一種用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿及其制備方法。該樣本小皿包括底板和玻璃蓋板，底板與蓋板之間連接并形成一個(gè)以上的腔室，每個(gè)腔室靠近底板的一面開有與外界連通的進(jìn)口與出口，內(nèi)腔的玻璃蓋板表面上非特異性吸附有生物素化的牛血清蛋白，生物素化的牛血清蛋白上特異性結(jié)合有親和素，親和素上特異性結(jié)合在生物素化的寡核苷酸的一端，生物素化的寡核苷酸的另一端上標(biāo)記有Cy5熒光分子。使用這種樣本小皿，結(jié)合熒光倒置顯微鏡，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸單分子的定量檢測(cè)。
【專利說明】—種用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及ー種樣本小皿，特別是涉及ー種用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]基因芯片MiCToarray技術(shù)將大量探針分子固定干支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。通俗地說，就是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)、乃至百萬計(jì)的特定序列的DNA片段，有規(guī)律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列。但是傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)無法定量檢測(cè)，也無法觀察單個(gè)核酸分子的構(gòu)象變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿及其制備方法。該樣本小皿包括底板和玻璃蓋板，底板與蓋板之間連接并形成ー個(gè)以上的腔室，每個(gè)腔室靠近底板的一面開有與外界連通的進(jìn)ロ與出口。該樣本小皿的制備方法為:取實(shí)驗(yàn)室常用的載玻片作為底板，在載玻片上鉆兩個(gè)小孔作為進(jìn)口和出ロ，井清洗干凈，取兩段雙面膠粘貼于載玻片上，雙面膠間留有狹縫，進(jìn)口和出口位于狹縫之間，再將實(shí)驗(yàn)室常用的干凈的蓋玻片作為蓋板貼于雙面膠另一面，形成ー個(gè)通道，用環(huán)氧基樹脂將通道的兩端封ロ，從而形成樣本小皿。
[0004]本發(fā)明進(jìn)一歩限定的技術(shù)方案是:
[0005]前述的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿，其腔室的形狀為長(zhǎng)方形，進(jìn)ロ與出口設(shè)置在長(zhǎng)方形相互遠(yuǎn)離的兩端。
[0006]前述的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿，其長(zhǎng)方形腔室的寬為4至6毫米，長(zhǎng)方形腔室的高為0.1至0.2毫米，長(zhǎng)方形腔室的長(zhǎng)為10至30毫米。
[0007]前述的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿，內(nèi)腔的玻璃蓋板表面上非特異性吸附有生物素化的牛血清蛋白，生物素化的牛血清蛋白上特異性結(jié)合有親和素，親和素上特異性結(jié)合在生物素化的寡核苷酸的一端，生物素化的寡核苷酸的另一端上標(biāo)記有Cy5熒光分子。
[0008]進(jìn)ー步的，前述的樣本小皿的制備方法，包括以下制備步驟:
[0009]步驟1:將溶解于緩沖液T50的生物素化的牛血清蛋白注入小皿的內(nèi)腔中，靜置4至6分鐘；
[0010]步驟2:往內(nèi)腔中注入緩沖液T50，將沒有非特異性吸附于內(nèi)腔中的生物素化的牛血清蛋白洗脫；
[0011]步驟3:將溶于緩沖液T50的親和素注入內(nèi)腔中，靜置I分鐘；
[0012]步驟4:往內(nèi)腔中注入緩沖液T50，將沒有特異性結(jié)合于生物素化的牛血清蛋白上的親和素洗脫；
