April基因?qū)崟r(shí)熒光pcr檢測(cè)引物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種APRIL基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物，正向引物（SEQ?ID?NO.1）：5-GTGATTTAAGAGGACT-3；反向引物（SEQ?ID?NO.2）：5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3；和利用上述引物對(duì)APRIL基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明采用SYBR?Green?I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)APRIL基因進(jìn)行鑒定，具有檢測(cè)實(shí)時(shí)性和高效性，并可以對(duì)早期APRIL基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
【專利說明】APRIL基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及APRIL基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]一種誘導(dǎo)增殖配體(a proliferation inducing ligand, APRIL),和 BAFF(B-cel 1-activating factor)同屬于腫瘤壞死因子超家族成員，主要由DC,巨卩遼細(xì)胞,T和B細(xì)胞分泌。APRIL對(duì)免疫調(diào)節(jié)的功能定義的較少。最近研究表明APRIL可能作為初始B和T細(xì)胞的共刺激因子，誘導(dǎo)外周血B細(xì)胞產(chǎn)生IgM[G.Yu, T.Boone, J.Delaneyet al, NatImmunol, 2000, I (3):252-256; J.V.Stein, M.Lopez-Fraga, F.A., J Clin Invest, 2002, 109(12): 1587-1598]，影響胸腺依賴性B細(xì)胞應(yīng)答。與BAFF相同，APRIL促進(jìn)B細(xì)胞增殖和增加激活T細(xì)胞的數(shù)量。
[0003]APRIL不僅可以結(jié)合BAFF的共受體BCMA和TACI，然且APRIL可以結(jié)合獨(dú)自受體一硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPG)。APRIL可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞表達(dá)的HSPG，參與腫瘤的維持和生長(zhǎng)，利用肝素(Heparin)可以抑制APRIL與HSPG的結(jié)合，降低其對(duì)腫瘤的促生長(zhǎng)作用；在裸鼠注射ARPIL轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞比對(duì)照組增殖更加迅速，抑制APRIL對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。在原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primarybiliary cirrhosis, PBC)，一種自身免疫性肝病，病人BAFF和APRIL的血清濃度明顯增加[P.Rennert, P.Schneider, T.G.Cacheroet al., J Exp Med, 2000, 192 (11):1677_1684]。ARPIL也成為治療自身免疫性疾病和腫瘤的新興藥物靶點(diǎn)。
[0004]目前，在APRIL的檢測(cè)方法上，還是普遍采用抗體直接檢測(cè)定量技術(shù)；但是，對(duì)于目前病人的個(gè)性化治療和疾病發(fā)展檢測(cè)方面，這技術(shù)定性和定量周期較長(zhǎng)，花費(fèi)較大，不適合大范圍的使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的是提供一種APRIL基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)引物和試劑盒。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0007]APRIL基因PCR檢測(cè)的引物，
[0008]正向引物:5-GTGATTTAAGAGGACT-3；
[0009]反向引物:5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3；
[0010]利用引物對(duì)進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒:
[0011]試劑盒包括一種檢測(cè)溶液，其檢測(cè)溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物 10 μ M、反向引物 10 μ M、Rox Dye (50Χ )；
[0012]利用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的步驟如下:
[0013]I)提取待檢測(cè)樣品的RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA溶液。[0014]2)反應(yīng)體系:取2ul步驟I)中所得的DNA溶液，并與上述試劑盒中的檢測(cè)溶液14ul進(jìn)行混合，并加入無菌超純水至反應(yīng)體積20ul ;加入到實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)管中，進(jìn)行離心；
[0015]3)將步驟2)的反應(yīng)體系按照下述條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè):
[0016]預(yù)變性950C /100s，I 次循環(huán)；變性 95°C /30s，延伸 66°C /120s, 40 次循環(huán)。
