產物。采用不同的CGTases產生的三種產物比例不同，現(xiàn)有的CGTases的主要轉化產物是β _⑶，同時也產生一定量的α-和Υ-⑶?，F(xiàn)有的研究方向主要是兩個方面:其一是從自然資源中尋求催化效果更好或專一性更高的酶；其二是對現(xiàn)有的酶蛋白進行定向改造從而獲得催化效果更好或專一性更高的酶。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一組環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶及其編碼基因和應用。
[0009]本發(fā)明提供的環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶，來自軟腐芽孢桿菌(Bacillus macerans),是將序列表的序列I所示蛋白質進行如下(a)、(b)、(C)和(d)四個突變得到的蛋白質:
[0010](a)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸[0011] (b)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，同時將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?br> [0012](c)將序列表的序列I自N末端第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，并且將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> [0013](d)將序列表的序列I自N末端第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，同時將第180位氨基酸殘基由甘氨酸突變?yōu)榱涟彼?，并且將?95位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> [0014]編碼所述蛋白質的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0015]所述基因具體可為將序列表的序列2所示蛋白質進行如下(e)、(f)、(g)和(h)四個突變得到的DNA分子:
[0016](e)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC
[0017](f)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，同時將第583-585位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA ；
[0018](g)將序列表的序列2自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，并且將第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。
[0019](h)將序列表的序列2自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，將538-540位核苷酸由GGG突變?yōu)镃TC，并且將第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。
[0020]含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0021]所述重組表達載體具體可為將所述基因插入載體pET_22b(+)的多克隆位點得到的重組質粒。所述重組表達載體具體可為將所述基因插入載體pET-22b (+)的BamHI和XhoI酶切位點之間得到的重組質粒。
[0022]所述重組菌具體可為將所述重組表達載體導入大腸桿菌得到的重組菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0023]本發(fā)明還保護所述蛋白質的應用，為如下(I )或(II)或(III):
[0024]( I )制備環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶；
[0025]( II )降解淀粉(如可溶性淀粉);
[0026](III)生產α-環(huán)狀糊精。
[0027]本發(fā)明提供的蛋白質，生產α -⑶的專一性更高，生產效率更高，在工業(yè)生產上具有重大價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為重組質粒甲的結構示意圖。
[0029]圖2為α -CD標準曲線。
[0030]圖3為β -CD標準曲線。
[0031 ] 圖4為Y -CD標準曲線【具體實施方式】
[0032]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值?？扇苄缘矸?北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司，批號:20070216。載體pET-22b(+):Novagen，產品目錄號為69744-3。大腸桿菌BL21 (DE3):北京全式金生物技術有限公司，產品目錄號為CD601-01。
[0033]TB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨12、酵母提取膏24、甘油4mL，蒸餾水定容。
[0034]實施例1、突變蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)
[0035]從自然界篩選到一株軟腐芽孢桿菌(Bacillus macerans)，可以生產環(huán)糊精糖基轉移酶，該菌株中的環(huán)糊精糖基轉移酶基因如序列表的序列2所不，編碼序列表的序列I所不的蛋白質。
[0036]將序列I所不蛋白質命名為ct-CGTase-1蛋白，將其編碼基因命名為a-CGTase-1基因(如序列2所不)。將序列3所不蛋白質命名為a-CGTase-WT蛋白(NCBI中公開的序列)，將其編碼基因命名為α _CGTase-WT基因(如序列4所不)。
[0037]序列I與序列3的差異僅在于第590位氨基酸殘基(Μ/V)和第677位氨基酸殘基(S/G)。序列2與序列4的差異僅在于第1768位核苷酸(Α/G)和第2029位核苷酸(Α/G)。
[0038]以序列表的序列1所示雙鏈DNA為模板，對167位氨基酸進行突變，得到一個突變體；對167和195位氨基酸同時進行定點突變，得到一個突變體；對89、167和195位氨基酸同時進行定點突變，得到一個突變體；對89、167、180和195位氨基酸同時進行突變，得到一個突變體。通過對突變體庫中各個基因表達的蛋白進行酶活鑒定，發(fā)現(xiàn)了一系列酶的產物專一性區(qū)別于序列I所示a-CGTase-WT蛋白的突變蛋白及其編碼基因。
[0039]實施例2、酶活鑒定
[0040]一、分別人工合成如下雙鏈DNA分子:
[0041](1)雙鏈DNA分子1:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?CACCACCAC ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸。雙鏈DNA分子I編碼的蛋白命名為蛋白I。
[0042](2)雙鏈DNA分子2:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，并將自5’末端第583-585位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA ;相應的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，并將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?。雙鏈DNA分子2編碼的蛋白命名為蛋白2。
[0043](3)雙鏈DNA分子3:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC,并將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC ;相應的將序列I中的第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，并將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?。雙鏈DNA分子3編碼的蛋白命名為蛋白3。[0044](4)雙鏈DNA分子4:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，并將自5’末端第538-540位核苷酸由GGG突變?yōu)镃TC，并將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC ;相應的將序列I中的第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，將第180位氨基酸殘基由甘氨酸突變?yōu)榱涟彼?，并將?95位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷ｋp鏈DNA分子3編碼的蛋白命名為蛋白3。
[0045](5)雙鏈DNA分子5:即序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0046](6)雙鏈DNA分子6:即序列表的序列4所不的雙鏈DNA分子。
[0047]二、重組質粒的構建(結構示意圖見圖1)
[0048]1、設計一對弓丨物，由S2和A3組成。
【權利要求】
1.將序列表的序列I所示蛋白質進行如下(a)、(b)、(c)和(d)四個突變得到的蛋白質: (a)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸； (b)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，同時將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼幔? (c)將序列表的序列I自N末端第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，并且將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷? Cd)將序列表的序列I自N末端第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，同時將第180位氨基酸殘基由甘氨酸突變?yōu)榱涟彼幔⑶覍⒌?95位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> 2.編碼權利要求1所述蛋白質的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因將序列表的序列2所示蛋白質進行如下(e)、(f)、(g)和(h)四個突變得到的DNA分子: Ce)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCACCf)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，同時將第583-585位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA ； (g)將序列表的序列2自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃A`CCACCAC，并且將第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。 (h)將序列表的序列2自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，將538-540位核苷酸由GGG突變?yōu)镃TC，并且將第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體為將所述基因插入載體pET-22b (+)的多克隆位點得到的重組質粒。
6.如權利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌是將權利要求7所述重組表達載體導入大腸桿菌得到的重組菌。
7.一種制備權利要求1所述蛋白質的方法，是培養(yǎng)權利要求4或6所述重組菌，得到權利要求I所述蛋白質。
8.權利要求1所述蛋白質的應用，為如下(I)或(II)或(III): (I )制備環(huán)狀糊精葡糖基轉移酶； (II)降解淀粉； (III)生產α-環(huán)狀糊精。
【文檔編號】C12N1/21GK103589697SQ201310488430
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權日:2013年10月17日
【發(fā)明者】孫艷, 岳洋 申請人:北京航空航天大學