[0013]步驟5:注入一端標(biāo)記有Cy5熒光分子的生物素化的的寡核苷酸到內(nèi)腔中，使其與親和素特異性結(jié)合。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:(I)本發(fā)明的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿具備多個(gè)腔室，一個(gè)樣本小皿支持多組實(shí)驗(yàn)；(2)本發(fā)明的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿容易制備，利用實(shí)驗(yàn)室環(huán)境資源即可制得；(3)本發(fā)明的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿可以結(jié)合熒光倒置顯微鏡，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子的定量檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿的宏觀結(jié)構(gòu)爆炸圖
[0016]圖2為本發(fā)明的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿的宏觀結(jié)裝配炸圖
[0017]圖3為本發(fā)明的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿內(nèi)腔玻璃表面微觀結(jié)構(gòu)圖a
[0018]圖4為本發(fā)明的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿內(nèi)腔玻璃表面微觀結(jié)構(gòu)圖b
[0019]圖5為本發(fā)明的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿內(nèi)腔玻璃表面微觀結(jié)構(gòu)圖c
[0020]圖6為本發(fā)明的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿內(nèi)腔玻璃表面微觀結(jié)構(gòu)圖d
[0021]載玻片1，蓋玻片2，內(nèi)腔3，進(jìn)ロ 4，出口 5，小管6，雙面膠7，生物素化的牛血清蛋白8，親和素9，生物素化的寡核苷酸10，Cy5熒光分子11，寡核苷酸12，Cy3染料分子13，待測(cè)樣本核苷酸14
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1
[0023]本實(shí)施例提供了一種在 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下易于制作的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿及其制備方法。結(jié)合圖1和圖2，首先在載玻片I上鉆兩個(gè)直徑在0.6至I毫米的孔，作為樣本小皿的進(jìn)ロ 4和出口 5，溶液最終都是通過進(jìn)ロ 4和出口 5流進(jìn)和流出的。進(jìn)ロ 4和出ロ 5是相對(duì)的，取決于從哪個(gè)孔注入液體。
[0024]接著對(duì)載玻片I和蓋玻片2進(jìn)行清洗。一種優(yōu)選的清洗方案為:先于10%的Alconox清洗劑中超聲清洗20min,再于水中超聲清洗5min,再于丙酮中超聲清洗15min,然后于lmol/L的KOH中超聲清洗20min，最后用去離子水漂洗載玻片I。清洗完畢后還可選擇性的使用丙烷噴槍燃燒成像面，目的是為了去除殘余的熒光有機(jī)分子。
[0025]接著對(duì)載玻片I和蓋玻片2進(jìn)行組裝，取兩段雙面膠7粘貼于干凈的載玻片I上，雙面膠7間留有4至6毫米的狹縫，進(jìn)ロ 4和出口 5位于狹縫之間，再將干凈的蓋玻片2貼于雙面膠7另一面，形成ー個(gè)通道，用環(huán)氧基樹脂將通道的兩端封ロ，從而形成樣本小皿的內(nèi)腔。載玻片I的出口 5上還可以用環(huán)氧基樹脂粘合一個(gè)小管6，小管6的作用是便于內(nèi)腔3中的液體導(dǎo)出。
[0026]接著要在內(nèi)腔中形成被生物素化的牛血清蛋白8包被的表面。結(jié)合圖3至圖5，一種優(yōu)選的方案為:首先制備lmg/ml的溶解于緩沖液T50中的生物素化的牛血清蛋白8，并注入小皿的內(nèi)腔中，放置4-6min，生物素化的牛血清蛋白8會(huì)非特異性的吸附于內(nèi)腔表面；接著往內(nèi)腔中流入100 ill緩沖液T50，將沒有非特異性吸附于內(nèi)腔中的生物素化的牛血清蛋白8洗脫；接著將0.2mg/ml的溶于緩沖液T50中的親和素9注入內(nèi)腔中，靜置I分鐘；接著往內(nèi)腔中流入100 ill緩沖液T50，將沒有特異性結(jié)合于生物素化的牛血清蛋白8上的親和素9洗脫；最后將30 Ul被Cy5熒光分子11標(biāo)記的生物素化的寡核苷酸10注入到內(nèi)腔中，生物素化的寡核苷酸10會(huì)與親和素9特異性結(jié)合。
