一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法。本發(fā)明利用鮟鱇魚皮作為原料，先用酸液抽提出膠原蛋白，然后經(jīng)過鹽析和透析提純，再后在超聲波條件下使用胃蛋白酶和風味蛋白酶分步水解魚皮膠原蛋白，最后經(jīng)過脫芳脫色，離心分離后冷凍干燥得到富羥脯氨酸膠原蛋白肽。本發(fā)明有效利用了鮟鱇魚皮的下腳料，通過水解鮟鱇魚皮制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽，不僅利用了從鮟鱇魚皮中提取的膠原蛋白肽的高營養(yǎng)價值，還解決了鮟鱇魚皮下腳料污染環(huán)境，造成資源浪費的問題。本發(fā)明提供給了一種富羥脯氨酸膠原蛋白肽的制備方法，不僅可以運用于魚皮原料，還可以運用于其他原料，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及魚膠原蛋白肽制備領(lǐng)域，尤其是涉及一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鮫錬魚是廣泛分布于我國東部海域(東海北部、黃海及渤海)的冷溫性底層魚類。近年來隨著我國鮫錬魚加工量不斷增長，在加工過程中剩余了大量魚皮等下腳料，即污染了環(huán)境又造成資源的浪費。相關(guān)人員對從鮫錬魚加工副產(chǎn)物中的硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、膠原蛋白等活性物質(zhì)做了相關(guān)研究。人們發(fā)現(xiàn)，通過水解鮫錬魚的膠原蛋白制備成膠原蛋白肽，能夠顯著提高其營養(yǎng)價值和消化。其膠原蛋白肽能最大程度地發(fā)揮出膠原的各種功能，具有保護胃粘膜、抗?jié)冏饔?、抗過敏、降血壓、降膽固醇、抗衰老、促進傷口愈合、增強骨強度和預防骨質(zhì)疏松、預防關(guān)節(jié)炎、促進角膜上皮創(chuàng)傷的修復和促進角膜上皮細胞的生長等營養(yǎng)及生理功能。 [0003]羥脯氨酸(Hyp)是膠原蛋白肽的特征氨基酸，在其他蛋白質(zhì)中很少見。文獻證明膠原蛋白肽中主要成分脯氨酸-輕脯氨酸(Pro-Hyp)可促進皮膚前衛(wèi)細胞生長(Agric.FoodChem.2009, 57,444-449)和改善關(guān)節(jié)炎癥狀(Osteoarthri tis and Cartilage, 17 (12),1620-1627)。膠原蛋白肽中羥脯氨酸含量和原料來源有關(guān)。但是同一來源中，主要取決于制備方法。因此膠原蛋白肽制備過程中最大限度地提取、保留羥脯氨酸至關(guān)重要。但是目前文獻中報道的各種來源的膠原蛋白肽中的羥脯氨酸含量基本都不超過10%。如吉林大學學報自然科學學報，2001，16-108文獻中報道的鹿皮膠原的提取與性質(zhì)一文中，采用酸法和酶法從東北特產(chǎn)梅花鹿鹿皮中提取膠原蛋白，制備得到的鹿皮膠原肽中羥脯氨酸含量僅為8.6%。
[0004]而今研究發(fā)現(xiàn)，在鮫錬魚皮中，通過IS03496:1978 (E)方法對其進行氨基酸含量檢測，發(fā)現(xiàn)鮫錬魚皮內(nèi)羥脯氨酸含量較高，是一種極富有提取價值的原料。而現(xiàn)有技術(shù)中制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法尚未發(fā)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有鮫錬魚皮廢料尚未有效利用的問題，同時解決現(xiàn)有技術(shù)中缺少制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽方法的問題，提供了一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，所述制備方法包括以下步驟:
