一種催化活性提高的葡萄糖氧化酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種催化活性提高的葡萄糖氧化酶突變體，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用定點突變技術(shù)將黑曲霉Aspergillus?niger?BBE11721的葡萄糖氧化酶（GOD）基因進行定點突變并克隆連接到畢赤酵母表達載體pPIC9k，轉(zhuǎn)化Pichia?pastoris?GS115，經(jīng)純化驗證得到一株可以產(chǎn)具有較好催化活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母Pichia?pastoris?GS115-pPIC9k-GODTB，該菌株表達的葡萄糖氧化酶酶催化效率為41.52s-1mM-1，比野生型葡萄糖氧化酶提高了2.5倍。這為葡萄糖氧化酶的應用奠定了良好的基礎。
【專利說明】一種催化活性提高的葡萄糖氧化酶突變體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種催化活性提高的葡萄糖氧化酶突變體，屬于遺傳工程【技術(shù)領(lǐng)域】。【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖氧化酶(GOD)是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應用于血糖測定以來，GOD被廣泛應用于食品、飼料、醫(yī)藥等許多相關(guān)領(lǐng)域。
[0003]目前,許多國家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應用于各種食品和食品加工工藝中。GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量，指導生產(chǎn)。在醫(yī)藥工業(yè)中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發(fā)生。此外，由于可以催化生成H2O2，還可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導向目標的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)飼糧消化，促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進動物生長作用。
[0004]從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細菌GOD產(chǎn)酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS資格)和青霉屬菌株作為GOD生產(chǎn)菌。我國及美國均采用點青霉及產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)G0D,日本常用尼崎青霉,俄羅斯用生機青霉,近年報道膠霉屬(Clioctadium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和帚霉屬(Scopulariopsis)也能生產(chǎn)G0D。
[0005]產(chǎn)量低、酶活低 、檢測方法復雜是GOD產(chǎn)業(yè)化的限制性因素，國內(nèi)外為此做了大量工作并取得了明顯進展。目前國外生產(chǎn)的GOD廠家主要是德國的Boehringer和日本的TOYOBO0規(guī)模化生產(chǎn)高活性的GOD還有困難。發(fā)酵生產(chǎn)GOD的同時產(chǎn)生大量雜蛋白，分離提取復雜，成本聞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的第一個問題是提供一種催化活性提高的葡萄糖氧化酶(GOD)突變體，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]所述GOD突變體是以GenBank:X16061.1所示的序列為出發(fā)基因序列，通過定點突變獲得在第50位發(fā)生E (谷氨酸)一Y (酪氨酸)突變、第559位發(fā)生H (組氨酸)一T (蘇氨酸)突變的突變體。
[0008]產(chǎn)所述產(chǎn)葡萄糖氧化酶突變體的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細胞系也為本發(fā)明要求保護的范圍。
[0009]本發(fā)明要解決的第二個問題是提供一種構(gòu)建產(chǎn)所述葡萄糖氧化酶突變體的基因工程菌的構(gòu)建方法，具體包括如下步驟:
[0010]I)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼所述葡萄糖氧化酶突變體的基因GODTB ；[0011]2)將步驟I)獲得的GODTB基因連接到畢赤酵母表達載體，得到重組表達載體；
[0012]3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115得到基因工程菌。
[0013]所述表達載體選pPIC9k。
[0014]本發(fā)明要解決的另一個問題是提供一種應用上述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，是以構(gòu)建得到的產(chǎn)葡萄糖氧化酶基因工程菌為生產(chǎn)菌株，菌株在種子活化后接種到基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)；當(?值為1.2-1.5時，將菌株轉(zhuǎn)入誘導培養(yǎng)基中誘導蛋白的產(chǎn)生。誘導過程的甲醇濃度維持1.8%(W/V)，誘導葡萄糖氧化酶表達。[0015]所述誘導培養(yǎng)基組成為(1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g，pH6.0的IOOmM磷酸緩沖液。