[0027]使用時(shí)，用全內(nèi)反射顯微鏡對(duì)樣本小皿進(jìn)行觀察，并用532nm的激光激發(fā)成像面。此時(shí)Cy5熒光分子11并不會(huì)被激發(fā)發(fā)光。再從進(jìn)ロ 4中注入溶于緩沖液T50的被Cy3熒光分子標(biāo)記的寡核苷酸和待測(cè)樣本核苷酸。被Cy5突光分子11標(biāo)記的生物素化的寡核苷酸10、被Cy3熒光分子13標(biāo)記的寡核苷酸12和待測(cè)樣本核苷酸三者之間的關(guān)系為:Cy5熒光分子11標(biāo)記的生物素化的寡核苷酸10與被Cy3熒光分子13標(biāo)記的寡核苷酸12都與待測(cè)樣本核苷酸14互補(bǔ)，如圖6所示。所以當(dāng)三者相結(jié)合后，Cy3熒光分子13會(huì)被532nm激光激發(fā)發(fā)光，所發(fā)射的熒光會(huì)進(jìn)ー步激發(fā)Cy5熒光分子11發(fā)光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)寡核苷酸的檢測(cè)。
[0028]這種樣本小皿實(shí)驗(yàn)室可以現(xiàn)做現(xiàn)用，使用以后將其放入瓶裝水中一段時(shí)間即可移走雙面膠7和環(huán)氧樹脂，從而可以重復(fù)使用。
【權(quán)利要求】
1.一種用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿，其特征在于:包括底板和玻璃蓋板，底板與蓋板之間連接并形成ー個(gè)以上的腔室，每個(gè)腔室靠近底板的一面開有與外界連通的進(jìn)ロ與出口。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿，其特征在于:腔室的形狀為長(zhǎng)方形，進(jìn)ロ與出口設(shè)置在長(zhǎng)方形相互遠(yuǎn)離的兩端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿，其特征在于:長(zhǎng)方形的寬為4至6毫米，長(zhǎng)方形的高為0.1至0.2毫米，長(zhǎng)方形的長(zhǎng)為10至30毫米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的用于核酸單分子檢測(cè)的樣本小皿，其特征在于:內(nèi)腔的玻璃蓋板表面上非特異性吸附有生物素化的牛血清蛋白，生物素化的牛血清蛋白上特異性結(jié)合有親和素，親和素上特異性結(jié)合在生物素化的寡核苷酸的一端，生物素化的寡核苷酸的另一端上標(biāo)記有Cy5突光分子。
5.—種樣本小皿的制備方法,其特征在于:取實(shí)驗(yàn)室常用的載玻片作為底板，在載玻片上鉆兩個(gè)小孔作為進(jìn)口和出口，井清洗干凈，取兩段雙面膠粘貼于載玻片上，雙面膠間留有狹縫，進(jìn)口和出口位于狹縫之間，再將實(shí)驗(yàn)室常用的干凈的蓋玻片作為蓋板貼于雙面膠另一面，形成ー個(gè)通道，用環(huán)氧基樹脂將通道的兩端封ロ，從而形成樣本小皿。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的樣本小皿的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟1:將溶解于緩沖液T50的生物素化的牛血清蛋白注入小皿的內(nèi)腔中，靜置4至6分鐘； 步驟2:往內(nèi)腔中注入緩沖 液T50，將沒有非特異性吸附于內(nèi)腔中的生物素化的牛血清蛋白洗脫； 步驟3:將溶于緩沖液T50的親和素注入內(nèi)腔中，靜置I分鐘； 步驟4:往內(nèi)腔中注入緩沖液T50，將沒有特異性結(jié)合于生物素化的牛血清蛋白上的親和素洗脫； 步驟5:注入一端標(biāo)記有Cy5熒光分子的生物素化的的寡核苷酸到內(nèi)腔中，使其與親和素特異性結(jié)合。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK103555568SQ201310495121
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】劉斐, 趙琳, 單衍可, 徐明飛 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)