(1)選取鮫錬魚皮清洗，剪碎成片狀，然后放入稀堿液中磁力攪拌24~30h，取出后水洗至中性；
(2)加入正丁醇溶液，攪拌20~28h后取出，用水洗滌并浙干；
(3)將浙干的魚皮搗碎，加入稀酸溶液，加熱到55~90°C，經(jīng)5~7h攪拌抽提，過濾后得到膠原蛋白粗提液；
(4)在膠原蛋白粗提液中加入0.8~lmol/L的NaCl溶液鹽析20~24h，然后用蒸餾水透析2~3天,得到膠原蛋白沉淀物；
(5)將膠原蛋白沉淀物溶于所述稀酸溶液中，以膠原蛋白沉淀物和稀酸溶液總質(zhì)量計，加入1%~2%的胃蛋白酶，酶解5~6 h ;
(6)然后調(diào)pH到6.5~7.5，以膠原蛋白沉淀物和稀酸溶液總質(zhì)量計，加入0.1%~0.2%的風味蛋白酶，酶解6~7 h ；
(7)得到的酶解液進行滅酶、過濾，在濾液中加入活性炭脫芳脫色，然后離心分離除去活性炭，清液冷凍干燥，制得富羥脯氨酸膠原蛋白肽。
[0007]作為優(yōu)選，步驟(5)中膠原蛋白沉淀物和稀酸溶液的料液比為1:10~1:25。
[0008]作為優(yōu)選，所述稀酸溶液為1%~4%的醋酸溶液或檸檬酸溶液。
[0009]作為優(yōu)選，將步驟(3)中的膠原蛋白粗提液放入絕緣袋，進行高壓脈沖電場處理0.5 ~Ih0
[0010]作為優(yōu)選，高壓脈沖電場處理的脈沖時間為ls，脈沖頻率為30~40Hz，電場強度為 15 ~25kV/cm。
[0011]作為優(yōu)選，步驟(5)和步驟(6)的酶解過程中使用超聲波輔助酶解。
[0012]作為優(yōu)選，超聲波頻率為25~40 kHz，功率為100~400 W。
[0013]作為優(yōu)選，胃蛋白酶的酶比活力為3000~3500U/g，胃蛋白酶酶解溫度為34~37°C
[0014]作為優(yōu)選，風味蛋白酶的酶比活力為40000~50000 U/g，風味蛋白酶酶解溫度為40 ~55°C。
[0015]作為優(yōu)選，步驟(1)稀堿液為2.5%~5.5%的NaOH溶液。
[0016]本發(fā)明制備方法中，先對鮫錬魚皮做除雜處理。首先堿洗去除雜蛋白，然后用正丁醇溶液去除脂肪。提高膠原蛋白的純度，減少其他物質(zhì)進入后續(xù)工序，提高制得的膠原蛋白肽的純度。然后進行酶解，酶解前用酸液抽提，剝離魚皮中的膠原蛋白，使其溶解在酸液中。
[0017]本發(fā)明應(yīng)用高壓脈沖電場輔助，其原理是高壓脈沖電場可以在瞬間使細胞壁和細胞膜電位混亂，改變其通透性，并可以擊破細胞壁和細胞膜，使它們發(fā)生不可逆破壞，造成細胞新陳代謝紊亂、細胞生長的必須組分流出，從而有助于對膠原蛋白的提取。同時此法對膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)不會造成破壞，能保持其包括色、味在內(nèi)的基本性質(zhì)。
[0018]本發(fā)明利用NaCl溶液鹽析和蒸餾水透析對膠原蛋白粗提液進行提純，提高制得膠原蛋白肽的純度。