[0016]所述種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g。
[0017]所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油IOmL, YNB13.4g, IOOmM 磷酸緩沖液(pH6.0)。
[0018]培養(yǎng)方法:將30°C、200rpm下培養(yǎng)到OD6tltl在1.6~1.7之間的種子以2%的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)；
[0019]本發(fā)明采用定點突變技術(shù)將黑曲霉Aspergillus niger BBE11721的葡萄糖氧化酶(GOD)基因進行定點突變，并克隆連接到畢赤酵母表達載體pPIC9k，改造催化活性位點增強與輔酶和底物的電子傳遞速率，轉(zhuǎn)化P.pastoris GSl 15，經(jīng)純化驗證得到一株可以產(chǎn)具有較好催化活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母P.pastoris GS115-pPIC9k-G0DTB，該菌株表達的葡萄糖氧化酶酶催化效率為41.528^1,比野生型葡萄糖氧化酶提高了 2.5倍。這為葡萄糖氧化酶的應用奠定了良好的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:目的基因的擴增；M:DL2, 000DNA Marker ;泳道I和泳道2:G0D基因的PCR擴
增條帶。
[0021]圖2:蛋白電泳(SDS-PAGE)實驗結(jié)果；M:蛋白質(zhì)分子量標準(Protein MolecularWeight Marker);泳道I和泳道2:G0D重組蛋白。
[0022]圖3:突變位點結(jié)構(gòu)模擬圖。
【具體實施方式】
[0023]實施例1催化活性提高的葡萄糖氧化酶
[0024]本發(fā)明的葡萄糖氧化酶是在在GenBank:X16061.1的基因序列基礎上，兩個位點發(fā)生氨基酸突變，具體為E50Y/H559T，可以通過化學全合成或定點突變的方式將兩個位點進行氨基酸的取代，所得的GOD突變體的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0025]實施例2產(chǎn)葡萄糖氧化酶基因工程菌的構(gòu)建及鑒定
[0026]構(gòu)建產(chǎn)葡萄糖氧化酶基因工程菌的步驟如下:
[0027]I)采用PCR方法或化學全合成方法獲得序列如GenBank:X16061.1所示的GOD基因。
[0028]2)將GOD基因連接到克隆載體pMD19-T，得到重組載體pMD19-T_G0D。[0029]3)定點突變兩個關(guān)鍵位點(E50Y，H559T) =PCR定點方法突變所用引物序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種催化活性提高的葡萄糖氧化酶突變體，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，是以GenBank:X16061.1所示的序列為出發(fā)基因序列，通過定點突變，將葡萄糖氧化酶第50位谷氨酸突變?yōu)槔野彼?、將?59位組氨酸突變?yōu)樘K氨酸。
3.編碼權(quán)利要求1所述葡萄糖氧化酶突變體的基因。
4.攜帶權(quán)利要求3所述基因的質(zhì)粒。
5.表達權(quán)利要求3所述基因的基因工程菌。
6.構(gòu)建權(quán)利要求5所述基因工程菌的方法，其特征在于，具體包括如下步驟: 1)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼所述氧化酶突變體的基因GODTB； 2)將步驟I)獲得的GODTB基因連接到畢赤酵母表達載體，得到重組表達載體: 3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115得到基因工程菌。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述表達載體為pPIC9k。
8.應用權(quán)利要求5所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶突變體的方法，其特征在于，將基因工程菌經(jīng)種子培養(yǎng)基活化后接種到基本發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)；當0D_值為1.2-1.5時，將菌株轉(zhuǎn)入誘導培養(yǎng)基中誘導蛋白的產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的 方法，其特征在于，所述誘導培養(yǎng)基組成為(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g，pH6.0的IOOmM磷酸緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，誘導過程甲醇濃度維持1.8%(W/V)。
【文檔編號】C12N15/53GK103525778SQ201310493241
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】陳堅, 顧磊, 張娟, 堵國成, 聞一凡, 劉曉筱 申請人:江南大學