[0017]本發(fā)明采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)APRIL基因進(jìn)行鑒定，具有檢測(cè)實(shí)時(shí)性和高效性，并可以對(duì)早期APRIL基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，針對(duì)APRIL基因表達(dá)的胞外區(qū)RNA為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)早期APRIL分泌形式的基因表達(dá)，用于早期判斷自身免疫性疾病，另外可以對(duì)病人進(jìn)行個(gè)性診斷和治療過程中，APRIL的基因表達(dá)情況的檢測(cè)，并判斷自身免疫性疾病病人復(fù)發(fā)和加重病情的可能性及其對(duì)于腫瘤患者中APRIL標(biāo)的相關(guān)性。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是實(shí)施例1的檢測(cè)樣品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)曲線；
[0019]圖2是實(shí)施例1的檢測(cè)樣品和對(duì)照實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)比較圖；
[0020]圖3是實(shí)施例2的檢測(cè)樣品和對(duì)照進(jìn)行ELISA驗(yàn)證比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 根據(jù)實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明申請(qǐng)做進(jìn)一步的說明。
[0022]設(shè)計(jì)APRIL基因PCR檢測(cè)的引物，根據(jù)編碼APRIL的胞外區(qū)cDNA進(jìn)行設(shè)計(jì)
[0023]正向引物:5-GTGATTTAAGAGGACT-3
[0024]反向引物:5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3；
[0025]另外試劑盒包括一種檢測(cè)溶液，其檢測(cè)溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物 10 μ M、反向引物 10 μ Μ, Rox Dye (50X)；
[0026]實(shí)施例1
[0027]I)離心待檢測(cè)樣品和陰性對(duì)照血液，提取下層血細(xì)胞的RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA溶液，低溫保存?zhèn)溆茫黄渲袡z測(cè)樣品取自系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人血液(1、2、3)和原發(fā)性膽汁性肝硬化病人血液(4);正常人血清(5、6)作為陰性對(duì)照。
[0028]2)反應(yīng)體系:取2ul步驟I)中所得的DNA溶液，并與上述試劑盒中的檢測(cè)溶液14ul進(jìn)行混合，并加入無菌超純水至反應(yīng)體積20ul ;加入到實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)管中，進(jìn)行離心；同時(shí)以無菌水作為空白對(duì)照
[0029]3)將步驟2)的反應(yīng)體系按照下述條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè):
[0030]預(yù)變性950C /100s，I 次循環(huán)；變性 95°C /30s，延伸 66°C /120s, 40 次循環(huán)。
[0031]附圖1為本實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線，其中1-3為系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人樣品，4為原發(fā)性膽汁性肝硬化病人樣品；5、6為陰性對(duì)照。其中樣品I和3曲線分別高于2和4，樣品2的曲線高于樣品3 ;并表現(xiàn)出良好的特異性。
[0032]附圖2為進(jìn)行檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品的曲線熒光進(jìn)行比較；樣品1-4明顯高于陰性對(duì)照;其中***，為P〈0.01。
[0033]實(shí)施例2
[0034]利用ELISA進(jìn)行對(duì)檢測(cè)樣品中血清APRIL的濃度，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)所得OD值進(jìn)行分析；及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果相符性；所用的APRIL抗體購(gòu)自為Santa Cruz公司，貨號(hào)為 APRIL (F-5)。
[0035]ELISA的檢測(cè)結(jié)果與利 用實(shí)時(shí)熒光PCR所得出的APRIL表達(dá)趨勢(shì)相符。
【權(quán)利要求】
1.APRIL基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物，其特征是: 正向引物(SEQ ID N0.1):5-GTGATTTAAGAGGACT-3 反向引物(SEQ ID N0.2):5-TGGAGAGGGTGCGAAC-3o
2.APRIL基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒，其特征是: 試劑盒包括一種檢測(cè)溶液，其檢測(cè)溶液含有含SYBR Premix Ex Taq(2X)、正向引物10 μ M、反向引物 10 μ M、Rox Dye (50Χ )； 上述正反引物如權(quán)利要求1所述。
3.APRIL基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是，具體步驟是: 1)提取待檢測(cè)樣品和陰性對(duì)照的RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA溶液； 2)反應(yīng)體系:取2ul步驟I)中所得的DNA溶液，并與權(quán)利要求2所述的試劑盒中的檢測(cè)溶液14ul進(jìn)行混合，并加入無菌超純水至反應(yīng)體積20ul ;加入到實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)管中，進(jìn)?Τ尚心; 3)將步驟2)的反應(yīng)體系按照下述條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè): 預(yù)變性950C /100s，I次循`環(huán)；變性950C /30s，延伸66°C /120s, 40次循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103484559SQ201310493575
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】于惠, 李艷麗, 管淑紅 申請(qǐng)人:于惠