[0019]本發(fā)明采用雙酶分步水解的方法:和單酶酶解相比，胃蛋白酶和風味蛋白酶作用于肽鍵的切割位點不同，胃蛋白酶是為了以切掉芳香族氨基酸，風味蛋白酶能夠?qū)δz原蛋白進行內(nèi)切和外切，以除去苦味和保證釋放寡肽。兩者相互協(xié)同作用膠原蛋白，切斷每條肽鏈內(nèi)的連接使分子量減小，并將羥脯氨酸充分暴露。和多種酶共同酶解相比，分步酶解更有利于提高酶解效率，因為不同的酶的酶解環(huán)境，如PH、溫度等都會對酶解產(chǎn)生影響。為加強酶解效果，選取酶比活力為3000~3500U/g的胃蛋白酶，首次酶解溫度為34~37°C ;然后選取酶比活力為40000~50000 U/g的風味蛋白酶，二次酶解溫度為40~55°C。
[0020]采用雙酶分步水解使得水解分布進行，避免了共同酶解可能對膠原蛋白中原有的羥脯氨酸造成破壞，又使得肽鏈中的羥脯氨酸充分暴露，因此可制備得到富羥脯氨酸含量的膠原蛋白肽。
[0021]本發(fā)明中在酶解過程，輔助使用超聲波，超聲波可以起到乳化效應(yīng)，能使雙酶和膠原蛋白之間均勻的充分的混合和接觸，可以提高膠原蛋白肽的提取率，所以也相對地提高了羥脯氨酸的提取率。
[0022]同時，本發(fā)明對胃蛋白酶酶解時的胃蛋白酶加入量，料液比，酶解溫度，酶解時間進行了優(yōu)化。選取胃蛋白酶加入量:1%~2%;料液比:1:10~1:25 ;酶解溫度:34~37°C;酶解時間:5~6 h，提高羥脯氨酸的提取率。
[0023]有益效果:本發(fā)明有效利用了鮫錬魚皮的下腳料，通過水解鮫錬魚皮制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽，不僅利用了從鮫錬魚皮中提取的富羥脯氨酸膠原蛋白肽的高營養(yǎng)和醫(yī)用價值，還解決了鮫錬魚皮下腳料污染環(huán)境，造成資源浪費的問題。本發(fā)明提供給了一種富羥脯氨酸膠原蛋白肽的制備方法，不僅可以運用于魚皮原料，還可以運用于其他原料，具有良好的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步的描述。
[0025]實施例1
取洗凈后的鮫錬魚皮1000 g，用剪刀剪切成長寬為2 cmX2 cm左右的碎片。在鮫錬魚皮碎片中加入25L質(zhì)量分數(shù)為4.5% NaOH溶液，浸泡24 h后取出，然后用水洗滌至pH為中性。再在魚皮中加入35 L 9%的正丁醇溶液，攪拌28 h后取出，用水洗滌并浙干。將已浙干的鮫錬魚皮碎片搗碎，加入60L質(zhì)量分數(shù)為4%的檸檬酸溶液，加熱至55°C，并不斷攪拌抽提6 h，過濾后得到膠原蛋白粗提液。然后膠原蛋白粗提液放入絕緣袋，進行高壓脈沖電場處理0.5h。設(shè)置高壓脈沖電場處理的脈沖時間為Is,脈沖頻率為30Hz,電場強度為25kV/cm。取出后，在膠原蛋白粗提液中加入0.8mol/L的NaCl溶液鹽析20h，然后用蒸餾水透析2天，得到膠原蛋白沉淀物。然后將膠原蛋白沉淀物溶于檸檬酸溶液中，設(shè)置膠原蛋白沉淀物和檸檬酸溶液的料液比為1:10，以膠原蛋白沉淀物和檸檬酸溶液總質(zhì)量計，加入1%胃蛋白酶，胃蛋白酶的酶比活力為3000U/g，在超聲波頻率為40 kHz，功率為400 W,溫度為34°C下進行酶解5h ;然后用6mol/L的NaOH溶液和6mol/L的HCl溶液調(diào)首次酶解后的反應(yīng)液pH為6.5，加入0.15%的風味蛋白酶，風味蛋白酶的酶比活力為40000U/g，在同樣的超聲波條件下設(shè)置溫度為50°C進行二次酶解6 h。對所得的酶解液加熱至95°C，并保持7 min滅酶，過濾雜質(zhì)，所得濾液中加入活性碳，并在40°C攪拌I h后離心分離除去活性炭，清液冷凍干燥，制得富羥脯氨酸膠原蛋白肽133.26g。通過IS03496:1978 (E)方法對制備得到的膠原蛋白肽進行氨基酸含量檢測，測定羥脯氨酸含量。結(jié)果見表1。
[0026]實施例2
取洗凈后的鮫錬魚皮1000 g，用剪刀剪切成長寬為2 cmX2 cm左右的碎片。在鮫錬魚皮碎片中加入25L質(zhì)量分數(shù)為2.5% NaOH溶液，浸泡30 h后取出，然后用水洗滌至pH為中性。再在魚皮中加入35 L 9%的正丁醇溶液，攪拌20 h后取出，用水洗滌并浙干。將已浙干的鮫錬魚皮碎片搗碎，加入60L質(zhì)量分數(shù)為1%的醋酸溶液，加熱至65°C，并不斷攪拌抽提7 h，過濾后得到膠原蛋白粗提液。然后膠原蛋白粗提液放入絕緣袋，進行高壓脈沖電場處理0.5h。設(shè)置高壓脈沖電場處理的脈沖時間為ls，脈沖頻率為40Hz，電場強度為15kV/cm。取出后，在膠原蛋白粗提液中加入0.9mol/L的NaCl溶液鹽析24h，然后用蒸餾水透析3天，得到膠原蛋白沉淀物。然后將膠原蛋白沉淀物溶于醋酸溶液中，設(shè)置膠原蛋白沉淀物和醋酸溶液的料液比為1:25，以膠原蛋白沉淀物和醋酸溶液總質(zhì)量計，加入2%胃蛋白酶，胃蛋白酶的酶比活力為3500U/g，在超聲波頻率為25 kHz，功率為100 W，溫度為36°C下進行酶解6h ;然后用6mol/L的NaOH溶液和6mol/L的HCl溶液調(diào)首次酶解后的反應(yīng)液pH為
7.5，加入0.2%的風味蛋白酶，風味蛋白酶的酶比活力為50000U/g，在同樣的超聲波條件下設(shè)置溫度為40°C進行二次酶解7 h。對所得的酶解液加熱至95°C，并保持7 min滅酶，過濾雜質(zhì)，所得濾液中加入活性碳，并在40°C攪拌I h后離心分離除去活性炭，清液冷凍干燥，制得富羥脯氨酸膠原蛋白肽134.64g。通過IS03496:1978(E)方法對制備得到的膠原蛋白肽進行氨基酸含量檢測，測定羥脯氨酸含量。結(jié)果見表1。
[0027]實施例3
取洗凈后的鮫錬魚皮1000 g，用剪刀剪切成長寬為2 cmX2 cm左右的碎片。在鮫錬魚皮碎片中加入25L質(zhì)量分數(shù)為5.5% NaOH溶液，浸泡248 h后取出，然后用水洗滌至pH為中性。再在魚皮中加入35 L 9%的正丁醇溶液，攪拌25 h后取出，用水洗滌并浙干。將已浙干的鮫錬魚皮碎片搗碎，加入60L質(zhì)量分數(shù)為2%的檸檬酸溶液，加熱至90°C，并不斷攪拌抽提5 h，過濾后得到膠原蛋白粗提液。然后膠原蛋白粗提液放入絕緣袋，進行高壓脈沖電場處理0.5h。設(shè)置高壓脈沖電場處理的脈沖時間為Is,脈沖頻率為35Hz,電場強度為20kV/cm。取出后，在膠原蛋白粗提液中加入lmol/L的NaCl溶液鹽析22h，然后用蒸餾水透析2天，得到膠原蛋白沉淀物。然后將膠原蛋白沉淀物溶于檸檬酸溶液中，設(shè)置膠原蛋白沉淀物和檸檬酸溶液的料液比為1:15，以膠原蛋白沉淀物和檸檬酸溶液總質(zhì)量計，加入
1.5%胃蛋白酶，胃蛋白酶的酶比活力為3200U/g，在超聲波頻率為35 kHz，功率為300 W，溫度為37°C下進行酶解5.5h ;然后用6mol/L的NaOH溶液和6mol/L的HCl溶液調(diào)首次酶解后的反應(yīng)液pH為7，加入0.1%的風味蛋白酶，風味蛋白酶的酶比活力為45000U/g，在同樣的超聲波條件下設(shè)置溫度為55°C進行二次酶解6.5 h。對所得的酶解液加熱至95°C，并保持7 min滅酶，過濾雜質(zhì)，所得濾液中加入活性碳，并在40°C攪拌I h后離心分離除去活性炭，清液冷凍干燥，制得富羥脯氨酸膠原蛋白肽128.65g。通過IS03496:1978 (E)方法對制備得到的膠原蛋白肽進行氨基酸含量檢測，測定羥脯氨酸含量。結(jié)果見表1。
[0028]對比例I
和實施例1的不同之處在于，膠原蛋白粗提液未施加高壓脈沖電場處理，兩次酶解過程中均未施加超聲波條件。結(jié)果見表1。
[0029]對比例2
和實施例2的不同之處在于，膠原蛋白粗提液未施加高壓脈沖電場處理，兩次酶解過程中均未施加超聲波條件。結(jié)果見表1。
【權(quán)利要求】
1.一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: (1)選取鮫錬魚皮清洗，剪碎成片狀，然后放入稀堿液中磁力攪拌24~30h，取出后水洗至中性； (2)加入正丁醇溶液，攪拌20~28h后取出，用水洗滌并浙干； (3)將浙干的魚皮搗碎，加入稀酸溶液，加熱到55~90°C，經(jīng)5~7h攪拌抽提，過濾后得到膠原蛋白粗提液； (4)在膠原蛋白粗提液中加入0.8~lmol/L的NaCl溶液鹽析20~24h，然后用蒸餾水透析2~3天,得到膠原蛋白沉淀物； (5)將膠原蛋白沉淀物溶于所述稀酸溶液中，以膠原蛋白沉淀物和稀酸溶液總質(zhì)量計，加入1%~2%的胃蛋白酶，酶解5~6 h ； (6)然后調(diào)pH到6.5~7.5，以膠原蛋白沉淀物和稀酸溶液總質(zhì)量計，加入0.1%~0.2%的風味蛋白酶，酶解6~7h; (7)得到的酶解液進行滅酶、過濾，在濾液中加入活性炭脫芳脫色，然后離心分離除去活性炭，清液冷凍干燥，制得富羥脯氨酸膠原蛋白肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，步驟(5)中膠原蛋白沉淀物和稀酸溶液的料液比為1:10~1:25。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述稀酸溶液為1%~4%的醋酸溶液或檸檬酸溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，將步驟(3)中的膠原蛋白粗提液放入絕緣袋，進行高壓脈沖電場處理0.5~lh。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，高壓脈沖電場處理的脈沖時間為ls，脈沖頻率為30~40Hz，電場強度為15~25kV/cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，步驟(5)和步驟(6)的酶解過程中使用超聲波輔助酶解。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，超聲波頻率為25~40kHz，功率為100~400W。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，胃蛋白酶的酶比活力為3000~3500U/g，胃蛋白酶酶解溫度為34~37°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，風味蛋白酶的酶比活力為40000~50000 U/g，風味蛋白酶酶解溫度為40~55°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備富羥脯氨酸膠原蛋白肽的方法，其特征在于，步驟(I)稀堿液為2.5%~5.5%的NaOH溶液。
【文檔編號】C12P21/06GK103627761SQ201310495140
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】楊會成, 李八方, 鄭斌, 馬華威 申請人:浙江省海洋開發(fā)研究院